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.2000年2月21日；148(4):811-24.
doi:10.1083/jcb.148.4.811。

syndecan-1和-4外结构域的脱落受多种信号通路调节，并由TIMP-3敏感性金属蛋白酶介导

M L菲茨杰拉德 1, Z Wang（Z王）, 普惠公园, G墨菲, M伯恩菲尔德
附属公司

syndecan-1和-4外结构域的脱落受多种信号通路调节，并由TIMP-3敏感性金属蛋白酶介导

M L菲茨杰拉德等。 J细胞生物学. .

摘要

由四种跨膜硫酸乙酰肝素蛋白聚糖组成的syndecan家族结合多种可溶和不可溶的细胞外效应物。Syndecan胞外结构域（外结构域）可以通过其核心蛋白的蛋白水解裂解而完整脱落，产生保留其细胞表面前体结合特性的可溶性蛋白多糖。蛋白激酶C的PMA活化以及凝血酶（G-蛋白偶联）和EGF（蛋白酪氨酸激酶）受体的配体活化加速了脱落（Subramanian，S.V.，M.L.Fitzgerald，and M.Bernfield，1997）。生物学杂志。化学。272:14713-14720）。Syndecan-1和-4外结构域存在于急性皮肤伤口液中，它们调节生长因子活性（Kato，M.，H.Wang，V.Kainulainen，M.L.Fitzgerald，S.Ledbetter，D.M.Ornitz和M.Bernfield，1998）。Nat.Med.4:691-697）和蛋白水解平衡（Kainulainen，V.，H.Wang，C.Schick，and M.Bernfield，1998）。生物学杂志。化学。273:11563-11569). 然而，关于新癸烷外结构域脱落是如何调节的，人们知之甚少。为了阐明调控合成癸烷脱落的机制，我们分析了合成癸糖-1和-4外结构域脱落过程的几个特征。我们发现，各种生理因子加速的脱落涉及不同细胞内信号通路的激活；与细胞表面相关联的syndecan核心蛋白裂解的蛋白水解酶活性可作用于未受刺激的邻近细胞，并被基质相关金属蛋白酶抑制剂TIMP-3特异性抑制。此外，我们发现syndecan-1核心蛋白在细胞表面的相邻膜位点被裂解；加速脱落的蛋白水解酶活性不同于组成性脱落的syndecan外结构域。这些结果表明存在高度调节的机制，可以快速将细胞表面受体或共受体的合成癸烷转化为可溶性硫酸乙酰肝素蛋白多糖效应器。由于脱落的外结构域在体内被发现并发挥作用，生理介质对间质外结构域脱落的调节表明脱落是对特定发育和病理生理线索的反应。

