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.2000年4月；20（7）：2367-77。
doi:10.1128/MCB.20.7.2367-2377.2000。

酵母ULP2（SMT4）基因编码一种新的蛋白酶，该蛋白酶对泛素样Smt3蛋白具有特异性

S J李 1, M Hochstrasser先生
附属公司

酵母ULP2（SMT4）基因编码一种新的蛋白酶，该蛋白酶对泛素样Smt3蛋白具有特异性

李世杰等。 分子细胞生物学. 2000年4月.

摘要

酵母Smt3及其脊椎动物同源物SUMO-1是泛素样蛋白质（Ubls），与其他蛋白质可逆连接。与SMT3一样，SMT4最初是作为缺陷着丝粒结合蛋白的高拷贝数抑制剂分离出来的。我们在这里表明，SMT4编码一种Smt3解偶联酶，Ulp2。在缺乏Ulp2的细胞中，特异性Smt3蛋白结合物积累，并且结合模式与ulp1（ts）菌株中观察到的模式不同，ulp1菌株对远缘相关的Smt3特异性蛋白酶ulp1有缺陷。ulp2Delta突变体表现出多效性表型，包括温度敏感性生长、异常细胞形态、质粒和染色体稳定性降低以及严重的产孢缺陷。突变株对DNA损伤剂羟基脲和苯诺明也过敏。虽然细胞周期检查点因DNA损伤、复制抑制或纺锤体缺陷而停止，但其动力学正常，但停止后的恢复受到损害。令人惊讶的是，无论是引入ulp1（ts）突变还是过度生产催化活性不高的ulp1，都可以大大克服ulp2Delta缺陷。Ulp2失活还抑制了几个ulp1（ts）缺陷，并且双突变体积累的Smt3蛋白结合物远远少于任一单个突变体。我们的数据表明存在一种反馈机制，当Ulp1和Ulp2的Smt3去结合受到损害时，该机制限制了Smt3蛋白的连接，从而使细胞功能得以部分恢复。

