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.1999年5月17日；145(4):825-36.
doi:10.1083/jcb.145.4.825。

左右不对称和驱动蛋白超家族蛋白KIF3A：通过KIF3A-/-小鼠分析确定偏侧性和中胚层诱导的新见解

S武田 1, Y Yonekawa公司, Y田中, Y冈田, S野中伸弥, N Hirokawa先生
附属公司

左右不对称和驱动蛋白超家族蛋白KIF3A：通过KIF3A-/-小鼠分析确定偏侧性和中胚层诱导的新见解

S武田等。 J细胞生物学. .

摘要

KIF3A是驱动蛋白超家族蛋白（kinesin superfamily proteins，KIFs）的经典成员，虽然主要在神经组织中广泛表达，但它与KIF3B或KIF3C及相关蛋白KAP3形成异三聚体KIF3复合物。为了阐明kif3A基因在体内的功能，我们制作了kif3A-基因敲除小鼠。kif3A-/-胚胎表现出严重的发育异常，其特征是神经管退化和中胚叶和尾叶发育不全，并在妊娠中期死亡，死亡时间约为10.5dpc（交配后天数），可能是由于心血管功能不全所致。Pax6的整体原位杂交显示出正常模式，而声波刺猬（shh）和Brachyury（T）的染色在中脑和胸部的前后（a-P）方向都显示出异常模式。这些结果表明，KIF3A可能参与中胚层模式形成，进而参与神经发生。

