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.2000年4月15日；14(8):981-93.

利用寡核苷酸阵列分析p53调节基因的表达模式

R赵 1, K吉什, M墨菲, 尹勇, D诺特曼, W H霍夫曼, E汤姆, D H麦克, A J莱文
附属公司

利用寡核苷酸阵列分析p53调节基因的表达模式

R赵等。 基因开发. .

摘要

寡核苷酸微阵列用于定量p53转录因子调控的大量基因的mRNA水平。比较细胞培养中对DNA损伤和锌诱导的p53的反应，以了解它们的转录模式。对这些数据的聚类分析表明，γ辐射、紫外线辐射和锌诱导的p53诱导的基因形成了不同的集合和子集，其中有一些基因与所有这些治疗方法相同。检测到细胞类型或细胞系特异性p53反应。当用锌诱导p53蛋白时，p53应答基因mRNA的诱导或抑制动力学分为八个不同类别、五个不同的诱导动力学和三个不同的抑制动力学。此外，细胞中低水平的p53仅诱导或抑制高水平p53下观察到的一部分基因。本研究的结果表明，不同mRNA物种中p53反应的性质取决于细胞中p53蛋白的水平、诱导剂或事件的类型以及所使用的细胞类型。在6000个检测p53调节反应的基因中，107个诱导基因和54个抑制基因分为凋亡和生长停滞、细胞骨架功能、生长因子及其抑制剂、细胞外基质和粘附基因。

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数字

图1
图1
结肠癌细胞系EB-1中的可诱导p53。用单克隆抗体1801和2A9分别用Western blots检测p53和人MDM2。使用一个小的GTPase Ran作为对照。(一个)用100μ米氯化锌开始于0小时，p53蛋白水平早于2小时升高。p53的最大诱导时间为4至8小时。与p53诱导相比，这些细胞中也诱导了人MDM2蛋白，但延迟了。在同样的刺激下，未观察到亲代EB细胞中p53或hMDM2的诱导。每个通道中装载10μg总蛋白，用抗p53、抗hMDM2和抗Ran抗体检测相同的印迹。(B类)EB-1细胞中诱导的p53蛋白水平取决于培养基中的锌浓度。EB-1细胞在0、1、10、50、100和200μ米氯化锌浸泡8小时。至少50μ米在这些细胞中诱导p53蛋白需要锌，100和200μ米锌以剂量依赖的方式将p53诱导至更高水平。在每个泳道中装载20μg的总蛋白。(C类)紫外线和γ射线对不同癌源细胞系p53的诱导作用。如图所示，对每个细胞系进行辐射处理，并在3-6小时后制备细胞裂解物（见材料和方法）。紫外线和γ射线照射均能诱导所有受试细胞系中的p53表达。每条车道装载65μg总蛋白。
图2
图2
p53诱导基因的功能分组（开条）与相同分组的100个随机选择的基因（实心条）进行比较。重大差异(P（P） < 0.02）用星号表示。p53诱导的基因富含与凋亡、生长停滞、细胞骨架、生长因子和细胞粘附有关的基因。与随机选择的基因库相比，参与细胞代谢的基因较少。
图3
图3
p53诱导后基因表达谱的聚类分析。根据报告的程序，根据其表达谱的相似性，共有69个基因被选择用于此分析，并被分为若干组（Eisen等人，1998年）。每个基因的表达水平由EB-1的基因强度与EB的基因强度之比表示，并显示在水平条带中。红色代表诱导水平，而绿色代表抑制水平。
图4
图4
每个基因簇的平均表达谱。将集群中每个基因的表达谱归一化为0–10的尺度，然后取平均值。通过聚类分析得到八个簇，显示出不同的诱导动力学。
图5
图5
通过RT-PCR独立测量选定的基因表达水平(左边)和p53寡核苷酸阵列(正确的). 用RT-PCR测定的表达水平归一化为GAPDH，并绘制出与对照细胞水平相关的曲线。这两种方法在基因表达谱上给出了非常相似的结果。
图6
图6
不同水平的p53对基因的调控。(一个)该组基因在高水平和低水平上对p53都有反应。(B类)这组基因只对高水平的p53反应。显示了每组选定的100和50μ米锌诱导的细胞。
图7
图7
紫外线或γ辐射后基因表达模式的聚类分析。在该分析中包括了指示辐射后的总共112个基因和5个不同的细胞系。这项分析是在两个维度上进行的，一个用于细胞系和辐射，另一个用于112个基因。具有野生型p53的细胞在不同的照射下会形成不同的簇。112个基因在不同类型的辐射后，在野生型p53细胞中以不同的表达模式聚集成9组。
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