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。1999年11月15日；147(4):699-706.
doi:10.1083/jcb.147.4.699。

分裂与融合：Dnm1p和Fzo1p拮抗性调节线粒体形状

H Sesaki先生 1, R E延森
附属公司

分裂与融合：Dnm1p和Fzo1p拮抗调节线粒体形状

H芝麻等。 J细胞生物学。 。

摘要

在酵母中，线粒体分裂和融合在生长、交配和产孢过程中受到高度调节，但控制这些活动的机制尚不清楚。利用一种新的筛选方法，我们分离出线粒体失去正常结构的突变体，而不是形成一个由相互连接的小管组成的大网络。这些线粒体分裂缺陷的突变体都携带DNM1的突变，DNM1是一种定位于线粒体的动力相关蛋白。我们还分离出含有大量线粒体片段的突变体。这些突变体在FZO1中有缺陷，FZO2是线粒体融合所需的基因。令人惊讶的是，我们发现在dnm1 fzo1双突变体中，正常的线粒体形状得到了恢复。在dnm1 fzo1细胞中诱导Dnm1p表达导致线粒体快速断裂。我们认为dnm1突变体在线粒体分裂中有缺陷，这是一种对抗融合的活性。因此，我们的结果表明线粒体的形状通常由分裂和融合之间的平衡控制，这分别需要Dnm1p和Fzo1p。

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数字

图1
图1
线粒体形状缺陷的突变体。（A） 筛选线粒体形态缺陷突变体。（a） COX4-GFP显示线粒体。（b–d）使用微量移液管分离单个突变体。箭头指示潜在的突变细胞。（B） 野生型YHS2和每类突变体的代表在YPD中生长到对数期，然后用1μg/ml 3,3′-二己基氧基碳菁（DiOC）染色6)（分子探针）增强线粒体荧光。显示了细胞的共焦图像。（C）dnm1Δ细胞包含一个相互连接的线粒体网络。野生型（BY4733）和等基因型dnm1Δ表达COX4-GFP（pHS12）的细胞在YPGal中生长至对数期。显示了荧光（COX4-GFP）和微分干涉对比（DIC）图像。棒材：（A）10μm；（B） 2微米；（C） 3微米。
图2
图2
dnm1Δfzo1Δ细胞有正常形状的线粒体。野生型（BY4733）和等基因缺失菌株(dnm1Δ,fzo1Δ、和dnm1Δfzo1Δ)表达COX4-GFP（pHS12），在YPGal中生长到对数相，并通过荧光显微镜检查。棒材，2μm。
图3
图3
Dnm1p的表达导致线粒体断裂dnm1Δfzo1Δ细胞。dnm1Δfzo1Δ携带pCOX4-GFP（pHS12）和pGAL1-DNM1-HA（pHS15）的细胞在棉子糖培养基中预培养，离心并再次悬浮至OD600在半乳糖培养基（SGS）中诱导Dnm1p-HA表达。检查细胞线粒体形状(n个=100）或用于在指定的时间点制备总蛋白。（A） 线粒体形态分为以下四组：小管（○）、部分碎片小管（□）、碎片（▴）和其他（⋄）。（B） 按照描述提取总蛋白（Yaffe and Schatz 1984），并使用HA表位抗体（Field et al.1988）或己糖激酶（Davis，A.，未发表数据）进行Western blot分析，然后进行化学发光（Pierce）。Dnm1p-HA（+）的相对量在A中进行量化和绘制。
图4
图4
Dnm1p-GFP优先定位于线粒体分裂位点。（A）dnm1Δ用表达Dnm1p-GFP的pHS20转化YHS19菌株。细胞在SGal培养基中生长，用0.1μM MitoTracker Red CMXRos（分子探针）标记，然后在荧光显微镜下检查。显示了在红色（Mitotracker）和绿色（GFP）通道中拍摄的合并图像。（B和C）dnm1Δfzo1Δ携带pGAL1-DNM1-GFP的二倍体细胞在YP甘油/乙醇培养基中预培养，离心并在半乳糖培养基（SGS）中培养1–2 h。然后细胞用MitoTracker染色并检测Dnm1p-GFP的线粒体定位。显示了两个具有代表性的单元格。棒材，3μm。
图5
图5
dnm1Δfzo1Δ细胞线粒体融合有缺陷。（A）材料表达CS1-GFP的细胞镀锌1pCLbGFP启动子在半乳糖培养基（SGS）中生长。材料缺乏质粒的α细胞在葡萄糖培养基（YPD）中生长。材料携带指示基因型的a细胞和α细胞在YPD上交配3.5小时，然后用0.1μM MitoTracker染色。MitoTracker和GFP在含有中间芽（星号）的代表性合子中的分布如图所示。箭头表示三簇线粒体缺乏CS1-GFPfzo1Δ合子。（B） 野生型和dnm1Δfzo1ΔMATa细胞用溴化乙锭处理以诱导mtDNA丢失（Fox等人，1991年），用pCLbGFP转化，然后在含半乳糖培养基（SGS）中生长。野生型和dnm1Δfzo1ΔMAT含有mtDNA但缺乏质粒的α细胞在YPD中生长。细胞在YPD上交配并用0.5μg/ml 4′，6-二氨基-2-苯基吲哚（DAPI；分子探针）染色。野生型细胞间或野生型细胞与野生型细胞之间交配形成的典型合子dnm1Δfzo1Δ图中显示了突变体。显示荧光（GFP或DAPI）、微分干涉对比度（DIC）和合并图像。交配混合物也在YPD上在30°C的温度下再培养24小时，显示出代表性二倍体。N表示细胞核DNA染色。棒材，3μm。
图5
图5
dnm1Δfzo1Δ细胞线粒体融合有缺陷。（A）材料表达CS1-GFP的细胞镀锌1pCLbGFP启动子在半乳糖培养基（SGS）中生长。材料在葡萄糖培养基（YPD）中培养缺乏质粒的α细胞。材料将携带所示基因型的a和α细胞在YPD上交配3.5小时，然后用0.1μM MitoTracker染色。显示了MitoTracker和GFP在含有中间芽（星号）的代表性合子中的分布。箭头表示三簇线粒体缺乏CS1-GFPfzo1Δ合子。（B） 野生型和dnm1Δfzo1ΔMATa细胞用溴化乙锭处理以诱导mtDNA丢失（Fox等人，1991年），用pCLbGFP转化，然后在含半乳糖培养基（SGS）中生长。野生型和dnm1Δfzo1ΔMAT含有mtDNA但缺乏质粒的α细胞在YPD中生长。细胞在YPD上交配并用0.5μg/ml 4′，6-二氨基-2-苯基吲哚（DAPI；分子探针）染色。野生型细胞间或野生型细胞与野生型细胞之间交配形成的典型合子dnm1Δfzo1Δ图中显示了突变体。显示荧光（GFP或DAPI）、微分干涉对比度（DIC）和合并图像。交配混合物也在YPD上在30°C的温度下再培养24小时，显示出代表性二倍体。N表示细胞核DNA染色。棒材，3μm。
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