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.1999年6月28日；145(7):1443-59.
doi:10.1083/jcb.145.71443。

小窝蛋白与高尔基复合体结合的分子特征：小窝蛋白分子中顺高尔基靶向结构域的鉴定

卢埃特福斯特 1, E斯坦格, N Zorzi公司, 一个胡萝卜, M路, R G Parton公司
附属公司

小窝蛋白与高尔基复合体结合的分子特征：小窝蛋白分子中顺高尔基靶向结构域的鉴定

卢埃特福斯特等。 J细胞生物学. .

摘要

小窝蛋白是一种完整的膜蛋白，是小窝的主要成分。此外，小窝蛋白被提议在细胞内隔间和细胞表面之间循环，但小窝蛋白分子中的确切运输路线和靶向信息尚未确定。我们表明，针对小窝蛋白支架结构域或小窝蛋白-1的COOH末端的抗体对小窝蛋白高尔基池具有显著的特异性，并且通过免疫荧光不识别表面小窝蛋白。为了更详细地分析小窝蛋白的高尔基靶向性，小窝蛋白突变体在成纤维细胞中表达。缺少NH2末端的特定突变体针对顺式高尔基体，但在表面小窝中未检测到。此外，小窝蛋白-3的假定COOH末端细胞质结构域的32个氨基酸片段被特异性和专一性地靶向高尔基复合体，并且可以靶向可溶性异源蛋白绿色荧光蛋白。棕榈酰化缺陷型COOH末端突变体与高尔基复合体的关联可忽略不计。本研究定义了小窝蛋白分子中独特的高尔基靶向信息，并将顺式高尔基复合体确定为小窝蛋白循环途径中的中间隔室。

