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.2000年5月1日；20(9):3354-68.
doi:10.1523/JNEUROSCI.20-09-03354.2000。

利用在GABA能中间神经元中表达绿色荧光蛋白的转基因小鼠鉴定新的海马中间神经元亚型

小奥利瓦 1, M Jiang先生, T Lam公司, K L史密斯, J W斯旺
附属公司

利用在GABA能中间神经元中表达绿色荧光蛋白的转基因小鼠鉴定新的海马中间神经元亚型

小奥利瓦等。 神经科学. .

摘要

哺乳动物大脑的主要抑制神经元，GABA能神经元，由无数不同的神经元亚型组成。为了便于对这些神经元的研究，在GABA能神经元的亚群中生成表达增强型绿色荧光蛋白（EGFP）的转基因小鼠。在其中一个被称为GIN（GFP-expressing Inhibitory Neurons）的转基因细胞系中，EGFP被发现在海马和新皮质中含有生长抑素的GABA能中间神经元亚群中表达。在这些小鼠的活体和固定脑制剂中，很容易观察到EGFP表达中间神经元的详细显微解剖学特征。在海马的初级层中，表达EGFP的中间神经元几乎完全由具有腔隙分子轴突树枝状结构（O-LM细胞）的初级/肺泡中间神经元组成。在新皮质中，EGFP表达的中间神经元的胞体主要局限于第II-IV层和第V上层。在海马CA1区，使用GIN小鼠鉴定出两种以前没有特征化的中间神经元亚型：具有腔隙分子轴突树突的锥体层中间神经元（P-LM细胞）放射层中间神经元具有腔隙分子轴突树状结构（R-LM细胞）。这些新发现的神经元间亚型似乎与O-LM细胞密切相关，因为它们选择性地支配腔隙分子层。全细胞补丁灯记录显示，这些细胞具有快速峰值，几乎没有峰值频率调节。这些细胞的显微解剖特征表明，它们主要作为“输入-偏置”神经元发挥作用，因为辐射层中的突触排列会导致它们的激活，而这反过来又会导致选择性抑制从内嗅皮层到CA1锥体细胞的兴奋性输入。

