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.2000年3月；20(5):1868-76.
doi:10.1128/MCB.20.5.1868-1876.2000。

共激活因子PGC-1与过氧化物酶体增殖物激活受体α协同作用，对编码线粒体脂肪酸氧化酶的核基因进行转录控制

R B织女星 1, J M Huss先生, D P Kelly公司
附属公司

辅活化因子PGC-1与过氧化物酶体增殖物激活受体α在编码线粒体脂肪酸氧化酶的核基因转录控制中协同作用

R B织女星等人。 分子细胞生物学. 2000年3月.

摘要

过氧化物酶体增殖物激活受体α（PPARalpha）在编码线粒体脂肪酸β-氧化酶（FAO）基因的转录控制中起着关键作用。在这项研究中，我们试图确定最近确定的PPARγ辅激活子1（PGC-1）是否能够在编码FAO酶的基因的转录控制中辅激活PPARalpha。哺乳动物细胞共转染实验表明，PGC-1增强了PPARα介导的含有PPARα靶元件的报告质粒的转录激活。PGC-1还增强PPARalpha-Gal4 DNA结合域融合蛋白的反式激活活性。在3T3-L1细胞中进行的逆转录病毒载体介导的表达研究表明，PPARalpha和PGC-1协同诱导PPARalphi靶基因的表达，并增加细胞棕榈酸酯的氧化速率。谷胱甘肽S-转移酶“下拉”研究表明，与先前报道的与PPARgamma的配体依赖性相互作用相反，PGC-1以配体影响的方式结合PPARalpha。蛋白质相互作用研究和哺乳动物细胞杂交实验表明，PGC-1-PPARalpha相互作用涉及PGC-1和PPARalphi AF2区域的LXXLL结构域，与观察到的配体影响一致。最后，PGC-1反式激活域被映射到PGC-1分子NH（2）末端120个氨基酸内，该区域不同于PPARalpha相互作用域。这些结果确定PGC-1是PPARalpha在线粒体FAO能力转录控制中的辅激活子，定义了PGC-1分子中可分离的PPARalphi相互作用和反式激活域，并证明PPARalpha-PGC-1相互作用的某些特征与PPARgamma-PGC-1不同。

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数字

图1
图1
PGC-1增强PPARα介导的转录激活。异源启动子报告子结构（PPRE）三TKLuc（A）或同源启动子报告子MCPT。将Luc.781（B）瞬时转染到CV-1细胞中。编码RXRα/PPARα和/或PGC-1的表达结构在BSA载体或与BSA络合的油酸（250μM）存在下共同转染，如图所示。条形代表相对荧光素酶单位（RLU）归一化（=1.0）到（PPRE）活性的平均值（±标准误差）三TKLuc（A）或MCPT。Luc.781（B）在没有配体的情况下与表达载体主干共转染。所有转染数据代表至少三个独立实验的方法。
图2
图2
PPARα和PGC-1协同诱导线粒体FAO途径的PPARα基因靶标记。如上图所示，使用从感染编码LacZ、PPARα、PGC-1或PPARα和PGC-1的重组逆转录病毒颗粒的3T3-L1前脂肪细胞分离的总RNA（15μg）进行Northern blot分析的放射自显影。按照材料和方法中的描述，细胞生长到汇合处并诱导分化。在添加分化培养基六天后，添加ETYA（+）或溶媒对照（−）。在加入配体或载体48小时后分离RNA。将印迹与右图所示的放射性标记cDNA探针杂交。溴化乙锭（EtBr）染色的RNA被包括在内，作为负荷和RNA完整性的控制。
图3
图3
PPARα和PGC-1增加细胞棕榈酸酯的氧化速率。在感染表达LacZ（对照）、PPARα、PGC-1或PPARα和PGC-1的逆转录病毒载体的培养物中，对3T3-L1前脂肪细胞进行棕榈酸酯氧化研究，如材料和方法所述。细胞与[1孵育后-14C] 棕榈酸酯6小时14一氧化碳2用闪烁计数法测定细胞释放。条形图表示平均值（±标准误差）14一氧化碳2（以每分钟计数为单位）标准化（＝1.0）为用LacZ感染的对照细胞获得的平均值。星号表示显著差异(P（P）<0.01）。双匕首表示有显著差异(P（P）<0.01）。
图4
图4
PGC-1与PPARα相互作用。（A） 用于PPARα下拉分析的GST–PGC-1融合蛋白如图所示，其数字与PGC-1分子中的氨基酸相对应（31）。还显示了PPARγ结合所需的结构域（31）和单个LXXLL结构域的位置。描述GST下拉分析结果的放射自显影35S标记的PPARα和几个GST–PGC-1融合蛋白或单独存在DMSO载体（−）或PPARα配体ETYA（+）的GST显示在每个面板的底部。放射自显影中显示的每个下拉产品下面的数字表示通过磷光成像仪分析确定的总输入百分比。显示25%的输入用于比较。（B） 下拉研究使用35S标记的PPARα缺失突变蛋白（如上图所示）和GST-PGC284（C）使用GST进行的下拉研究的结果。PGC公司190融合蛋白和LXXLL突变体GST。PGC公司LXXFF公司.
图5
图5
PGC-1协同激活PPARα需要完整的AF2和LXXLL基序。为了检查GST下拉相互作用研究的功能相关性，采用了哺乳动物细胞杂交系统（如上图所示）。将PPARα或PPARΔAF2融合到Gal4 DNA结合域（DBD），并与编码PGC-1的表达质粒或LXXLL基序发生突变的突变PGC-1共同转染（PGCLXXFF公司). 含有TK荧光素酶上游多重聚合的Gal4上游激活序列（UAS）的质粒三在这些实验中，TKLuc]被用作记者。在存在PPARα配体（油酸或ETYA）或载体对照的情况下进行转染。条形代表平均RLU归一化（=1.0）为Gal4DBD与表达质粒主干在载体存在下共同转染获得的值。
图6
图6
NH2-交易激活功能需要PGC-1的终端区域。（A） 图6B和7所示的反式激活研究中使用的PGC-1缺失突变体的示意图。aa，氨基酸。显示了与已知RNA结合域和富含丝氨酸精氨酸（SR）的结构域同源的区域。（B） 在油酸存在或不存在的情况下，将Gal4-PPARα与表达载体共同转染到CV-1细胞中，以获得面板A中显示的每个PGC-1缺失突变体。条形表示RLU归一化（=1.0）到（UAS）活动三TKLuc报告子与Gal4DBD和空PGC-1表达载体共转染。（C） 编码PGC-1缺失突变体的表达载体（图6A）融合到Gal4DBD，与（UAS）共转染三TKLuc报告质粒（单杂交分析）。这些值表示RLU归一化（=1.0）为Gal4DBD的值。
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