Helicobacter pylori rocF is required for arginase activity and acid protection in vitro but is not essential for colonization of mice or for urease activity

doi:10.1128/JB.181.23.7314-7322.1999

.1999年12月；181(23):7314-22.

doi:10.1128/JB.181.23.7314-7322.1999。

幽门螺杆菌rocF对体外精氨酸酶活性和酸保护是必需的，但对小鼠定植或脲酶活性不是必需的

D J麦基¹, F J拉德克利夫, G L门兹, R L费雷罗, H L莫布里

附属公司

PMID： 10572136
PMCID公司：下午103695
内政部： 10.1128/JB.181.23.7314-7322.1999年

幽门螺杆菌rocF对体外精氨酸酶活性和酸保护是必需的，但对小鼠定植或脲酶活性不是必需的

D J McGee博士等。 J细菌. 1999年12月.

.1999年12月；181(23):7314-22.

doi:10.1128/JB.181.23.7314-7322.1999。

作者

D J麦基¹, F J拉德克利夫, G L门兹, R L费雷罗, H L莫布里

附属

¹马里兰州大学医学院微生物与免疫学系，美国马里兰州巴尔的摩21201。dmcge001@umaryland.edu

PMID： 10572136
PMCID公司：项目编号103695
内政部： 10.1128/JB.181.23.7314-7322.1999年

摘要

幽门螺杆菌尿素循环的精氨酸酶将L-精氨酸水解为L-鸟氨酸和尿素。幽门螺杆菌尿素酶将尿素水解为二氧化碳和铵，从而中和酸。这两种酶都参与了幽门螺杆菌的氮代谢。由于幽门螺杆菌中的精氨酸酶是脲酶的代谢上游，已知脲酶是细菌定植动物模型所必需的，因此在体外和体内研究精氨酸酸酶在幽门螺杆杆菌生理学中的作用。克隆了与编码精氨酸酶的枯草芽孢杆菌rocF基因同源的幽门螺杆菌基因hp1399，并用两种不同的结构体236-2和rocF:：aphA3构建了三株幽门螺杆杆菌的等位基因交换突变体。与野生型（WT）菌株相比，所有rocF突变株均缺乏精氨酸酶活性，丝氨酸脱水酶活性降低，丝氨酸脱氢酶活性是一种产生铵的酶活性。与幽门螺杆菌WT菌株26695相比，rocF:：aphA3突变株对酸暴露的敏感性约为1000倍。与WT相比，rocF:：aphA3突变体的酸敏感性并没有通过添加L-精氨酸而逆转，并且产生了大约10000倍的活力差异。这两个菌株的脲酶活性相似，当添加外源尿素时，两个菌株都能很好地耐受酸暴露，这表明体外脲酶活性不需要rocF。最后，幽门螺杆菌小鼠适应株SS1和236-2 rocF等基因突变株同样能很好地定殖小鼠：分别为9只小鼠中的8只和11只小鼠中9只。然而，SS1菌株的rocF:：aphA3突变体略微减少了定殖（4/10只小鼠）。从这些小鼠中恢复的幽门螺杆菌的几何平均水平（log（10）CFU）分别为6.1、5.5和4.1。因此，幽门螺杆菌rocF是精氨酸酶活性所必需的，并且对体外的酸保护至关重要，但对小鼠的体内定殖或脲酶活性不是必需的。

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数字

图1
的示意图*岩石（rocF）*本研究中使用的结构。pBS公司-*rocF:：aphA3*和pILL236-2包含*第3页*卡那霉素抗性盒。粗箭头表示转录的方向。限制性内切酶缩写：B，巴姆你好；C、，克拉我；E、，生态RI；H、，欣dIII；P、，*精神分裂症*I.粗线是指矢量序列。符号‘ 和’ 分别指5′端或3′端的截断+1表示编码区中的第一个核苷酸*岩石（rocF）*细箭头表示用于PCR确认和测序的引物*岩石（rocF）*突变体。引物序列见表1，PCR策略见表2，结果见图2B。

图2
确认*岩石（rocF）*等位基因交换突变体*幽门螺杆菌*（A）Southern blot分析*幽门螺杆菌*WT和*rocF:：aphA3*等基因突变。染色体DNA（～6μg）来自*幽门螺杆菌*26695和26695rocF:：aphA3被消化了艾娃并按照材料和方法中的说明进行处理。用卡那霉素盒（1.2 kb）或部分*岩石（rocF）*基因（240 bp欣dIII片段）。请注意，当使用*岩石（rocF）*如预期，突变体的分子量增加了～1.2kb。（B） PCR分析*岩石（rocF）*的突变体*幽门螺杆菌*所使用的引物对策略如表2所示。车道（数量，*幽门螺杆菌*菌株，引物对）：1，N6 WT，R13和K4；2、N6rocF:：aphA3、R13和K4；3、N6 236-2、R13和K4；4、SS1 WT、R13和K4；5，SS1rocF:：aphA3、R13和K4；6、SS1 236-2、R13和K4；7、N6重量、R5和K8；8，N6rocF:：aphA3、R5和K8；9、N6 WT、R17和K8；10、N6 236-2、R17和K8；11、SS1 WT、R17和K5；12，SS1rocF:：aphA3R17和K5；13、SS1 WT、R17和K8；14、SS1 236-2、R17和K8；和M，1-kb标记（Gibco BRL）。

图3
WT和*rocF:：aphA3*的突变体*幽门螺杆菌*26695转酸。*幽门螺杆菌*用0.1 M柠檬酸-磷酸盐缓冲液处理菌株，pH值为5 mM尿素存在或不存在时的指示值。30分钟后，对细菌进行清洗、稀释和培养，以获得活的CFU。显示了六个实验的代表性实验，每个实验重复进行。数据显示为日志₁₀CFU被杀死，这是日志₁₀CFU存活时间=0分钟(吨₀, 10⁸到10⁹)减去日志₁₀CFU在规定条件下存活30分钟。

图4
精氨酸拯救WT幽门螺杆菌26695但不是等基因*rocF:：aphA3*酸暴露引起的突变。*幽门螺杆菌*用0.1 M柠檬酸-磷酸盐缓冲液处理菌株，pH值为10 mM（有或无）我-精氨酸，我-胍丁胺或20 mM尿素。30分钟后，对细菌进行清洗、稀释和培养，以确定活的CFU。显示了由三个实验组成的代表性实验，每个实验重复进行。日志₁₀被杀死的CFU如图3的图例所示。

图5
通过WT和*岩石（rocF）*的突变体*幽门螺杆菌*SS1.通过定量培养计数接种后1个月获得的样本的细菌负荷。检测极限用虚线表示。虚线上的符号表示该菌株未能在小鼠中繁殖。还显示了尿素酶阳性（固体符号）和阴性（开放符号）胃活检样本。每个点对应于单个鼠标的确定。实线表示平均对数₁₀每克组织中活CFU的数量。在第二个实验中（图中未显示定量数据），感染WT的小鼠数量为236-2岩石（rocF）突变体，以及*rocF:：aphA3*突变株分别为64%（7/11）、100%（10/10）和56%（5/9）。

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