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.1999年9月28日；96(20):11259-64.
doi:10.1073/pnas.96.20.11259。

人类呼吸道合胞病毒M2-2蛋白是参与RNA复制和转录平衡的调节因子

A伯明翰 1, P L柯林斯
附属公司

人类呼吸道合胞病毒M2-2蛋白是参与RNA复制和转录平衡的调节因子

A伯明翰等人。 美国国家科学院程序. .

摘要

人类呼吸道合胞病毒（RSV）的M2 mRNA包含两个重叠的ORF，编码转录抗终止蛋白（M2-1）和功能未知的90aa M2-2蛋白。恢复了活的重组RSV，其中M2-2的表达被消融，确定它是体外生长不需要的辅助因子。缺乏M2-2的病毒在体外生长的效率低于野生型亲本，在最初的2-5天内滴度降低了1000倍，到7-8天时滴度降低了10倍。与野生型病毒相比，M2-2基因敲除病毒在细胞内的RNA积累，基因组RNA减少了3-4倍或更多，mRNA增加了2-4倍或更多。作为RSV主要中和和保护抗原的F和G糖蛋白的合成与mRNA的合成成比例增加。在感染野生型RSV的细胞中，mRNA积累在感染后约12-15小时显著增加，然后趋于稳定，而在感染M2-2敲除病毒的细胞中积累继续增加。这些发现表明，M2-2介导了从转录到RNA复制的调节“转换”，这种转换提供了最初的高水平的mRNA合成，随后RNA合成程序发生了转变，有利于基因组RNA进行病毒粒子组装。关于疫苗开发，M2-2基因敲除具有非常理想的表型，其中病毒生长减弱，而基因表达随之增加。

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数字

图1
图1
建造Nde公司I和K5突变，中断M2 ORF2。根据ORF2中的氨基酸编码，核苷酸序列为阳性，并被阻断为三联体。括号中是相对于完整的15223-nt重组抗原的核苷酸位置；其他数字是指194-aa M2-1蛋白质或90-aa M2-2蛋白质中的氨基酸位置。(A类)两个重叠M2 ORF的示意图。在顶部的序列中，M2–2的三个潜在翻译起始位点被划线，其编码的蛋氨酸残基被装箱。ORF1的终止密码子也带有下划线。图中显示了用于诱变和克隆的限制位点。(B类)建造Nde公司我变异了。这个Nde公司位于M2-2 ORF中间8299位的I位点被打开、填充并重新定位，这给M2-2的密码子47增加了2 nt（小写）。这将寄存器转移到另一个读取框，该框对编码非M2–2氨基酸的18个额外密码子开放（带下划线）。(C类)K5突变的构建。该序列显示ORF1和ORF2之间的连接，如A类。wt父代中的潜在ORF2起始密码子带有下划线，ORF1终止密码子也带有下划线。K5中的核苷酸变化高于其wt对应物。ORF2的三个潜在起始密码子（密码子1、3和7）被改为ACG，这对ORF1中的氨基酸编码没有影响。ORF2的下一个潜在蛋氨酸起始位点是密码子30。此外，终止密码子被引入M2-1终止密码子下游的所有三个框架中。结合起来，这些突变具有将M2–2氨基酸12从K变为N并终止于密码子13的作用。
图2
图2
这个Nde公司I和K5突变在重建的微复制子系统中都会破坏M2-2的抑制功能。(A类)同时用vTF7–3感染HEp-2细胞（每个细胞5个斑块形成单元），并用编码负义C2小基因组cDNA的质粒（200 ng）和支持质粒（N，400 ng；P，200 ng；L，100 ng/孔六孔培养皿）转染，并补充既不表达M2 ORF的pTM构建体（80 ng）（泳道2），M2-2（车道3）、M2-1（车道4）、M2-1+2（车道5）或包含Nde公司I（车道6）或K5（车道7）突变。通道1含有来自缺乏L的反应的RNA，是阴性对照。感染后24-26小时内，细胞每毫升暴露2μg放线菌素D（21）。感染后48小时，分离细胞内总RNA并在甲醛凝胶上电泳，以进行Northern印迹分析（16）。将印迹杂交到一个负义CAT特异性核糖探针上，以检测mRNA和小抗原基因。(B类)如上所述，用编码阳性C4小抗原的质粒转染HEp-2细胞，该质粒由N、P和L质粒补充，如A类增加表达M2–1+2（通道2、3和4）、M2–1（通道5、6和7）、M2-2（通道8、9和10）或M2-1+2（包含Nde公司I（11、12和13道）或K5（14、15和16道）突变。细胞内总RNA通过Northern blots与阳性CAT特异性核糖探针杂交来检测基因组RNA。
图3
图3
rA2的细胞致病性-Nde公司将I和rA2-K5病毒与rA2-wt进行比较。HEp-2细胞模拟感染或以1的moi感染指示的病毒，培养指定的时间，并拍照（×10）。由于曝光不同，48小时的显微照片更暗。在48和72小时时，两种突变病毒中明显存在大的合胞体，而在24小时时，以及在相同的三个时间点，rA2-wt感染细胞中明显存在较小的合胞。
图4
图4
rA2-wt，rA2的生长动力学-Nde公司一、 和rA2-K5。水平虚线表示可检测性的下限。(A类)单步生长动力学。HEp-2细胞感染rA2-wt，rA2-恩德一、 或rA2-K5，moi为5，在感染和快速冷冻后的指定时间采集整个培养基覆盖物。通过噬菌斑测定法测定病毒滴度。(B类)多周期生长动力学。HEp-2细胞被上述病毒感染三次，每细胞感染量为0.01个斑块形成单位。在感染后的指定时间，去除整个培养基覆盖层并快速冷冻。细胞在PBS中清洗两次，并用新鲜培养基培养。显示了通过菌斑试验测定的平均病毒滴度（带误差条）。
图5
图5
RNA复制和转录的Northern blot分析。感染rA2-wt的HEp-2细胞(a、 d日，以及克)，rA2-Nde公司我(b条,e、，和小时)和rA2-K5(c、 f、，和我)从图4所示的单周期生长曲线实验中每隔3小时采集一次（车道1-10）A类分离细胞内总RNA并进行Northern blot分析。印迹与一个负义N特异性核糖探针杂交(a–c)，一种负义F-特异性核糖探针(d–f日)或阳性F特异性核糖探针(g–i类). 单顺反子mRNA、多顺反子读入mRNA、抗原组和基因组RNAs被指出。
图6
图6
感染rA2-wt的HEp-2细胞中F和G糖蛋白积累的Western blot分析(A类和C类)或rA2-Nde公司我(B类和天). 在指定的时间采集细胞，在变性和还原条件下对细胞总蛋白进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，转移到硝化纤维素（5）中，并与兔抗肽血清反应以对抗F的细胞质结构域(A类和B类)或G(C类和天)蛋白质。用辣根过氧化物酶结合的山羊抗兔IgG检测结合抗体，并通过增强化学发光（Amersham Pharmacia）观察结合抗体。
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