跳到主页内容
美国国旗

美国政府的官方网站

Dot政府

gov意味着它是官方的。
联邦政府网站通常以.gov或.mil结尾。之前分享敏感信息，确保你在联邦政府政府网站。

Https系统

该站点是安全的。
这个https（https）：//确保您连接到官方网站，并且您提供的任何信息都是加密的并安全传输。

访问密钥 NCBI主页 MyNCBI主页 主要内容 主导航
.2000年3月20日；148(6):1151-8.
doi:10.1083/jcb.148.6.1151。

小GTPase Rap1介导CD31诱导的整合素粘附

K A里德奎斯特 1, E罗斯, E A Koop公司, R M沃尔萨斯, F J兹瓦特克鲁斯, Y van Kooyk先生, M三文鱼, C D巴克利, J L Bos公司
附属机构

小GTPase Rap1介导CD31诱导的整合素粘附

K A瑞德奎斯特等。 J细胞生物学. .

摘要

整合素介导的白细胞粘附是白细胞功能的一个关键方面，白细胞功能受到多种刺激物的严格调节，包括趋化因子、抗原受体和粘附受体。来自CD31和其他粘附放大器的细胞信号如何与来自经典有丝分裂刺激的信号整合，以调节白细胞功能，目前尚不清楚。这里，我们表明CD31的细胞质尾部是一个重要的整合素粘附放大器，它通过β1（VLA-4）和β2（LFA-1）整合素传播诱导T细胞粘附的信号。我们确定小GTPase，Rap1，是这种效应的关键中介。重要的是，CD31选择性地激活了Ras相关的小GTPase，Rap1，而不是Ras，R-Ras或Rap2。激活的Rap1突变体刺激T淋巴细胞对细胞间粘附分子（ICAM）和血管细胞粘附分子（VCAM）的粘附，Rap1鸟嘌呤核苷酸交换因子C3G和RapGAP的催化失活突变体也是如此。相反，Rap1信号的负调控因子阻断CD31依赖性粘附。这些发现确定了Rap1在调节配体诱导的细胞粘附中的新的重要作用，并表明Rap1可能在白细胞迁移和外渗过程中协调粘附依赖性信号方面发挥更普遍的作用。我们的研究结果还表明，与Ras-proximal信号传导的干扰不同，Rap1可能通过另一种机制介导转化逆转。