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数字

图1。
图1。
用于制造GIN小鼠的转基因。约2.8 kbp小鼠加德1将基因序列亚克隆到EGFP编码序列的上游。The portion of the加德1所用基因由～1.2 kbp的上游调控序列组成(mGad1型urs公司；灰色方框)5′到主要转录起始位点(箭头)，整个第一（和非编码）外显子(黑匣子)和内含子（倒置“五“）和第二外显子的一部分(黑匣子)距离加德1翻译开始站点。因此，转基因并不编码EGFP融合蛋白产物。EGFP编码区，大条纹箭头SV40多聚腺苷化位点；白色方框.
图2。
图2。
GIN小鼠海马中EGFP的表达模式。一蒙太奇是成年背海马EGFP表达模式的例证，该模式是由纯合子小鼠50μm厚切片的重叠显微照片创建的。星号表示CA3区SLM中表达EGFP轴突终末的神经丛。b条——d日，中各字母表示的区域的高倍图像a.乙，CA3区SO中的细胞。c（c），来自CA1区SO的细胞，其中一个显示经典的O-LM细胞型形态(箭头).d日，来自CA1区SR的细胞，具有长锥形树突。e（电子），EGFP表达细胞位于门CA3边界附近的齿状回门。f、 克对神经元特异性核蛋白NeuN进行免疫组织化学处理的切片显示，EGFP在成人海马CA3区的表达。（f），仅EGFP表达可视化。克，使用双过滤器集同时可视化EGFP和NeuN表达。所有EGFP表达细胞共同表达NeuN，如亮黄色细胞核位于身体中央。需要注意的是，当使用GFP滤波器组进行查看时，NeuN信号显示出一些漏气现象（将SP与一具有（f）). Strata缩写：A类，阿尔维斯；SO公司，层位；服务提供商金字塔层；SR公司，辐射层；SLM公司，腔隙分子层；性虐待，地层分子；新加坡，颗粒层；H（H）齿状回门；SL公司，透明层。比例尺：一，200微米；e（电子），50μm（用于b–e（电子）)；克，100μm（用于（f）和克).
图3。
图3。
GIN成年小鼠海马EGFP表达细胞的免疫组织化学特征。一——c（c），EGFP表达细胞共同表达GAD67。一，EGFP在CA3区表达。b条，GAD67在与交流，节与相同一和b条其中EGFP和GAD67的表达使用双过滤器集同时观察。请注意，每个EGFP表达细胞都同时表达GAD67，并且出现了两种蛋白的共表达黄色的使用双滤光片组。d日——我，EGFP表达的中间神经元共同压迫生长抑素。d日，EGFP在CA3区表达。e（电子），SOM表达式位于与中相同的节中d、f、EGFP和SOM表达式使用双过滤器集同时查看。请注意，每个表达EGFP的中间神经元共同表达SOM。克——我，神经元的高倍视图，由箱在里面d日该神经元的形态与CA3 O-LM细胞一致。j个——我CA1区SO中EGFP和SOM的表达。j个，EGFP表达的SO中间神经元为SOM阳性，并显示CA1区O-LM细胞的形态学特征(大箭头).小箭头表示一种EGFP表达的体细胞，对SOM呈弱免疫阳性。米——o（o），EGFP表达的中间神经元共同表达mGluR1a。米，CA1区SO中的一个EGFP表达O-LM细胞。n个，mGluR1a在月，EGFP和mGluR1a表达的同时可视化。注意这个神经元轴突的起始段(米,箭头)mGluR1a表达为阴性。虽然只有它的起始段位于显微照片的焦平面上，但这个轴突可以通过SP和SR到达SLM，并在那里分支；整个长度的mGluR1a表达过程为阴性。Strata缩写与图2中相同.箭头在面板中a–（f）表示用于每个图像集的相同单元。比例尺：c、，我，50微米；（f），100微米；i、 o个，20微米。
图4。
图4。
表达EGFP的O-LM、R-LM和P-LM细胞的神经清醒重建，说明其完整性体内树突结构和轴突神经支配模式。采用基于DAB的免疫组织化学方法对EGFP进行免疫组织化学处理的连续脑切片进行重建。枝晶是绿色，轴突是红色和somata是蓝色.一，O-LM细胞的重建。该细胞的树突局限于SO，并产生一个轴突，该轴突主要无分叉地穿过SLM，并在那里分支。注意，该细胞在SO中产生局部轴突侧支。该O-LM细胞的完全重建树突树在隔颞轴延伸至~350μm，在内侧方向延伸至~450μm。b条，重建R-LM细胞。该细胞在SR中有体细胞，并产生轴突，在SLM中显著分支。这种神经元间亚型具有跨越SO到SR的树突，但很少进入SLM。注意，其中一个树枝状突起似乎深入SLM；这是一种误传，归因于三维重建被展平为二维，其中层流边界无法正确保留。该R-LM细胞的树突树在隔颞轴延伸至～400μm，在中外侧延伸至～850μm。c（c），P-LM细胞的重建。该细胞在SP中有体细胞，并产生一个在SLM中分支的轴突。与R-LM细胞一样，这种神经元间亚型具有跨越SO到SR的树突，除了最接近的部分外，树突往往避开SLM的所有部分。该P-LM细胞的树突树在隔颞轴延伸至~350μm，在内侧方向延伸至~400μm。所有重建均来自成年GIN小鼠。请注意，只有部分轴突重建是可能的：轴突在进入SLM后只能被短距离追踪，因为它们被其他表达EGFP的轴突的高密度所掩盖。插图显示每个重建中间神经元的海马位置。Strata缩写与图2中相同。比例尺：a–c，100μm。
图5。
图5。
O-LM细胞的形态学特征。一，一种O-LM细胞，其胞体靠近肺泡。该中间神经元是位于这部分地层的典型的O-LM细胞，具有椭圆形的胞体和水平排列的树突。b条典型的O-LM细胞，其胞体位于SP附近。这种O-LM电池产生初级树突，最初向肺泡放射状突出，但在进入SO的远端后，会转向水平突出，平行于层边界。注意，可以看到该细胞的初始轴突段(箭头)遍历SP。c、，d日，高倍图像显示了O-LM细胞典型的细树枝状特征。c（c），正如O-LM细胞常见的那样，初级树突(大箭头)通常又大又光滑。从二级枝开始，树突通常变得更薄，并出现许多静脉曲张(箭头). 这种形态将在树突树的其余部分持续存在。d日，许多（但不是全部）O-LM细胞稀疏到中等棘。一般来说，脊椎(箭头)仅在O-LM细胞的最远端树突状节段发现，通常在末端分支上，如这里的情况。轴突起始段可见于c（c）(小箭头). Strata缩写与图2中相同。比例尺：一,b条，40微米；c（c），20微米；d日，10微米。
