A general strategy to enhance the potency of chimeric transcriptional activators

doi:10.1073/pnas.96.24.13898

。1999年11月23日；96(24):13898-903.

doi:10.1073/pnas.96.24.13898。

增强嵌合转录激活物效力的一般策略

S纳特桑¹, E Molinari公司, V M里维拉, R J瑞克尔斯, M吉尔曼

附属公司

PMID： 10570170
预防性维修识别码：项目经理24162
内政部： 10.1073/pnas.96.24.13898

增强嵌合转录激活物效力的一般策略

S纳特桑等。美国国家科学院程序。 1999。

。1999年11月23日；96（24）：13898-903。

doi:10.1073/pnas.96.24.13898。

作者

S纳特桑¹, E Molinari公司, V M里维拉, R J瑞克尔斯, M吉尔曼

附属

¹ARIAD Gene Therapeutics Incorporated，26 Landsdowne Street，Cambridge，MA 02139，USA美国马萨诸塞州剑桥市ARIAD基因治疗公司。natesans@ariad.com

PMID： 10570170
预防性维修识别码：项目经理24162
内政部： 10.1073/pnas.96.24.13898

摘要

提高转录激活剂效力的努力通常是不成功的，因为激活剂在哺乳动物细胞中的低表达限制了它们向目标启动子的传递。在这里，我们报告了嵌合激活剂的有效性可以通过将其表达为非共价四聚体束而显著提高。与简单的单体激活剂相比，捆绑激活域在激活报告基因方面更为有效，这可能是因为在类似的表达水平下，传递到目标启动子的激活域数量最多为4倍。这些捆绑的激活域也比激活域在同一多肽链中串联重复的蛋白质更有效，因为这些蛋白质表达非常差，因此不能有效传递。这些观察结果表明，必须将激活域的数目限制在启动子上才能激活，超过这个阈值，启动子的活性只是被限制的激活子数目的函数。我们表明，捆绑可以实际用于提高哺乳动物双杂交分析的灵敏度，从而能够检测微弱的相互作用或表达不良的蛋白质之间的相互作用。当调节蛋白的表达水平受到限制时，捆绑还可以显著提高小分子调节基因表达系统的性能，这在基因治疗应用中可能会遇到。

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数字

图1
有效激活域的多重化增加了它们的特异性但会降低其细胞内浓度。(A类)指示的GAL4激活剂质粒（每个100ng）为引入HT1080B电池中，可稳定集成*SEAP公司*受控制的报告基因5GAL4-结合位点。重组蛋白GV和GV2含有GAL4与VP16激活的一个和两个拷贝融合的DNA结合结构域域。GS、GS2、GS3和GS4包含融合的GAL4 DNA结合域具有一个、两个、三个和四个p65激活域拷贝，分别是。G表示仅GAL4 DNA结合域。平均值显示分泌到培养基中的SEAP活性（±SD）。(B类和C类)蛋白质印迹分析转染细胞的总细胞提取物。对薄膜进行了探测首先用抗血凝素检测转染蛋白(B类)然后用抗p65抗体确认每条通道中的蛋白质含量大致相等(C类)。

图2
用于增加传递到启动子的激活域。(A类)在基本方法，两个融合蛋白，一个包含GAL4 DNA结合融合到FKBP12的结构域，另一个包含p65活化结构域与FRB融合，在细胞中表达。添加雷帕霉素导致每个DNA-结合招募一个激活域结构域单体。(B类)将多个FKBP融合到DNA结合域允许雷帕霉素招募多重激活每个DNA-结合域单体的结构域。(C类)添加乳糖阻遏物四聚结构域对FRB活化的作用产生RLS的结构域融合蛋白允许雷帕霉素招募四个每个FKBP的激活域融合到DNA结合域。这个启动子激活域的数目可以增加通过将更多FKBP部分连接到DNA结合域和/或乘以激活剂的结合位点数。理论上，可以将多达160个激活结构域递送到启动子通过处理表达GF4的细胞，含有5个GAL4结合位点和RLS与雷帕霉素的融合蛋白。实际激活次数传递到报告基因启动子的结构域*在里面活泼地*通过使用捆绑策略尚未确定。

图3
稳定整合基因的表达水平与与启动子结合的激活域的数量和强度。(A类)所示的DNA结合域和活化结构域融合蛋白（参见*材料和方法*对于使用缩写）转染到携带稳定整合*SEAP公司*报告基因置于控制五个GAL4结合位点。在所有情况下，SEAP表达式绘制了接受100 ng激活域的培养物的值表达质粒，瞬时给出峰值表达值转染细胞，并在稳定状态下略低于峰值水平转染细胞系。SEAP的背景活动（24个SEAP单位）是在绘图之前从每个值中减去。在这个实验中，表达GF1+RS融合蛋白组合产生四种雷帕霉素存在时，SEAP单位高于背景水平。(B类)DNA结合域和激活域表达质粒转染HT1080B细胞。在所有情况下，培养基中分泌的SEAP活性平均值所示为添加10 nM雷帕霉素（±SD）。蛋白质印迹分析抗血凝素抗体的总细胞裂解物允许细胞中转录因子组分水平的评估。

图4
RLS束的转录活性取决于多次激活，但不使用捆绑包中的FRB域。(A类)组成的图解说明RLS和RLS增加时激活含结构域蛋白束细胞内LS或L区的浓度共存。(B类) (上部)GF1编码质粒（20 ng）单独或与100 ng RLS联合感染LS或L区域的浓度。用10nM刺激细胞雷帕霉素和培养基中的SEAP活性在18小时后测定转染后。分泌到添加雷帕霉素后的培养基如图所示（±SD）。(下部)用Western blot分析法检测裂解产物12CA5抗体。

图5
刺激基因所需的激活剂阈值可以通过提高交付效率来减少表达启动子的激活域。(A类)图表显示转录激活物编码序列稳定整合到HT1080电池。激活域与DNA结合域融合通过将蛋白质相对较弱的控制下的相应编码序列Rous肉瘤病毒启动子。内部核糖体进入序列（IRES）源于脑心肌炎病毒。复合材料DNA-结合域融合蛋白ZFHD F3已在前面描述(5). (B类)HT34和HT35细胞池用雷帕霉素在培养基中24小时的指示浓度在此期间分泌到培养基中的SEAP活性为测量。在所有情况下，分泌到添加雷帕霉素24小时后的培养基显示（±SD）。(C类)蛋白质印迹分析用抗p65抗体检测HT34和HT35细胞。RLS和RS蛋白质以非常低的水平表达，并显示为非常微弱的条带。

图6
激活域融合蛋白的非共价捆绑增强哺乳动物细胞中蛋白质相互作用的检测。(A类)双杂交分析的图示含有靶标和激活物的捆绑融合蛋白域。GAL4 DNA结合域与c-Cbl融合（G-Cbl在C类)与靶蛋白SH3相互作用融合到p65激活域（SH3-S或V inC类)乳糖阻遏物四聚结构域p65激活域序列（SH3-LS英寸C类). (C类) (上部)HT1080B电池承载*水上飞机*报告基因置于用100 ng的指示表达质粒。分泌的SEAP活性平均值转染后24小时注入培养基中（±SD）。(下部)制备提取物的Western blot分析抗血凝素探针检测瞬时转染细胞抗体。

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