Association of influenza virus matrix protein with ribonucleoproteins

doi:10.1128/JVI.73.9.7467-7473.1999

.1999年9月；73(9):7467-73.

doi:10.128/JVI.73.9.7467-7473.1999。

流感病毒基质蛋白与核糖核蛋白的相关性

Z Ye公司¹, T刘, D P Offringa公司, J McInnis公司, 勒万多夫斯基

附属公司

隶属关系

¹美国马里兰州贝塞斯达市食品和药物管理局生物制品评价与研究中心疫苗研究与审查办公室病毒产品部儿科和呼吸道病毒病实验室，邮编：20892。yez@cber.fda.gov

PMID： 10438836
预防性维修识别码：项目经理104273
内政部： 10.1128/JVI.73.9.7467-7473.1999

流感病毒基质蛋白与核糖核蛋白的相关性

Z Ye公司等。 J维罗尔. 1999年9月.

.1999年9月；73(9):7467-73.

doi:10.1128/JVI.73.9.7467-7473.1999。

作者

Z Ye公司¹, T刘, D P Offringa公司, J McInnis公司, 勒万多夫斯基

隶属关系

¹美国马里兰州贝塞斯达市食品药品监督管理局生物制品评估与研究中心疫苗研究与审查办公室病毒产品司儿科和呼吸道病毒疾病实验室，邮编：20892。yez@cber.fda.gov

PMID： 10438836
预防性维修识别码：项目经理104273
内政部： 10.1128/JVI.73.9.7467-7473.1999

摘要

为了表征甲型流感病毒基质蛋白（M1）与核糖核蛋白（RNP）结合的位点和性质，通过缺失或定点突变改变A/WSN/33的M1，在体外表达，并允许在多种条件下附着到RNP。大约70%的野生型（Wt）M1在pH值7.0时与RNP结合，但在pH值5.0时，与RNP相关的M1不足5%。增加NaCl浓度会降低M1结合，但即使在高盐浓度（0.6 M NaCl）下，大约20%的输入M1能够与RNP结合。突变改变了潜在的M1 RNA-结合区域（碱性氨基酸101RKLKR105和氨基酸148-162的锌指基序）具有不同的影响：与Wt M1相比，氨基酸101至105的突变降低了RNP结合，但锌指基序的突变没有。RNP经RNase处理后，M1结合减少了约一半，但即使是缺乏RNA-结合区的M1突变体，只要M1的N端76个氨基酸（包含两个疏水结构域）完整，也会与RNase治疗的RNP有残余结合。向反应混合物中添加洗涤剂进一步降低了与N端76个氨基酸相关的结合，并对影响碱性氨基酸的RNA结合区的突变显示出最大的影响。数据表明，M1在A型流感病毒的组装和拆卸过程中与RNP的RNA和蛋白质组分相互作用。

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数字

图1
包含替换和缺失突变体的结构翻译的M1蛋白的示意图模型和RNA-结合活性。（A） WSN Wt和突变M1结构体的氨基酸表达序列；（B） M1蛋白的亲水性指数。

图2
（A） SDS-PAGE和放射自显影术³⁵编码WSN Wt的cDNA中的S标记M1蛋白和M1蛋白突变体；（B）体外翻译的WSN Wt和M1蛋白突变体的RNA-结合活性[³⁵S] 蛋氨酸。通过与总输入量的比较计算与M1结合的RNA的百分比[³²P] RNA。数据是至少三个独立实验的平均值，每个实验点的标准偏差低于10%（数据未显示）。

图3
纯化RNP的SDS-PAGE分析以及RNase A处理对RNP稳定性的影响。（A）如材料和方法所述，从病毒粒子中纯化M1-缺失RNP。通过SDS-PAGE（12.5%凝胶）分析RNPs和病毒粒子的蛋白质组分。（B） RNP（1 mg/ml）在37°C下以0.003至0.1 mg/ml的最终浓度用RNase A处理30分钟。RNase A处理的RNP通过120000×离心获得克通过25%的甘油和50%的甘油垫保持60分钟。收集所得微丸，并在12.5%的凝胶上通过SDS-PAGE进行分析。Lanes MW，分子量标记。

图4
低pH值对M1-RNP重组的影响。在重组分析期间，M1和RNP的重组在pH 7.0、6.0和5.0的含0.05M NaCl的缓冲液中进行。对RNP-相关的M蛋白进行放射自显影，并通过密度测定定量结合反应性。绑定活动的百分比³⁵通过与总输入量比较，计算S标记M1到RNP³⁵S-M1蛋白。数据是至少三个独立实验的平均值，每个实验点的标准偏差低于10%（数据未显示）。

图5
盐对Wt、取代和C末端截断M1s（A）和缺失M1突变体（B）的M1-RNP重建的影响。体外翻译³⁵在材料和方法中规定的不同浓度的NaCl存在下，用RNP重建S标记的M蛋白。通过与总输入相比较，量化RNP关联的百分比³⁵S-M1蛋白。数据显示了具有代表性的结合实验的结果；三个独立实验点的标准偏差低于10%（数据未显示）。

图6
RNase A预处理RNP对M1-RNP重组的影响。Wt、替换和C末端截断M1s（A）和缺失M1突变体（B）的相对RNP关联。纯化的RNP用RNase A处理，如材料和方法中所述。然后将预处理的RNP与³⁵S标记的M1蛋白和平均RNP关联百分比通过与总输入量的比较进行量化³⁵S-M1蛋白。数据显示了具有代表性的结合实验的结果；三个独立实验点的标准偏差低于10%（数据未显示）。

图7
洗涤剂对M1-RNP重组的影响。M1和RNP的重组按照材料和方法中的描述进行，添加（+）或不添加（-）1%Triton X-100。

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[8] Bucher D J，Kharitonenkov I G，Zakomirdin J A，Grigoriev V B，Klimenko S M，Davis J F.将流感病毒M蛋白并入脂质体。《维罗尔杂志》。1980;36:586–590.-项目管理咨询公司-公共医学

[9] Bui M，Whittaker G，Helenius A.M1蛋白和低pH值对流感病毒核糖核蛋白核转运的影响。《维罗尔杂志》。1996;70:8391–8401.-项目管理咨询公司-公共医学

[10] Bui M，Whittaker G，Helenius A.M1蛋白和低pH值对流感病毒核糖核蛋白核转运的影响。《维罗尔杂志》。1996;70:8391–8401.-项目管理咨询公司-公共医学

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