PubMed免责声明

数字

图1
图1
CD31依赖性粘附ICAM和VCAM需要CD31的细胞质尾部。A、 CD31在亲本、CD31阳性和阴性变体以及CD31 WT、CD31 GPI和Y663/686F Jurkat细胞转染体上的表达。细胞用对照抗体（开放直方图）或抗CD31抗体10B9（阴影直方图）染色，并用FACS分析平均荧光强度（mfi）。B、 CD31 WT、CD31 GPI和Y663/686F Jurkat细胞系与ICAM和VCAM的粘附。在不存在（培养基）或存在10μg/ml抗CD31抗体PECAM 1.3和山羊抗鼠抗体的情况下，允许荧光标记的细胞粘附在涂于96块平板（Nunc Maxisorp）上的纯化ICAM或VCAM（2μg/ml）上。测量总输入和结合荧光细胞。条形图表示两个代表性实验（一式三份）的细胞结合百分比的平均值和误差（细胞结合/总输入细胞×100，非模拟细胞归一化为100%）。
图2
图2
CD31选择性激活Rap1，但不激活其他Ras家族GTPase。A、 Jurkat JHMI 2.2细胞未经刺激（−）或用抗CD31抗体PECAM 1.3（10μg/ml）刺激指定时间或用TPA（100 ng/ml，5 min）刺激，裂解，并用RalGDS-RBD（Rap1和Rap2）或Raf-RBD（Ras和R-Ras）的固定化GST融合蛋白沉淀GTP-结合的GTPase。结合的GTPase在SDS-PAGE上被分解，转移到PVDF膜上，并通过免疫印迹检测针对指示蛋白的抗体，然后增强化学发光。B、 CD31胞外结构域抗体调节细胞粘附激活Rap1。用培养基（−）、抗CD3抗体T3b（1:200）或指示的抗CD31抗体（10μg/ml）激活JHMI细胞2分钟，并用A检测到Rap1激活。通过使用Adobe Photoshop软件从代表性印迹中量化像素，获得Rap1与未处理细胞相比的折叠激活。C、 依赖CD31的Rap1激活需要CD31胞质尾部。用培养基（−）或10μg/ml PECAM 1.3抗体和检测到的活化Rap1刺激CD31 WT、CD31 GPI和Y663/686F Jurkat细胞株2分钟，如A所示。每个面板中显示的结果代表三个独立实验。
图3
图3
Rap1通过LFA-1（β2）整合素调节Jurkat细胞粘附。A，Rap1的激活诱导Jurkat细胞粘附于ICAM。将5μg PG3-TK荧光素酶报告质粒和空载体（对照）或pMT2-HA-RapV12、H-RasV12、R-RasV38（各10μg）、RapGAP-LIG（20μg）或pCAGGS-C3G（10μg。将细胞粘附在固定化ICAM上1小时，清洗、溶解，并通过荧光素酶分析对粘附细胞进行定量。条形图表示以一式三份或四份形式进行的两到六个独立实验（如上条形图所示）中结合细胞百分比的平均平均结合率和标准误差，如图1所示。通常，10-20%的对照非刺激细胞粘附在ICAM上**P（P）< 0.01; *P（P）< 0.05; 和§ P（P）<0.1，与配对的对照细胞相比t吨测试。用抗HA表位抗体12CA5的免疫印迹裂解物检测来自代表性粘附试验的转染GTPase和RapGAP-LIG的表达水平，如图2A（插图）所示。插图中所示的斑点是从一个免疫印迹的单张胶片上切下的。B、 RapGAP-LIG突变体未能刺激Rap1上的GTP-水解。如上图所示，A14细胞单独转染载体、单独转染HA-Rap1或与增加量（0.3、1、2.5和5μg）的HA标记的RapGAP或RapGAP-LIG联合转染。用RalGDS-RBD从细胞裂解液中沉淀活性HA-Rap1，并通过12CA5免疫印迹检测，如图2所示（顶部）。通过用抗HA抗体对总细胞裂解物进行免疫印迹，监测HA-Rap1（中间）和RapGAP构建物（底部）的转染。C、 Rap1信号传导是CD31依赖性粘附到ICAM所必需的。转染pG3-TK荧光素酶报告质粒和30μg空载体（对照）或所示DNA构建物的WT CD31细胞，在用培养基或10μg/ml抗CD31抗体PECAM 1.3与山羊抗小鼠抗体交联刺激30分钟后，可以像在A中一样粘附在固定化ICAM上。使用荧光素酶分析定量结合的细胞，并按照图1计算结合的细胞百分比。所示为一式四份的代表性实验。P（P）数值如A所示，表示转染细胞与对照非刺激细胞（培养基）或CD31刺激的对照细胞相比的细胞群。
图4
图4
Rap1通过β1（VLA-4）整合素介导CD31依赖性粘附。A、 Rap1的激活足以诱导对VCAM的粘附。CD31阳性变异Jurkat细胞转染5μg pG3-TK荧光素酶报告质粒和空载体（对照）、HA-tagged RapV12、H-RasV12、R-RasV38（各10μg）、C3G（各10µg）或RapGAP-LIG（20μg），并允许粘附于固定化VCAM（50 ng/ml）。如图1所示，对一式三份或四份的五份（RapV12）、三份（C3G）或两份（RasV12、R-RasV38和RapGAP-LIG）独立实验中的粘附细胞和结合细胞百分比进行量化和计算。在单独存在培养基的情况下，观察到对照细胞与VCAM的特异性粘附为30–50%。用RapV12转染的细胞(**P（P）<0.01）和C3G(*P（P）<0.05），但RasV12或R-RasV38的结合水平显著高于对照细胞。RapGAP LIG公司，P（P）< 0.1003. B、 CD31依赖性粘附到VCAM需要Rap1信号。用5μg pG3-TK-荧光素酶和30μg空载体（对照）转染CD31 WT细胞，允许HA-标记的RapN17、RapGAP、RalGDS-RBD或His-tagged Spa1在不存在或存在交联抗CD31抗体PECAM 1.3的情况下与VCAM粘附（顶部）。配对t吨转染细胞的测试表明，转染RapGAP的细胞(*P（P）<0.05）、Spa1和RBD(§ P（P）<0.1）具有显著低于对照未刺激细胞的粘附性，并且RapN17、RapGAP(P（P）<0.05）、Spa1和RBD(P（P）<0.1）显著阻止CD31依赖性粘附。
图5
图5
Rap信号调节LFA-1中配体诱导的构象变化。A.转染细胞上LFA-1β2整合素的表达水平。将1μg pCMV-EGFP C1报告质粒连同空载体（GFP）或所示cDNA构建物瞬时转染Jurkat JHMI细胞。用抗β2整合素抗体L15和兔抗鼠Ig-RPE-Cy5偶联物对细胞进行连续染色，并用流式细胞术分析GFP表达细胞。数值表示为单独表达GFP的细胞的平均荧光强度（任意单位）归一化为100%。B、 CD31和Mn需要Rap信号2+-诱导LFA-1构象变化。如材料和方法中所述，将JHMI细胞转染为A细胞，不刺激（对照）或用抗CD31 2H8抗体（CD31）刺激30分钟，然后用配体诱导的结合抗LFA-1抗体mAb 24染色。或者，将未刺激的细胞与mAb 24和400μM MnCl共培养2（Mn）。通过流式细胞术评估mAb 24的表达，并在每个实验中将未刺激GFP单独细胞的表达水平标准化为1。数据表示代表性实验（GFP，n个= 4; RapV12和RapN17，n个= 3; RapGAP LIG和RBD，n个= 2). 观察到对照细胞和受刺激细胞之间以及受刺激转染细胞之间的统计显著差异(*P（P）< 0.01; **P（P）< 0.05;§ P（P）< 0.1). C、 RapN17阻断mAb 24诱导。实验按B进行，但数据表示mAb 24表达细胞的百分比。D、 Rap信号调节Mn2+-诱导ICAM粘附。用荧光素酶报告质粒转染Jurkat细胞，并显示如图3所示的结构，并允许在没有或存在4 mM MnCl的情况下粘附于ICAM2，比粘附率的百分比如图3所示进行计算，并将模拟转染的受刺激细胞归一化为100。数据代表了两到四个实验的平均平均值和误差，每个构造一式四份。显示了统计上的显著差异(*P（P）< 0.01; **P（P）< 0.05).
请参阅PMC中的此图像和版权信息

