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。2000年5月；68(5):2566-72.
doi:10.1128/IAI.68.5.2566-2572.2000。

大肠杆菌将外膜蛋白A、肽聚糖相关脂蛋白和鼠脂蛋白释放到血清中

J赫尔曼 1, P M Loiselle先生, M M Tehan先生, J E Allaire公司, L A波义耳, J T库尼克, D M Andrews公司, K Sik Kim公司, H S沃伦
附属公司

大肠杆菌将外膜蛋白A、肽聚糖相关脂蛋白和鼠脂蛋白释放到血清中

J赫尔曼等。 感染免疫。 2000年5月。

摘要

含有脂多糖（LPS）和三种外膜蛋白（OMP）的复合物由在人血清中培养的革兰氏阴性菌释放，并在败血症实验模型中进入循环。在大肠杆菌J5（抗J5 IgG）的交叉保护性抗血清中，相同的OMP与免疫球蛋白G（Ig G）结合。本研究旨在确定三种OMP。利用OmpA缺陷菌和重组OmpA蛋白进行免疫印迹研究，确定35-kDa OMP为外膜蛋白A（OmpA）。根据纯化蛋白的肽序列和使用PAL缺陷细菌的免疫印迹研究，18kDa OMP被鉴定为肽聚糖相关脂蛋白（PAL）。基于使用MLP缺陷细菌的免疫印迹研究，5-9kDa OMP被鉴定为murein脂蛋白（MLP）。这些研究确定了在败血症实验模型中释放到人类血清和循环中的OMP为OmpA、PAL和MLP。

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图1
图1
OmpA缺陷细菌的免疫印迹。将细菌生长到中对数相，然后在SDS-PAGE样品缓冲液中煮沸。细菌裂解物随后在SDS–16%聚丙烯酰胺凝胶上电泳，并转移至硝化纤维素。染色抗体包括多克隆兔抗J5 IgG抗体（左）和针对35-kDa OMP的单克隆抗体（2D3；右）。细菌菌株：野生型OmpA+ 大肠杆菌O18:K1:H7（1车道）；E91，一个OmpA缺失的突变株大肠杆菌O18:K1:H7（2车道）；E69，一种OmpA-恢复的突变体大肠杆菌O18:K1:H7（3号车道）。分子量标记的位置（以千道尔顿为单位）显示在左侧。
图2
图2
重组OmpA的免疫印迹。重组OmpA（每个面板的通道1）和大肠杆菌在SDS–16%聚丙烯酰胺凝胶上电泳O18:K1:H7细菌（每个面板的第2道），并转移至硝化纤维素。主要抗体包括多克隆小鼠抗J5 IgG抗体（左）和针对35-kDa OMP的单克隆抗体（2D3；右）。
图3
图3
纯化18-kDa蛋白的肽序列。按照材料和方法中的说明纯化蛋白质。将SDS-聚丙烯酰胺凝胶上的轻度染色带切除，并用质谱法进行测序。胰蛋白酶消化后，获得两个肽序列。括号表示氨基酸已被合理确定；星号表示氨基酸是等压的，不能通过质谱测序明确区分。所有其他氨基酸都具有最高的置信度。
图4
图4
PAL缺陷细菌的免疫印迹。细菌的隔夜培养物在SDS-PAGE样品缓冲液中煮沸。细菌裂解物随后在SDS–16%聚丙烯酰胺凝胶上电泳，并转移至硝化纤维素。染色抗体包括多克隆兔抗J5 IgG抗体（左）和针对18-kDa OMP的单克隆抗体（6D7，右）。细菌菌株：大肠杆菌含有PAL的K-12 p400（第1道）；CH202，一种PAL缺乏的突变体大肠杆菌K-12（p400）（2车道）；CH202（pRC2），CH202的PAL再存储突变体（车道3）；大肠杆菌含有PAL的K-12 1292（第4道）；JC7752，1292（第5车道）PAL缺失突变株；和JC7752（第417页），JC7752的PAL重存储突变体（第6车道）。分子量标记的位置（千道尔顿）在左边。
图5
图5
MLP缺陷细菌的免疫印迹。细菌生长至中对数期，并在SDS-PAGE样品缓冲液中煮沸，所得细菌裂解物用作抗原。染色抗体包括多克隆兔抗J5 IgG抗体（左）和针对5-9-kDa OMP的单克隆抗体（1C7；右）。细菌菌株：大肠杆菌K-12 JE5505，一种MLP缺失突变株大肠杆菌K-12（2车道）；大肠杆菌K-12 JE5506，MLP-阳性，与JE5505（车道1）完全相同。分子量标记的位置（千道尔顿）在左边。
图6
图6
将含有OMP的样品释放到人血清中的免疫印迹。大肠杆菌O18:K1:H7培养至中对数期，在37°C的温度下，在含有氨苄西林（200 mg/ml）的100%人血清中培养2 h，然后通过0.45μm孔径的过滤器去除完整的细菌。滤液与多克隆兔抗J5 IgG、多克隆兔O-链特异性抗LPS IgG和正常兔IgG（对照）孵育之前与珠子共价结合的。将捕获的抗原从珠子中洗脱出来，并用针对OmpA（2D3）、PAL（6D7）、MLP（1C7）、多克隆小鼠抗J5 IgG或针对O多糖链的小鼠单克隆IgG染色大肠杆菌O18 LPS，如上所示。用兔抗J5 IgG（第1道）、兔O-链特异性抗LPS IgG的抗体（第2道）和正常兔IgG亲和纯化样品（第3道）。分子量标记的位置（千道尔顿）显示在每个面板的左侧。
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