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.1999年7月；181(13):4041-9.
doi:10.1128/JB.181.13.4041-4049.1999。

白色念珠菌耐氟康唑突变株的特异性染色体改变

V佩雷普尼哈特卡 1, F J费舍尔, M尼米, R A贝克, 研发加农炮, Y K王, F谢尔曼, E拉斯琴科
附属公司

白色念珠菌耐氟康唑突变株的特异性染色体改变

V佩雷普尼哈特卡等。 J细菌. 1999年7月.

摘要

白色念珠菌暴露于氟康唑导致17个耐药突变体的两条特定染色体不分离，每一条都是通过一个独立的突变事件获得的。染色体的改变发生频率很高，并且与药物暴露的持续时间有关。在氟康唑培养基上培养7天后，4号染色体的一个同源物丢失。暴露35或40天后，观察到第二个变化，即3号染色体的一个拷贝增加。我们发现候选氟康唑抗性基因ERG11、CDR1、CDR2和MDR1的mRNA水平保持不变或降低。假定的药物泵或药物靶点没有过度表达，这表明可能存在其他机制。在没有氟康唑的情况下生长112代后，突变株的氟康唑抗性表型、电泳核型和转录水平稳定。这是第一份证明氟康唑耐药性依赖于染色体不分离的报告。此外，我们认为，在临床治疗的早期阶段，这种机制可能会导致对氟康唑产生低水平耐药性。这些结果支持我们早期的假设，即白念珠菌染色体数目的改变是控制与重要细胞功能相关的潜在有益基因资源的常见手段。

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数字

图1
图1
克隆来源于白色念珠菌SGY-243，用于本研究。
图2
图2
亲本菌株的电泳核型，白色念珠菌SGY-243。在条件下，通过正交场交替凝胶电泳（OFAGE）分离染色体，以强调染色体底部（B）和中间（M）组（A）或底部（但不是其他组（B）的分离。这些分离条件并不能解析大染色体的顶群（T）。白色念珠菌3153A被用作参考电泳核型，并且酿酒酵母867条染色体（S.c.）被用作尺寸标记。（C） 染色体杂交自显影图MDR1型探查。
图3
图3
两个实验室菌株SGY-243和3153A的电泳核型示意图，以及SGY-244的氟康唑耐药突变体。三组白色念珠菌染色体底部（B）、中部（M）和顶部（T）可以通过三种不同的电泳条件单独或组合进行解析。染色体数目为1至7和R，以及同源物a或b。3153A参考电泳核型的染色体分配到单个带及其近似大小，以及鉴定八对染色体的基本原理，以前已经发表过（31、34、35）。指出了本研究中用于3153A染色体杂交的一些标记。通过带的位置和强度与3153A参考核型的相似性以及与以下染色体探针（圆圈中的数字）杂交来鉴定染色体：1，MDR1型(本第页); 2,ERG11号机组; 三，CDR3; 4,纳米t1; 5,LYS1级; 6,CDR1系统; 和7，CDR2型每个染色体拷贝数，用方括号表示，通过密度测定法测定。点线、细线和粗线分别对应于一条、两条和三条或多条染色体。染色体R的细线阵列代表一团不可分割的弱染色带。在本研究中获得的一些突变体中观察到的染色体R的变化未显示。指出了不同于SGY-243的抗性突变体的染色体模式。这个ERG11号机组基因探针没有与菌株3153A（*）的5a染色体杂交，可能是由于缺失。这个LYS1级基因探针也与SGY-243的顶部组中的一条带杂交（†）。单个突变体fzE5只保留了一个4a同源物，而不是两个（）。
图4
图4
暴露于氟康唑7天后获得的代表性氟康唑耐药突变体fzE5的电泳核型。在两种不同的OFAGE条件下获得的电泳核型显示了不同大小染色体的分离（图2）（A和B）。箭头表示染色体4a，其中三份中有两份丢失。注意，在这些分离中没有发现其他可检测到的染色体变化。显示了顶部（T）、中部（M）和底部（B）染色体。南卡罗来纳州。，酿酒酵母867个染色体大小标记。（C） 杂交斑点的自体放射自显影CDR3探针，证实染色体4a的两个拷贝丢失。
图5
图5
暴露于氟康唑35天后获得的代表性耐氟康唑突变体fzD5的电泳核型。（A） 通过OFAGE条件获得的电泳核型，强调了染色体底部（B）和中间（M）组的分离。箭头表示两种特定的染色体变化，即4a号染色体三个拷贝中的两个拷贝丢失，3号染色体一个拷贝增加。T、 顶染色体；南卡罗来纳州。，酿酒酵母867个染色体大小标记。（B） 杂交斑点的自体放射自显影CDR1系统探针，证实3号染色体拷贝数增加。
图6
图6
高氟康唑抗性突变体FR2的电泳核型。顶部（T）、中间（M）和底部（B）染色体的OFAGE分离（如图2的图例所述）。南卡罗来纳州。，酿酒酵母箭头表示FR2的染色体模式发生了一些可见的变化。（C） 杂交斑点的自体放射自显影MDR1型探针，表明6b号染色体的位置发生变化，拷贝数减少。
图7
图7
抗药性突变体在含有不同浓度氟康唑的培养基中生长48小时后，与亲本菌株SGY-243（φ）和参考抗性突变体FR2（▿）的生长相比。（A）短时间接触氟康唑7天后获得的代表性突变体fzE9（●）和fzE10（■）。（B） 长期接触氟康唑35天后获得的代表性突变体fzD9（●）和fzD10（■）。箭头表示对每个菌株进行细胞计数时的氟康唑浓度。注意，每对抗性突变体都由一条曲线表示，因为它们的生长反应相似。
图8
图8
菌株对氟康唑的敏感性。给出了菌株SGY-243、对照菌株和在128μg/ml氟康唑存在下生长后的抗性突变体的细胞密度。用细胞计数室测定细胞密度。对于突变体，每个值是两到四个测定值的平均值，对于SGY-243，每个值为17个测定值。
图9
图9
的级别CDR1系统,MDR1型,ERG11号机组,CDR3、和非甲烷T1mRNA输入白色念珠菌与水平相关的应变行动1mRNA。总RNA的斑点杂交与五个放射性标记探针中的每一个杂交。结果是三次测定的平均值±标准偏差（误差条）。不CDR2系统在所有菌株中均检测到mRNA。对四个对照菌株进行了分析，每个菌株都给出了类似的结果，并显示了一个具有代表性的菌株coC1。对两个潜在的回复菌株进行了分析，两个菌株都给出了相同的结果，其中一个菌株为fzG1。
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