图6。
图6。
R-LM和P-LM细胞形态特征。一，R-LM电池。正如这种神经元间亚型的典型特征一样，这种R-LM细胞有一个金字塔形的体细胞，其中有三个初级树突。该细胞也有相对光滑的初级树突(大箭头)在第一次树枝状分支之后，它变得非常曲张(箭头). 轴突起始段也可以从一级树突中看到(小箭头).b条，P-LM电池。请注意，轴突从一级树突发出，并向SLM投射。c（c）、R-LM和P-LM细胞树突通常不进入SLM。此示例显示了在SR-SLM边界处突然从SLM转向的R-LM细胞枝晶。在这种情况下，枝晶没有进入SLM。在许多其他情况下，树突会在返回之前进入SLM的最近端部分。对于所有三个图像，SO在上面，SLM在下面。Strata缩写与图2中相同。比例尺：a–c，40微米。
图7。
图7。
目测确定的海马EGFP表达中间神经元的神经生理特性。一，R-LM细胞的去卷积图像集的最大投影图像，揭示了该中间神经元的广泛树突树状化。图像集由50张在1.0μm下拍摄的图像组成z-轴间距。进行了100次反褶积迭代，生成了最大投影图像，如图所示。b条，R-LM电池的响应一去极化电流注入（0.05–0.15 nA，0.05 nA增量）。动作电位序列是对方波去极化电流阶跃的响应，该阶跃的频率随着去极化的增加而增加。与表达EGFP的中间神经元的典型情况一样，该神经元几乎没有表现出尖峰频率适应（调节）。c（c），R-LM细胞对方波超极化电流注入的响应（−0.20至−0.05 nA，0.05 nA增量）。注意这种神经元间细胞类型典型的时间依赖性内向整流（去极化“sag”）。d日，O-LM单元图像集的记录后反褶积。图像集由70张在1.0μm下拍摄的图像组成z-轴间距。对图像的子部分进行100次迭代的反褶积，从中生成最大投影图像，然后将其拼接在一起以生成完整的图像。e（电子），在EGFP表达的O-LM细胞中激发动作电位序列，以响应方波去极化电流阶跃（0.03–0.09 nA，0.03 nA增量）。表达EGFP的O-LM细胞几乎没有调节能力。（f），O-LM电池对超极化电流阶跃的响应（−0.12至−0.03 nA，0.03nA增量）。作为对超极化电流阶跃的响应，O-LM细胞通常表现出去极化“凹陷”。比例尺：一，20微米；d日，40微米。输入电阻：b条，150兆欧；c（c），300兆欧；e、 （f），550兆欧。静息膜电位：b条，−69毫伏；c（c），-67毫伏；e（电子）,（f），−59 mV。校准：200 msec，20 mV（如所示c（c）对于b条,c（c）；e（电子）对于e（电子）,（f）). 所有记录均在室温下进行。
图8。
图8。
成年GIN小鼠新皮层中EGFP表达细胞的特征。一，显示桶场皮层EGFP模式的显微照片。这种表达模式是所有新皮质区的典型表现。b、，c（c），通过对神经元特异性核蛋白NeuN进行30μm厚的免疫组织化学处理，在初级体感皮层中显示了EGFP表达的层特异性。EGFP表达的可视化(b条)或同时可视化EGFP和NeuN表达(c（c）)使用双过滤器组。表达EGFP的胞体主要局限于II-IV层和上层V。注意，表达EGFP的神经元完全出现黄色的而不仅仅是细胞核，这是显微摄影过程中周围NeuN信号高密度的结果（与图2g). 还应注意，使用EGFP滤波器（比较一，未为NeuN处理，具有b条.)d日，表示区域的高倍视图小写d面板内b条。单元格由箭头具有许多新皮质EGFP表达中间神经元常见的放射状双极形态。e（电子），从听觉皮层高倍放大观察EGFP表达中间神经元，例证了EGFP表示中间神经元的另一个亚型。该亚型的中间神经元有一个位于上层II的金字塔形胞体，有两个显著的下降一级树突，覆盖在层III中，但没有显著的上升树突。此子类型的另一个单元格位于面板的左上角a、f，小尺寸表示的区域的高倍视图（f）面板内一.躯体由大箭头有一个突出的水平运行的树突(小箭头)，并例证了新皮质EGFP表达中间神经元的第三个亚型。克，梨状皮层表达EGFP的中间神经元进一步说明了所发现的形态多样性。h–j小时，新皮质EGFP表达的中间神经元与生长抑素共存。小时EGFP在次级视皮层的表达。我，SOM表达式与面板中的相同部分h、i，使用双过滤器集同时可视化EGFP和SOM表达式。请注意，每个表达EGFP的中间神经元共同表达SOM。所有显微照片的方向应确保第一层在上面，第六层在下面，层流边界基本上与页面顶部平行。层表示为罗马数字.箭头在里面b、 c（c）和h–j小时表示每个图像集的相同单元格。比例尺：a、 c、j，100微米；d–g，50微米。
图9。
图9。
成年GIN小鼠脑冠状切片中EGFP的表达。一，对50微米厚的切片进行免疫组织化学处理以检测EGFP。请注意，图像是数字反转的，以增强对比度。b条，面板中大脑部分的痕迹一其中EGFP表达的躯体显示为黑色圆点注意，EGFP表达神经元在新皮质不同区域的分布相对均匀，中脑完全缺乏表达。比例尺，1 mm。
图10。
图10。
提出了涉及R-LM和P-LM细胞的前馈抑制模型。夏弗抵押品(联合国安全理事会)同时刺激R-LM和P-LM细胞以及CA1锥体细胞(个人计算机). R-LM和P-LM细胞的兴奋导致SLM中锥体细胞远端树突发生抑制。这种抑制的作用是通过减弱穿孔通路选择性地隔离从内嗅皮层到CA1的信息流(聚丙烯)CA1锥体细胞远端树突上的突触。因此，在这个模型中，R-LM和P-LM细胞促进并隔离从CA3到CA1的信息流，从而充当“输入-偏置”中间神经元。
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