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.1999年8月31日；96(18):10355-60.
doi:10.1073/pnas.96.18.10355。

野生型和突变型p53细胞中p53和DNA拓扑异构酶I之间的相互作用受到不同的调节

C戈伯特 1, 斯科拉达诺夫斯基, A K拉森
附属公司

野生型和突变型p53细胞中p53和DNA拓扑异构酶I之间的相互作用受到不同的调节

C戈伯特等。 美国国家科学院程序. .

摘要

DNA拓扑异构酶I是一种参与转录、重组和DNA损伤识别的核酶。先前的研究表明拓扑异构酶I与肿瘤抑制蛋白p53直接相互作用。p53是一种转录因子，通过与特定DNA序列结合来激活某些基因。我们现在报道，拓扑异构酶I可以在体外被潜伏和激活的野生型p53以及几种突变和截短的p53蛋白刺激，这表明序列特异性DNA结合和拓扑异构酶I的刺激是p53的不同特性。这些分析还表明，拓扑异构酶I在p53上的结合位点在氨基酸302和321之间。在活细胞中，p53和拓扑异构酶I之间的相互作用强烈依赖于p53的状态。在含有野生型p53的MCF-7细胞中，这两种蛋白之间的关联在空间和时间上受到严格调控，并且只在基因毒性应激的短暂时期发生。与之形成鲜明对比的是，这两种蛋白在具有突变p53的HT-29细胞中构成相关。鉴于拓扑异构酶I识别DNA损伤以及导致非法重组的能力，这些发现对细胞应激反应和基因组稳定性具有重要意义。

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数字

图1
图1
拓扑异构酶I对p53序列特异性结合的影响，通过电泳迁移率测定测定。所有通道均含有携带GADD45启动子p53结合位点的放射性标记寡核苷酸。在1μg PAb 421（车道3、5、7和9）或500 ng拓扑异构酶I（车道4、5、8和9）存在的情况下，车道2-5和6-9分别含有500 ng p53或500 ng p53-GST。作为对照，在没有p53的情况下单独培养寡核苷酸（lane1），与拓扑异构酶I（lane 10）、PAb 421（lane 11）或同时存在拓扑异构酶I和PAb 422（lane12）。
图2
图2
潜在和激活的野生型p53以类似的方式刺激拓扑异构酶I的催化活性。在拓扑异构酶I（45、22、15、11、9.5和2 ng）浓度降低的情况下，单独培养超冷却质粒DNA（4–10道）、300 ng的p53（11–17道）或300 ng的p53和1μg的PAb 421（18–24道）。作为对照，质粒DNA在没有拓扑异构酶I的情况下单独培养（第1道）、与p53（第2道）或与p53和PAb 421（第3道）培养。S、 超螺旋质粒DNA；R、 松弛的DNA。
图3
图3
潜在和激活的野生型p53以类似的方式刺激拓扑异构酶I的DNA切割活性。在拓扑异构酶I（400、200、100、50、25和12.5 ng）浓度降低的情况下，单独培养末端标记的质粒DNA（5–10道）、300 ng的p53（11–16道）或300 ng的p53和1μg的PAb 421（17–22道）。作为对照，在没有拓扑异构酶I的情况下单独培养底物DNA（第1道）、p53（第2道）、PAb 421（第3道）或同时培养p53和PAb 422（第4道）。开放箭头表示完整底物DNA的迁移，而括号则表示存在和不存在p53时DNA断裂不同的区域。
图4
图4
将p53转染到p53-null细胞伴随着拓扑异构酶I活性的增加。从不表达p53（S6细胞）或突变p53（37°C下的LTR13细胞）的M1细胞制备核提取物。拓扑异构酶I的催化活性是通过在核提取物浓度降低的情况下超螺旋DNA的松弛来确定的。S、 超螺旋DNA；R、 放松DNA。
图5
图5
野生型或突变型p53细胞中p53的免疫定位。用DNA损伤剂丝裂霉素C（10μg/ml）处理MCF-7乳腺癌细胞（wt p53）和HT-29结肠癌细胞（突变型p53）4小时，然后在无药培养基中追踪20小时。用PAb1801单克隆抗p53抗体和FITC-偶联抗小鼠次级抗体免疫组织化学法测定p53的细胞定位。
图6
图6
丝裂霉素C处理细胞核提取物的Western blot分析。用DNA损伤剂丝裂霉素C（10μg/ml）处理MCF-7乳腺癌细胞（wt p53）和HT-29结肠癌细胞（突变型p53）4小时，然后在无药培养基中追踪20小时。MCF-7细胞核提取物(A类和C类)和HT-29细胞(B类)用针对p53的抗体进行蛋白质印迹分析(A类和B类)或拓扑异构酶I(C类).
图7
图7
丝裂霉素C处理细胞核提取物中拓扑异构酶I的催化活性。MCF-7乳腺癌细胞（wt p53，A类和B类)和HT-29结肠癌细胞（突变型p53，C类和D类)用DNA损伤剂丝裂霉素C（10μg/ml）治疗4小时，然后在无药培养基中追踪20小时。通过超螺旋DNA的弛豫测定了部分纯化核提取物的不同稀释液的拓扑异构酶I活性。将未经处理的对照细胞与两种处理细胞的催化活性进行比较(A类和C类)或用处理过的细胞在无药物培养基中孵育20小时(B类和D类).
图8
图8
拓扑异构酶I和p53在丝裂霉素C处理的细胞中具有物理相关性。用DNA损伤剂丝裂霉素C（10μg/ml）处理MCF-7乳腺癌细胞（wt p53）和HT-29结肠癌细胞（突变型p53）4小时，然后在无药培养基中追踪20小时。用PAb 1801单克隆抗p53抗体处理核提取物，通过超螺旋DNA的松弛测定与p53免疫沉淀物相关的拓扑异构酶I活性。通道3-8显示了未经处理的对照细胞（通道3和6）、用丝裂霉素C处理4小时的细胞（通道4和7）或用丝裂素C处理4个小时的细胞，然后在从MCF-7细胞（通道3-5）获得的无药培养基（通道5和8）中进行20小时追踪的p53免疫沉淀物的催化活性或HT-29电池（6–8通道）。相比之下，前两个通道显示DNA底物单独迁移（通道1）或存在纯化拓扑异构酶I（通道2）。S、 超螺旋DNA；R、 放松DNA。
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