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数字

图4
图4
诺康唑治疗后BHK细胞中cav-1和高尔基体标记物的免疫荧光检测。用诺卡唑处理BHK细胞，使其高尔基体分散。（A） 使用针对小窝蛋白-1（cav1（FL））的商业单克隆抗体和亲和纯化的concav抗体对细胞进行内源性小窝蛋白的双重标记。这两种抗体在整个细胞内共定位。（B） 通过比较顺高尔基标记p23和表达的唾液酸转移酶（B），检测诺克唑分离高尔基标记的效率。nocodazole治疗后，内源性p23和表达的唾液酸转移酶部分分离（注意B重叠中黄色结构较少，绿色和红色点较多）。（C和D）在共焦显微镜检查之前，用cav-1（FL）和p23（C）或表达的唾液酸转移酶（D）双重标记细胞。注意，与反式标记ST.Bars 10μm相比，顺式标记p23与小凹蛋白的共定位程度更高（由更多黄点表示）。
图1
图1
过度表达的表位标记小窝蛋白和内源性cav-1在BHK细胞和成纤维细胞中的定位。（A–C）BHK细胞转染VSV-G表位标记的cav-1（cav1（G））、HA标记的cav-3（cav3（HA）），或转染包含GFP融合到NH的融合蛋白2如图所示，cav-3（cav3（GFP））的终点。全长小窝蛋白结构定位于细胞表面和核周区。（D和E）人成纤维细胞中cav-1的免疫荧光检测。用针对NH的抗体标记培养的人成纤维细胞2如图所示，cav-1的末端或COOH末端。鉴于NH2-末端抗体呈现特征性的表面染色，针对COOH末端的抗体呈现高尔基样染色模式。棒材，10μm。
图2
图2
小窝蛋白保守支架结构域抗体的特征。针对cav-3（anticoncav）保守结构域，即cav-1 NH的抗体2末端（抗cav1（N））或cav-3 NH2末端（抗cav3（N））用于印迹BHK细胞膜（A）、C2C12成肌细胞和肌管膜（B）或过度表达cav-1或cav-3（C）的BHK细胞。（A） 抗卡介苗抗体检测到BHK膜中的一个双链，上层带与较长（α）形式的卡介苗-1结合，如抗卡介株1（N）抗体所示。（B） 抗con-cav可识别未分化C2C12成肌细胞（MB）中的～21-kD带，以及分化的C2C12肌管中的<20-kD带（MT；B、d0、d1和d2表示分化天数）。相邻的印迹显示用抗cav3（N）探针检测到的相同组分。（C） 用所示抗体检测表达cav-1（1）或cav-3（3）的细胞。抗卡介苗抗体可识别过度表达的卡介苗病毒1和卡介苗毒株病毒3。
图3
图3
使用抗ncav抗体对小窝蛋白进行免疫荧光检测。（A–C）用表达cav-1（A）、cav-2（B）或cav-3（C）的重组塞姆利基森林病毒感染FRT细胞。然后用亲和纯化的抗ncav抗体标记细胞，并用共焦显微镜检查。抗体通过免疫荧光识别所有三种小窝蛋白。（D–F）一些细胞类型被标记有如下抗卡夫抗体；BHK（D）、CV-1（E）、MDCK（F）和原代人成纤维细胞（G-I）。在每种情况下，标记只能在符合高尔基体定位模式的细胞核周区域检测到。在人类成纤维细胞（H和I）中使用顺高尔基标记p23进行双重标记证实了这一点。（J和K）用抗cav3（N）和抗ncav抗体对过度表达的小窝蛋白-3进行免疫荧光检测。用重组SFV感染BHK细胞表达cav-3。然后固定细胞，用抗cav3（N）抗体（J）和抗ncav抗体（K）标记，并用共焦显微镜检查。注意标签模式的巨大差异；J的表面和可能的内部染色，但K.Bars只有高尔基染色，10μm。
图5
图5
BHK细胞高尔基组分中小窝蛋白的免疫电镜定位。根据（Rojo等人，1997年）制备的高尔基组分的解冻冰冻切片用p23抗体进行双重标记，然后是15 nm蛋白A-金和抗cavC抗体，最后是10 nm蛋白A--金。两个高尔基体堆栈显示p23和caveolin（箭头）的极化标记，如放大200 nm的B.Bars所示。
图6
图6
cav-3突变体的图示和免疫荧光检测。（A） 总结本研究中使用的一些突变体及其预测拓扑。（B） 带有额外COOH末端突变体的cav-3假定COOH端结构域的氨基酸序列。（C–F）BHK细胞转染一系列HA标记的小窝蛋白-3突变体，如下所示：Cav3DIH公司（面板C），第3节NED公司（D） ，第3节DGV公司（E） 和第3节肯尼亚先令（F） ●●●●。然后用HA标签抗体对其进行标记，并用共焦显微镜进行检查。虽然在A和B中有明显的表面染色和内部染色，但Cav3DGV公司构建物（E）没有表面标记，只有核周标记和点状细胞质染色。洞穴3肯尼亚先令（F） 缺乏点状标记，但也标记转染细胞的核周区域。注意，在一些高表达细胞中，标记在整个胞浆中都很明显。棒材，10μm。
图6
图6
cav-3突变体的图示和免疫荧光检测。（A） 总结本研究中使用的一些突变体及其预测拓扑。（B） 带有额外COOH末端突变体的cav-3假定COOH端结构域的氨基酸序列。（C–F）BHK细胞转染一系列HA标记的小窝蛋白-3突变体，如下所示：Cav3DIH公司（面板C），第3节NED公司（D） ，第3节DGV公司（E） 和第3节肯尼亚先令（F） ●●●●。然后用HA标签抗体对其进行标记，并用共焦显微镜进行检查。虽然在A和B中有明显的表面染色和内部染色，但Cav3DGV公司构建物（E）没有表面标记，只有核周标记和点状细胞质染色。洞穴3肯尼亚先令（F） 缺乏点状标记，但也标记转染细胞的核周区域。注意，在一些高表达细胞中，标记在整个胞浆中都很明显。棒材，10μm。
图7
图7