类似文章

查看所有类似文章

引用人

查看所有“被引用”文章

工具书类

    1. Andrew D.、Shock A.、Ball E.、Ortlepp S.、Bell J.、Robinson M.KIM185，一种CD18的单克隆抗体，可诱导CD18构象的改变并促进LFA-1和CR3依赖性粘附。欧洲免疫学杂志。1993年；9:2217–2222。-公共医学
    1. Arai A.、Nosaka Y.、Kohsaka H.、Miyasaka N.、Miura O.CrkL通过鸟嘌呤核苷酸交换因子C3G激活整合素介导的造血细胞粘附。鲜血。1999;93:3713–3722.-公共医学
    1. Berman M.E.，Muller W.A.血小板/内皮细胞粘附分子1（PECAM-1/CD31）在单核细胞和中性粒细胞上的连接增加了白细胞CR3（CD11b/CD18）的结合能力。免疫学杂志。1995;154:299–307.-公共医学
    1. Berman M.E.，Xie Y.，Muller W.血小板/内皮细胞粘附分子-1（PECAM-1，CD31）在自然杀伤细胞跨内皮细胞迁移和β2整合素激活中的作用。免疫学杂志。1996;156:1515–1524.-公共医学
    1. Bos J.L.类Ras-like GTPases。生物化学。生物物理学。《学报》。1997年；1333:19–31.-公共医学

出版物类型

赠款和资金