Cloning of neuronal mtDNA variants in cultured cells by synaptosome fusion with mtDNA-less cells

doi:10.1093/nar/28.10.2164

.2000年5月15日；28(10):2164-70.

doi:10.1093/nar/28.10.2164。

突触体融合无线粒体DNA细胞克隆培养细胞中神经元线粒体DNA变体

I特朗斯¹, J Schmiedel公司, H C日元, S侯赛尼, M D棕色, J J奥尔森, D C华莱士

附属公司

PMID： 10773087
预防性维修识别码：项目编号105374
内政部： 10.1093/nar/28.10.2164

突触体融合无线粒体DNA细胞克隆培养细胞中神经元线粒体DNA变体

I特朗斯等。核酸研究. 2000.

.2000年5月15日；28(10):2164-70.

doi:10.1093/nar/28.10.2164。

作者

I特朗斯¹, J Schmiedel公司, H C日元, S侯赛尼, M D棕色, J J奥尔森, D C华莱士

附属

¹美国佐治亚州亚特兰大市埃默里大学医学院分子医学中心，邮编30329。

PMID： 10773087
预防性维修识别码：项目编号105374
内政部： 10.1093/nar/28.10.2164

摘要

利用突触体杂交证实人脑中存在异质线粒体DNA序列变异。突触体包含一到多个线粒体，当与mtDNA-缺乏（rho度）的小鼠或人类细胞系融合时，可产生活的杂交细胞系。利用mtDNA COIII、ND3和tRNA（Arg）基因的序列多态性，证实了小鼠突触体杂交mtDNA的脑起源。人类突触体杂交后代的大脑起源是通过一种罕见的mtDNA Mbo I多态性证实的。一名35岁女性大脑中突触体的融合产生了71个突触体cybridges。对这些杂交克隆的mtDNA控制区进行测序显示，核苷酸对（nps）301和309之间的聚C轨道中的Cs数量存在差异。3%的杂交克隆含有10个Cs的mtDNA，76%含有9个Cs，18%含有8个Cs和3%含有7个Cs。直接从患者脑组织中对线粒体DNA控制区进行PCR扩增、克隆和测序，获得了类似的结果，但从含有9个Cs的线粒体DNA的突触体杂交同质体中扩增和克隆控制区时，没有得到类似的结果。因此，我们在无需PCR的情况下从成人大脑中克隆恢复了mtDNA控制区长度变体，并在活培养细胞中建立了mtDNA变体。这证实了人类神经元中存在一些线粒体DNA异质性，并为研究其功能意义提供了机会。

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数字

图1
小鼠大脑突触体部分的电子显微照片。完整的突触体占主导地位，其中大多数线粒体剖面为一到几个完整的。该组分是从一只6周龄的动物身上分离出来的，在加工前，尸体在4°C下存放4小时。放大倍数=×28 500。

图2
人类突触体杂交mtDNA的脑起源。用聚合酶链式反应（PCR）扩增了从nps 15005到15701的线粒体DNA区域，并用姆博I和限制性片段在3%琼脂糖凝胶中电泳。大脑和杂交克隆的限制模式与143B-TK不同^–细胞mtDNA由于np15397处的核苷酸多态性，a→G转换。大多数人类mtDNA缺乏这个位点，产生234个np片段，而143B-TK片段^–mtDNA有该位点，并给出195和39个np片段（如右图所示）。脑中np 15397位点和cybridge mtDNA的存在证实了cybridges mtDNA来源于脑组织。143B-TK的两条车道^–细胞系显示亲本系（左）和一个亚克隆，随后产生ρ°克隆（右）。该mtDNA PCR产物无法从143B-TK的DNA中扩增^–ρ°克隆。

图3
通过引物延伸确认人类突触体杂交中np 301–309 poly C轨道长度的变化。通道1–11代表来自35岁女性大脑的单个突触体杂交克隆的mtDNA的引物延伸产物。下图中的数字表示克隆中包含的相对于剑桥序列的额外Cs数。大脑供体的生殖系mtDNA可能含有9个Cs（比剑桥序列或+2多2个），如第10和11道的杂交后代所示。

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[9] Cortopassi G.A.、Shibata，D.、Soong，N.W.和Arnheim，N.（1992）Proc。美国国家科学院。科学。美国，897370–7374。-项目管理咨询公司-公共医学

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