HA标记的cav3的免疫电镜定位DGV公司BHK单元中。用HA标记的cav3 cDNA转染BHK细胞DGV公司以及用HA标签抗体检测到的过度表达蛋白。固定前，细胞在37°C下与5 nm BSA-金培养10分钟。解冻后的冰冻切片用HA标签抗体标记，然后用15nm蛋白A-金标记。在B组中，切片也用ERD2抗体标记，然后用10nm蛋白A-金标记。A显示了细胞核周区的低倍视图，显示了HA标记的腔静脉3的特异性标记DGV公司高尔基复合体（g）。如面板B所示，该标签与顺高尔基标记ERD2（10纳米金，箭头）共存。标记也与囊泡结构有关（未显示）。可忽略的标记与质膜（p）、线粒体（m）和用5 nm BSA-gold标记的早期内体有关（箭头）。N、 核心。棒材，100 nm。
图8
图8
HA标记Cav3的免疫电镜定位肯尼亚先令BHK单元中。用HA标记的Cav3 cDNA转染BHK细胞肯尼亚先令以及用HA标签抗体检测到的过度表达蛋白。解冻后的冰冻切片用HA标签抗体标记，然后用15nm蛋白A-金标记。在B组中，也用p23抗体标记切片，然后用10nm蛋白A-金（箭头）标记。在C中，切片用10纳米金（箭头）标记HA，p23用15纳米金标记。A显示了一个低倍视图，其中显示了HA-tagged cav3的特定标签肯尼亚先令高尔基复合体（g）。如B所示，该标记与顺高尔基标记p23（10纳米金）共定位。C显示了提取的细胞的高尔基复合体，其中p23标记与未提取的细胞相比大大增加。p23和HA标记的Cav3的极性肯尼亚先令（箭头）很明显。可忽略标记与质膜相关（p）。棒材：（A）500 nm；（B和C）200纳米。
图9
图9
HA-标记Cav3的Colocalization肯尼亚先令在BHK细胞中具有高尔基体标记物和小窝蛋白。洞穴3肯尼亚先令转染的BHK细胞被HA表位抗体（A、C、E、G、I和K）和顺高尔基体标记物p23（B）、中高尔基体标志物giantin（D）、TGN标记物唾液转移酶（F）和小窝蛋白（cav1C；H、J和L）抗体双重标记。然后用共焦显微镜检查细胞。所有三个高尔基体标记（A–F）均显示结肠化。HA标记Cav3的（G-L）免疫定位肯尼亚先令和内源性cav-1。在许多细胞中，HA标记的cav3肯尼亚先令和小窝蛋白共定位（G和H）。然而，一致的观察结果是，在许多Cav3肯尼亚先令转染细胞（变化在30%到40%之间；五个独立实验）内源性cav-1信号减弱或检测不到（I和J）。诺卡唑治疗并没有消除这种信号丢失（K和L）。棒材，10μm。
图10
图10
HA标记Cav3的免疫定位肯尼亚先令用诺康唑处理的转染BHK细胞，引起高尔基体分散。用HA标记的Cav3转染BHK细胞肯尼亚先令或双重转染HA标记的Cav3肯尼亚先令然后在固定前用10μM诺卡唑处理2 h，以获得高尔基体标记的分离。然后用HA标签抗体和p23（A–C）、giantin（D–F）或表位标记的唾液酸转移酶（ST；G–I）抗体对细胞进行双重标记。然后用共焦显微镜检查细胞。对覆盖图（如C、F和I所示）的仔细检查表明，HA标签与p23（A–C）的共定位比与giantin（D–F）或tST（G–I）的共定域更完整（与F相比，C中完全黄色的点所占比例相对较高，更引人注目的是，I）。棒材，10μm。
图11
图11
cav-3的COOH末端结构域标记FRT细胞的高尔基体，并可将细胞溶质蛋白靶向高尔基复合体。（A和B）HA标记Cav3的免疫荧光肯尼亚先令在FRT细胞中。FRT细胞是一种不表达内源性小窝蛋白的上皮细胞系，用HA标记的Cav3转染FRT细胞肯尼亚先令虽然许多细胞在细胞质（A）中显示HA标记，但所有细胞都与与p23共定位的核周结构（B）有关（未显示）。（C和D）GFP-Cav3的本地化肯尼亚先令转染BHK细胞。用GFP-Cav3转染BHK细胞肯尼亚先令融合蛋白。除了清晰的高尔基体标记（C）外，大多数表达细胞在细胞质中都有标记。在一些高表达细胞中，高尔基体出现形态变化（D）。（E–H）BHK细胞转染小窝蛋白突变体，如共焦显微镜所示和定位。（E和F）转染Cav3IYS公司（见图6）定位于高尔基杂岩，而Cav3IRT公司无论表达水平如何，始终显示出更弥漫的染色。Cav-1的（G和H）免疫定位肯尼亚先令和棕榈酰化缺陷突变体Cav-1肯尼亚先令Δp。洞穴-1肯尼亚先令通常显示出特征性高尔基体标记模式，而那些转染Cav-1的人肯尼亚先令Δp始终呈现更为弥漫的细胞质标记。棒材，10μm。
图12
图12
Cav3的生化特性肯尼亚先令.（A）HA标记的Cav3的清洁剂溶解度肯尼亚先令Western blotting用于鉴定抗HA抗体识别的表位标记蛋白。在胞浆部分未观察到明显信号。膜分析（100000-克用1%Triton X-100和1%SDS提取的颗粒）在转染样品中显示出由抗HA抗体识别的～5-kD带。（B） 从膜（100000）中提取后上清液和颗粒（p）的比较-克颗粒），含1 M KCl和碱性0.1 M Na2一氧化碳三显示Cav3肯尼亚先令保留在不溶部分中。（C） 用Triton X-114从膜中分离两亲性和亲水性蛋白质显示Cav3肯尼亚先令划分为Triton®声波风廓线仪X-114相位。（D） 抗GFP抗体的Western blot显示转染WT-GFP、GFP-Cav3的相对分布肯尼亚先令，和在BHK粗胞质溶胶（s）和膜（p）级分中的GFP-Cav3（FL）。
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参考文献

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