High-throughput SNP allele-frequency determination in pooled DNA samples by kinetic PCR

doi:10.1101/gr.10.2.258

.2000年2月；10(2):258-66.

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动力学PCR法测定混合DNA样品中高通量SNP等位基因频率

S Germer公司¹, M J荷兰, R Higuchi先生

附属公司

PMID： 10673283
预防性维修识别码：项目经理310828
内政部： 10.1101/gr.10.2.258

动力学PCR法测定混合DNA样品中高通量SNP等位基因频率

S Germer公司等。基因组研究. 2000年2月.

.2000年2月；10(2):258-66.

doi:10.1101/gr.10.2.258。

作者

S Germer公司¹, M J荷兰, R Higuchi先生

附属

¹罗氏分子系统公司，美国加利福尼亚州阿拉米达市，邮编94501。Soren.Germer@Roche.com

PMID： 10673283
预防性维修识别码：项目经理310828
内政部： 10.1101/gr.10.2.258

摘要

我们开发了一种准确、廉价、高通量的方法，用于测定DNA样本库中双等位基因多态性的等位基因频率。该检测结合了动力学（实时定量）PCR和等位基因特异扩增，不需要PCR后处理。对样本中每个等位基因的相对数量进行量化。这是通过在两个单独的PCR反应之间等分的混合DNA来实现的，每个PCR反应都包含一个特定于一个或另一个等位SNP变体的引物对。对于两个等位基因数量相等的池，两个扩增应在相同的周期数下达到可检测的荧光水平。对于包含两个等位基因比例不等的池，可以使用两个扩增反应之间的循环数差异来计算相对等位基因数量。我们证明了对已知预定SNP等位基因频率为5%至95%的样本进行检测的准确性和可靠性，包括使用八种不同SNP的人类和小鼠DNA池。测量已知等位基因频率的准确性非常高，测量频率和已知频率之间的相关性强度为r（2）=0.997。与仅因采样误差而导致的灵敏度损失相比，对于1000个以上的人群样本，测量误差导致的灵敏度损耗通常最小。我们认为，通过提供一种同时、廉价和可重复的多达数千个样本的SNP基因分型方法，该方法是检测候选基因关联研究和全基因组连锁不平衡扫描中有意义的多态性差异的有力策略。

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数字

图1
使用动力学PCR测量等位基因频率的基础。所示为ApoB71多态性PCR反应的扩增生长曲线。样本由两个DNA构成，每个DNA纯合子对应ApoB71 SNP的不同等位基因，包含5%的等位基因1。将等分的样本池（每个20 ng DNA）放入含有两个等位基因特异性引物集之一的PCR中。每个引物组进行四次重复反应（共八次PCR）。相对等位基因频率根据Δ确定*C类_t吨*使用方程式1（见正文和图2）。

图2
Δ之间的关系*C类_t吨*等位基因频率。实心中心线是文本中方程式1的绘图。侧面实线表示预期的不确定性（1标准差。)仅根据抽样误差估计等位基因频率（样本量=1000）。虚线表示采样和测量误差的综合不确定度。测量误差基于本文中测量的平均误差，并且是在对四次重复测量进行平均后预期的误差。这个插入比较测量误差对等位基因频率中点和上端的影响（下端应该正好反映上端）。

图3
动力学PCR等位基因频率测量的准确性。所示为表1、表2和表3中所有等位基因频率测量值的散点图，将已知频率（由表1中的DNA浓度以及表1和表2中的个体基因分型和等位基因计数确定）与测量频率进行比较。误差条代表一个标准差。在测量中。对角线是已知值和测量值之间完全一致的预期对角线。

图4
测量误差对三种SNP分析的影响。(A类)绘制为实线的是该SNP的预期采样误差，样本大小不超过1000时，等位基因频率为10%（见正文）。上折线是根据表3并使用四次测量的平均值估算的本次分析的合并采样和测量误差。仅此测量误差就是下方的虚线。(B类)与相同A类用于人类CST5基因座（表2）。(C类)与相同A类和B类用于小鼠REN1 SNP（表3）。

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[10] Birch DE。简化热启动PCR。自然。1996;381:445–446.-公共医学

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