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图1
图1
syndecan-1和-4的加速脱落取决于蛋白酪氨酸激酶的活性。（A和B）NMuMG上皮细胞与4αPDD（0.5μM）、一种非活性PMA类似物或PMA孵育30分钟，并在存在或不存在酪蛋白A25（5μg/ml）或2,5，二羟基肉桂酸甲酯（5μg/ml）的情况下孵育。NMuMG细胞在含有或不含酪蛋白A25（5μG/ml）的情况下，与以下物质共同培养2小时：（C和D）100μM TRAP，或（E和F）700 mOsm NaCl，或（G和H）100μM神经酰胺。收集条件培养基，并将其应用于阳离子Immobilon-N膜，以使用ECL检测进行斑点杂交分析。利用单克隆抗体281-2和MSE-4抗血清分别用ECL检测Syndecan-1（A、C、E和G）和Syndecan-4（B、D、F和H）外结构域。结果表示为用密度扫描定量的AU中syndecan外结构域脱落量，并用NIH图像软件进行分析。每个点代表三次测定的平均值±SD。与未经处理的对照组相比，对于所分析的每种脱落激动剂，单独与抑制剂孵育对脱落水平没有影响。
图2
图2
PMA和应激加速脱落，但受体激活不加速脱落，这取决于蛋白激酶C的活性。将NMuMG细胞（A和B）与PMA或4αPDD（0.5μM）孵育30分钟。将NMuMG细胞（C和D）与700 mOsm NaCl或（E和F）100μM神经酰胺或（G和h）10 ng/ml EGF或100μM TRAP孵育2 h。在不存在或存在双吲哚甲基苯胺I（Bis.，1μM）的情况下对每种激动剂进行分析。如图1所示，通过斑点杂交分析，对条件培养基中的syndecan-1（A、C、E和G）和syndecan-4（B、D、F和H）外结构域进行分析。如图1所示进行定量，每个点代表平均值±标准差(n个= 3). 与未经处理的对照组相比，对于所分析的每种脱落激动剂，单独与抑制剂孵育对脱落水平没有影响。
图3
图3
MAP激酶活性的抑制可通过受体激活而非PMA来阻止脱落。将NMuMG细胞（A和B）与0.5μM PMA或不与之混合培养30分钟，或（C和D）与10 ng/ml EGF混合培养2小时，或（E和F）与100μM TRAP混合培养2 h。在没有或存在PD98059（20μM）的情况下对每种激动剂进行分析。通过斑点杂交分析条件培养基中的syndecan-1（A、C和E）和syndecan-4（B、D和F）外结构域，如图1所示。定量如图1所示，每个点代表平均值±SD(n个= 3). 对于每种测定的脱落激动剂，与未处理的对照相比，单独用抑制剂孵育对脱落水平没有影响。
图4
图4
Syndecan外结构域通过细胞表面的蛋白水解裂解而脱落。将活的P3X63小鼠血浆细胞与生物素化单抗281-2在4°C下孵育30分钟，然后在37°C下使用或不使用0.5μM PMA治疗30分钟。将细胞固定并用FITC-亲和素标记，用于免疫荧光检测未处理（A）或PMA处理（B）细胞的细胞表面syndecan-1。
图5
图5
与膜相关的蛋白水解活性是加速脱落的原因。将P3X63细胞与人类ARK细胞共培养15分钟，这些细胞经过或不经过PMA预处理15分钟，并用无血清培养基冲洗两次。细胞（A）混合在一起或（B）通过Transwell膜相互分离。恒定数量的P3X63细胞（5×106)并使用不同数量的ARK细胞。用单克隆抗体281-2对条件培养基进行斑点杂交分析，检测P3X63细胞表面脱落的syndecan-1。定量如图1所示，每个点代表平均值±SD(n个= 3).
图6
图6
PMA加速了syndecan-1外结构域的脱落，这是由于在核心蛋白的膜旁部位发生了断裂。（A） 野生型（WT）syndecan-1和CD4-juxtamembrane（JM）突变体syndecan-1的示意图。外结构域的JM区域显示为WT氨基酸序列和CD4-JM结构域突变序列（粗体）。（B） 用WT syndecan-1或CD4-JM突变体瞬时转染COS-7细胞。在不存在或存在肽羟肟酸盐BB-1101（1μM）的情况下，在有或没有PMA（0.5μM，15分钟）的情况下孵育细胞。通过斑点杂交分析测定条件培养基中的Syndecan-1外结构域，并按照图1进行定量。每个点代表平均值±SD(n个= 3).
图7
图7
肽羟肟酸盐抑制加速脱落。（A和B）NMuMG细胞在存在或不存在肽羟肟酯BB-2116或BB-1101的情况下，在含有或不含有PMA的情况下培养30分钟（0.5μM）。（C和D）SVEC4-10细胞在加入或不加入10 ng/ml EGF或100μM TRAP的情况下，在1μM BB-1101存在或不存在的情况下培养2 h。在存在或不存在1μM BB-1101的情况下，使用或不使用100μM神经酰胺培养（E和F）NMuMG细胞2 h。如图1所示，通过斑点杂交分析对条件培养基中的Syndecan-1（A、C和E）和Syndecan-4（B、D和F）外结构域进行分析。定量如图1所示，每个点代表平均值±SD(n个= 3). 与未经处理的对照组相比，对于每种检测的脱落激动剂，单独与抑制剂（1μM）孵育可降低脱落水平。
图8
图8
TIMP-3特别抑制PMA加速脱落。在存在或不存在20μg/ml TIMP-1、-2或-3的情况下，用PMA（0.5μM，持续30分钟）处理（A和B）NMuMG细胞。（C和D）NMuMG细胞在有或无TIMP-3的情况下，在指定浓度下用或不用PMA（0.5μM，持续30分钟）处理。如图1所示，通过斑点杂交分析测定条件培养基中的Syndecan-1（A和C）和Syndecan-4（B和D）外结构域。定量如图1所示，每个点代表平均值±SD(n个= 3). 与未经处理的对照组相比，对于所分析的每种脱落激动剂，单独使用TIMP-1、-2或-3（20μM）对脱落水平没有影响。
图9
图9
TIMP-3抑制受体和应激激活的脱落。（A和B）SVEC4-10细胞用或不用10 ng/ml EGF或100μM TRAP处理，或（C和D）NMuMG细胞在有或没有20μg/ml TIMP-3的情况下用或不使用100μM神经酰胺处理2 h。如图1所示，通过斑点杂交分析测定条件培养基中的syndecan-1（A和C）和syndecan-4（B和D）外结构域。定量如图1所示，每个点代表平均值±SD(n个= 3). 与未经处理的对照组相比，对于所分析的每种脱落激动剂，单独使用TIMP-1、-2或-3（20μM）对脱落水平没有影响。
图10
图10
合成癸烷-1和-4的组分脱落被肽羟肟酸盐抑制，但不被TIMP-3抑制。SVEC4-10细胞在存在或不存在指定浓度的（A和B）肽羟肟酯BB-2116和BB-1101或（C和D）TIMP-3的情况下培养14小时。如图1所示，通过斑点杂交分析测定条件培养基中的syndecan-1（A和C）和syndecan-4（B和D）外结构域。定量如图1所示，每个点代表平均值±SD(n个= 3). 在本试验中，TIMP-1和TIMP-2（20μM）没有抑制成分性脱落，在2小时脱落试验中，与未经处理的对照组相比，单独使用PTK、PKC或MAPK抑制剂不会影响脱落水平。
图11
图11
Syndecan胞外区脱落。syndecan胞外结构域可以通过核心蛋白的蛋白水解裂解而完整脱落，产生可溶性HSPG，保留其细胞表面对应物的结合特性。PMA和多种生理效应物（例如EGF家族成员、凝血酶、高渗压、鞘磷脂酶和神经酰胺）通过激活多种细胞内信号通路，加速了syndecan-1和-4外结构域从细胞表面脱落。这些信号汇聚在TIMP-3敏感的细胞表面金属蛋白酶系统上，该系统可裂解细胞表面15个氨基酸内的核心蛋白，并可作用于未受刺激的相邻细胞。脱落受组织损伤的刺激，在炎性液体中发现这些合胞外结构域（Subramanian等人，1997年），它们调节生长因子和蛋白酶的活性（Kainulainen等人，1998年；Kato等人，1998）。详见正文。
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