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数字

图1
图1
酵母Ulp酶。（A） UD输入酿酒酵母Ulp1和Ulp2。指出了催化His（H）和Cys（C）残基的位置以及Ulp2在UD（实心棒）中的特定插入位置。（B） 酵母Ulp1和Ulp2 UDs的序列比对。箭头标记假定的催化残留物；黑色和灰色方框分别标记相同和相似的残留物。
图2
图2
酿酒酵母Ulp2是一种Smt3裂解酶。（A） 放射性标记His的裂解6-GST-Ulp2泛素-Smt3-HA和酵母Ubp1在30°C下2h后通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（12.5%凝胶）进行分析。左车道，没有添加酶。在室温下进行抑制剂预培养15分钟。醛，泛素醛；−，不存在。（B） 通过纯化的酵母Smt3蛋白结合物的GST-Ulp2或GST-Urp1进行体外切割。印迹条件不允许游离Smt3的可视化。NEM处理提取物（25μg）ulp2Δ显示了在23°C（两个左车道）或37°C（三个右车道）下生长的细胞。在体外经Ulp2消化后，一个约85 kDa的物种可重复增强；这可能是一种多重修饰的蛋白质，并非所有Smt3分子都能被裂解。用兔抗Smt3抗体进行免疫印迹分析。在较低的凝胶中，用抗PGK（3-磷酸甘油酸激酶）重新过滤，以比较蛋白质载量。分子质量标记的位置显示在每个面板中（单位为千道尔顿）。
图3
图3
的增长ulp2Δ细胞。（A） 四分之一分析ulp2Δ/ulp2杂合子。一个他的+所示的10个四分体的分离物最终生长成一个小菌落。（B） 在37°C的富培养基上生长5天或在30°C的条件下生长4天ulp2Δ携带带有指示基因的高拷贝数（HC）质粒的细胞。Smt3蛋白被HA标记。
图4
图4
细胞形态ulp2Δ细胞。野生型和同源型ulp2Δ用Nomarski光学（DIC）观察30°C下生长的细胞。突变细胞相对于野生型而言增大，通常具有拉长的芽，偶尔形成菊花链。微管通过抗微管蛋白免疫荧光显示，细胞核通过DAPI荧光显示。
图5
图5
的比较ulp2Δ,ulp1时间、和ulp2Δulp1时间突变体。对数生长培养物的十倍系列稀释液被发现在放置在30°C（A）或37°C（B）的YPD板上。或者，在30°C下，在15μg硫酸苄酯/ml（C）、0.1 M羟基脲（D）或0.005%MMS（E）存在下培养细胞，或将其暴露于1.3 J/ml2紫外线辐射（F）或200千拉德的γ射线（G）。
图6
图6
中检查点功能的评估ulp2Δ突变体。（A） 在苯诺明中孵育指定时间后的细胞生长。将处理过的细胞铺在YPD板上，并在30°C下培养。存活率计算为每个时间点样本形成的菌落相对于每个菌株治疗开始时计数的数量的百分比。使用的菌株为MHY501、MHY1380和MHY1628。（B） 在MMS中孵育后的细胞生长。这个ulp2Δ和ubc9-1突变体与MHY501同源地中海1突变体MHY1621与W303a同源。wt，野生型。（C） 在羟基脲中培养后细胞的生长。（D） 正常块到主轴的伸长率ulp2Δ暴露于0.1 M羟基脲的细胞。通过抗微管蛋白染色细胞的显微照片评估细胞出芽和纺锤体。MHY501（野生型）和MHY1380每个时间点的平均细胞数分别为51和68(ulp2Δ)分别是。（E） 主轴伸长异常地中海1根据面板D评估的检查点突变。W303a（野生型）和MHY1621每个时间点计数的平均细胞数分别为56和44(地中海1)分别是。（F） 从α-因子同步细胞群中分离出的指定基因型的单个细胞启动的微克隆中观察到的平均细胞体数（细胞加芽）。除（11）所示外，菌株均为等基因菌株。盘子里含有2%的半乳糖。（G） 抑制菌落形成ulp2Δ细胞过度表达MPS1型.
图6
图6
中检查点功能的评估ulp2Δ突变体。（A） 在苯诺明中孵育指定时间后的细胞生长。将处理过的细胞铺在YPD板上，并在30°C下培养。存活率计算为每个时间点样本形成的菌落相对于每个菌株治疗开始时计数的数量的百分比。使用的菌株为MHY501、MHY1380和MHY1628。（B） MMS中培养后的细胞生长。这个ulp2Δ和ubc9-1突变体与MHY501同源地中海1突变体MHY1621与W303a同源。wt，野生型。（C） 细胞在羟基脲中培养后的生长。（D） 正常块到主轴的伸长率ulp2Δ暴露于0.1M羟基脲的细胞。通过抗微管蛋白染色细胞的显微照片评估细胞出芽和纺锤体。MHY501（野生型）和MHY1380每个时间点的平均细胞数分别为51和68(ulp2Δ)分别是。（E） 主轴伸长异常地中海1根据面板D评估的检查点突变。W303a（野生型）和MHY1621每个时间点计数的平均细胞数分别为56和44(地中海1)分别是。（F） 从α-因子同步细胞群中分离出的指定基因型的单个细胞启动的微克隆中观察到的平均细胞体数（细胞加芽）。除（11）所示外，菌株均为等基因菌株。盘子里含有2%的半乳糖。（G） 抑制菌落形成ulp2Δ细胞过度表达MPS1型.
图7
图7
Smt3蛋白结合物ulp2Δ细胞。（A） Ulp2或Ulp1过度生产对Smt3蛋白结合物的影响。载体pRS424；所有等位基因都位于pRS424中。箭头表示积累在ulp2Δ细胞。样品在SDS–7.5至18%聚丙烯酰胺梯度凝胶上运行，然后进行抗Smt3免疫印迹。在所用的印迹条件下，未检测到游离Smt3。（B） 酵母提取物中Smt3蛋白结合物的裂解。将球形体在37°C下孵育30分钟，然后用（+）或不用（−）NEM裂解。在30°C下30分钟后，将每个样品中的90μg蛋白质加载到10%至15%的梯度凝胶上，然后进行免疫印迹分析。星号和括号表示Smt3共轭ulp1时间与大多数结合物不同，在无NEM的体外培养过程中消失的细胞。（C） 通过增强化学发光检测的抗Smt3免疫印迹分析Smt3递呈过程。使用的菌株为MHY1614至MHY1617，表达SMT3型来自质粒载体CUP1大学发起人。
图8
图8
Ulp1和Ulp2的本地化。（A） myc9标记Ulps的抗myc免疫印迹分析。通道1，无标记控制MHY500单元。（B） 标记Ulps的间接免疫荧光定位。DAPI显示细胞核。
图9
图9
Smt3加工和Smt3蛋白结合物硫酸突变体。（A） 抑制ulp2Δ催化缺陷型Ulp1突变体的温度敏感性。（B） Smt3蛋白结合物ulp公司30°C下的突变体。所用菌株为MHY1614至MHY1617。（C） 相互抑制ulp2Δ和ubc9-1生长缺陷。（D） 提供额外的成熟Smt3不会影响对苯诺明敏感度的抑制ulp2Δulp1时间突变体。YPD板包括100μM CuSO4诱导他的6-来自YRTAG310-His6-Smt3-gg质粒的Smt3表达。
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参考文献

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