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.2000年1月；20(1):104-12.
doi:10.1128/MCB.20.104-112.2000。

Kin28是TFIIH相关的羧基末端结构域激酶，促进RNA聚合酶II mRNA加工机制的招募

C R罗德里格斯 1, E J Cho先生, M C基奥, C L摩尔, A L绿叶, S伯拉托夫斯基
附属公司

Kin28是TFIIH相关的羧基末端结构域激酶，促进RNA聚合酶II mRNA加工机制的招募

C R罗德里格斯等。 分子细胞生物学. 2000年1月.

摘要

7-甲基鸟嘌呤核苷帽在前mRNA上的共转录定位是通过将帽盖酶募集到RNA聚合酶II的磷酸化羧末端结构域（CTD）来介导的。免疫印迹表明，盖帽酶鸟苷酰转移酶（Ceg1）通过与CTD的相互作用在体内稳定，丝氨酸5（CTD七肽共识YSPTSPS内磷酸化的主要位点）尤其重要。我们试图确定负责覆盖酶靶向的CTD激酶。候选激酶Kin28-Ccl1、CTDK1和Srb10-Srb11可以磷酸化谷胱甘肽S-转移酶-CTD融合蛋白，从而使封盖酶能够在体外结合。然而，kin28突变等位基因导致体内Ceg1水平降低，并显示出与突变Ceg1等位基因的遗传相互作用，而srb10或ctk1缺失没有。因此，只有TFIIH-相关的CTD激酶Kin28对于体内合适的酶靶向性似乎是必要的。有趣的是，在kin28突变体中，多聚腺苷酸化因子Pta1的水平也降低，而其他几个多聚腺苷酸化因子保持稳定。酵母提取物中的Pta1与磷酸化的CTD特异性结合，表明这种相互作用可能介导多聚腺苷化和转录的偶联。

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图1
图1
体外各种激酶的CTD磷酸化允许Ceg1结合。携带GST-CTD的谷胱甘肽琼脂糖用[γ]磷酸化-32P] ATP通过各种激酶。通道：1，无激酶；2、Kin28-Ccl1；3、Srb10-Srb11；4、CTDK1；酪蛋白激酶1。磷酸化GST-CTD[GST-CTD（P）]和非磷酸化GST-CTD谷胱甘肽-甘露糖珠与Ceg1和Cet1孵育。这些珠子被制成颗粒，并被广泛清洗。用H14单克隆抗体通过放射自显影[GST-CTD（*P）]和免疫印迹[α-CTD（P）]检测GST-CTD的磷酸化。用抗GST抗体免疫印迹法检测GST-CTD和GST-CTD（P）。通过酶-GMP形成自射线图（Ceg1-*pG）和抗Ceg1抗体的免疫印迹（α-Ceg1）检测颗粒中的封盖酶。
图2
图2
金28突变体显示与ceg1-250。金28结合CEG1公司和ceg1-250型pRS314、YCplac22洗牌后-金28，pRS314-ha金28(T17D型)，pRS314-ha金28(K36A公司)、YCplac22-kin28-16型和pRS314-ha金28(T162A型)分别插入YSB626和YSB627。通过检测OD的1:8稀释度来比较双突变体的生长600=0.2在30°C的−Leu−Trp+FOA合成完整培养基平板上培养2天。
图3
图3
CTD磷酸化和Ceg1在CTD截短和CTD激酶突变体中受到影响。从30°C下生长6 h的菌株中制备全细胞提取物。用B3[α-CTD（P）]、抗Ceg1和抗Cet1抗体的免疫印迹法对每种菌株的80毫克提取物进行分析。车道：1条，野生型，PY469；2,ceg1-250型，YSB491；3中，ctk1型Δ，YSB653；4,斯里兰卡10Δ，YSB652；5,rpb1Δ101（CTD截断，11个野生型七肽重复），N398；6至9，FOAR（右）洗牌产生的菌株金28突变体(T17D型,K36A公司, -16、和T162A型，分别）转化为YSB626，如图2的图例所述。
图4
图4
Ceg1蛋白用野生型Rpb1恢复。从30°C下生长6小时的菌株中制备全细胞提取物。用B3[α-CTD（P）]、抗Ceg1和抗Cet1抗体的免疫印迹法对每种菌株的80毫克提取物进行分析。车道：1条，野生型，PY469；2,ceg1-250型，YSB491；3至6，rpb1Δ101（CTD截断，11个野生型七肽重复），N398仅用载体转化（pRS316），RPB1型（pRP112），pRS316-CEG1公司和pRS316-大学英语一级分别是。
图5
图5
丝氨酸5对限制酶的募集至关重要。转速b1结合CEG1公司和ceg1-250型仅在重组Leu2标记的载体（pRS315）时，RPB1型（野生型CTD，26重复；pRP114），rpb1号机组(CTD公司Δ）[a CTD截断突变体，10个重复；pY1WT（10）]，rpb1号机组(S2A公司)[pY1A2（8） 重量（7）]，rpb1号机组(5安)[第1A页5（5） 重量（7）]，rpb-15型,rpb1-18号机组、和rpb1-19号机组分别接入N418和YSB516。rpb1号机组通过在−Leu+FOA培养基上生长分离突变体。（A） 从30°C下生长6小时的菌株中制备全细胞提取物。用B3[α-CTD（P）]、抗Ceg1和抗Cet1抗体的免疫印迹法对每种菌株的80毫克提取物进行分析。车道：1条，野生型，PY469；2,ceg1-250型，YSB491；3至5，FOAR（右） CEG1转1洗牌突变体rpb1号机组(CTD公司Δ）[10次重复，pY1WT（10）]，rpb1号机组(S2A公司)[第1A页2（8） 重量（7）]，以及rpb1号机组(5安)[pY1A5（5） WT（7）]。（B） 的增长rpb1号机组通过在30°C的−Leu+FOA合成完整培养基平板上定位2天来比较突变体。
图6
图6
3′加工因子Pta1和磷酸化CTD之间的相互作用。（A） Pta1蛋白水平降低金28突变菌株。从30°C下生长6小时的菌株中制备全细胞提取物。用B3[α-CTD（P）]、抗Cft1、抗Pta1、抗Rna15和抗Hrp1抗体的免疫印迹法对每种菌株的80毫克提取物进行分析。车道：1条，野生型，PY469；2,ceg1-250型，YSB491；3中，ctk1型Δ，YSB653；4,斯里兰卡10Δ，YSB 652；5,rpb1Δ101（CTD截断，11个野生型七肽重复），N398；6至9，FOAR（右）洗牌产生的菌株金28突变体(T17D型,K36A公司, -16、和T162A型如图2图例所示。（B） Pta1特异性地保留在磷酸化CTD上。部分纯化的多聚腺苷化因子与GST（1、4和7道）、未磷酸化GST-CTD融合蛋白（2、5和8道）或磷酸化GST-CTD（P）（3、6和9道）孵育。将小球制成丸并清洗，用抗Pta1抗体免疫印迹法测定结合蛋白。CFI和CFII车道为积极控制。
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