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数字

图1
图1
本研究采用的基因打靶策略。（A） 基因靶向载体。P-loop外显子的前半部分替换为PGK-neo选择标记。我们将DT-A阴性选择标记放在短臂共识区的上游。（B） 使用三种探针（neo、外部和内部）筛选同源重组体。只有约0.4 kb的外部探针显示为阴影框。在野生型基因座中，EcoRI酶消化产生单一的3.2kb带，而在敲除的等位基因中观察到2.1kb带。（C） 在9.5dpc下杀死的整个胚胎的蛋白质印迹显示，纯合子中没有KIF3A带，而KIF3B仍在表达。（D） 窝友PCR分析。空白突变纯合子胚胎不会通过引物集#2产生任何条带，而#1（neo）产生一个单独的条带。
图1
图1
本研究采用的基因打靶策略。（A） 基因靶向载体。P-loop外显子的前半部分替换为PGK-neo选择标记。我们将DT-A阴性选择标记放在短臂共识区的上游。（B） 使用三种探针（neo、外部和内部）筛选同源重组体。只有约0.4 kb的外部探针显示为阴影框。在野生型基因座中，EcoRI酶消化产生单一的3.2kb带，而在敲除的等位基因中观察到2.1kb带。（C） 在9.5dpc杀死的整个胚胎的蛋白质印迹显示纯合物中没有KIF3A带，而KIF3B仍然表达。（D） 窝友PCR分析。空白突变纯合子胚胎不会通过引物集#2产生任何条带，而#1（neo）产生一个单独的条带。
图1
图1
本研究采用的基因打靶策略。（A） 基因靶向载体。P-loop外显子的前半部分替换为PGK-neo选择标记。我们将DT-A阴性选择标记放在短臂共识区的上游。（B） 使用三种探针（neo、外部和内部）筛选同源重组体。只有约0.4 kb的外部探针显示为阴影框。在野生型基因座中，EcoRI酶消化产生单一的3.2kb带，而在敲除的等位基因中观察到2.1kb带。（C） 在9.5dpc下杀死的整个胚胎的蛋白质印迹显示，纯合子中没有KIF3A带，而KIF3B仍在表达。（D） 窝友PCR分析。空白突变纯合子胚胎不会通过引物集#2产生任何条带，而#1（neo）产生一个单独的条带。
图1
图1
本研究采用的基因打靶策略。（A） 基因靶向载体。P-loop外显子的前半部分替换为PGK-neo选择标记。我们将DT-A阴性选择标记放在短臂共识区的上游。（B） 使用三种探针（neo、外部和内部）筛选同源重组体。只有约0.4 kb的外部探针显示为阴影框。在野生型基因座中，EcoRI酶消化产生单一的3.2kb带，而在敲除的等位基因中观察到2.1kb带。（C） 在9.5dpc下杀死的整个胚胎的蛋白质印迹显示，纯合子中没有KIF3A带，而KIF3B仍在表达。（D） 窝友PCR分析。空白突变纯合子胚胎不会通过引物集#2产生任何条带，而#1（neo）产生一个单独的条带。
图2
图2
9.5 dpc时野生型和纯合型胚胎的宏观概述。（A） 野生型胚胎的侧视图。体节和神经系统发育正常。（B） 纯合子胚胎的相同视图。注意下半身严重退化，伴有神经管壁变薄。（C） 纯合子胚胎背视图，显示错开的中线结构，体节紊乱。（D） 大量心包积液（箭头所示）导致循环功能不全。棒材，1 mm。
图5
图5
组织学分析，9.5 dpc，HE染色。野生型（a）和纯合型（B）胚胎的矢状切面。系统发育不全、心包扩大（箭头）和神经管壁变薄（箭头）是纯合子的特征。两种类型胚胎（C，野生型；D，纯合子）的正面切片显示出如矢状切片所述的显著差异。纯合子心脏功能不全的部分原因是心肌发育不良（F）。注意野生型（E）胚胎的心肌壁发育良好。棒材，1 mm。
图4
图4
KIF3A分子在9.5 dpc胚胎中的表达模式（B）。KIF3A分子的表达几乎无处不在，尽管我们可以在神经管（Nt）和心脏（Cor）中识别出相对较强的重音。Orl，口腔；尾部，尾部区域。（A） 对照组用免疫前血清染色。棒材，1 mm。
图3
图3
8.5 dpc时胚胎的扫描电子显微镜。野生型胚胎显示出正常的身体转动（A）和心脏循环（D，D型），而纯合子（B和C）没有转动。一些纯合子表现出反向心脏循环（F，L型）。此外，纯合子（E）看似正常的心脏显示出不规则的心脏表面，如图F所示：（A–C）500μm；（D–F）100μm。
图6
图6
用lefty-2探针对胚胎进行整体原位杂交。如A所示，几乎所有野生型和杂合胚胎都表达左-2mRNA在左侧近轴中胚层。在纯合子（B）中，一定程度的胚胎表现出左-2两侧都有，但仍有胚胎只在左侧表达。棒材，1 mm。
图7
图7
野生型胚胎（a）和纯合型胚胎（B）的节（N）的扫描电子显微镜。野生型胚胎（C）中每个节细胞上都有单个纤毛（箭头），而纯合子（D）中没有纤毛或纤毛极短。棒材：（A和B）50μm；（C和D）5μm。
图8
图8
纤毛运动分析。（A） 在野生型胚胎中观察到向左淋巴结流动(n个= 3). （B） 在基夫3A空突变体(n个=5），仅观察到荧光珠的布朗运动，这与规则流动明显不同。棒材，5μm。
图9
图9
单侧髂内存在轴突动力蛋白。（B、D、F和H）用抗α-微管蛋白抗体在7.5 dpc下对结纤毛进行免疫染色。对结节纤毛（箭头）进行鉴定，并用抗KIF3A抗体（A）进行双重标记。这些纤毛还含有轴突外臂动力蛋白（C，箭头）（AD2）和中间链（IC140，E），而阴性对照组（G）没有染色单侧纤毛。通过透射电子显微镜（I和J），内臂和外臂动力蛋白都定位在MT双峰（箭头）的表面。棒材：（A–H）5μm；（I和J）100纳米。
图9
图9
单侧髂内存在轴突动力蛋白。（B、D、F和H）用抗α-微管蛋白抗体在7.5 dpc下对结纤毛进行免疫染色。对结节纤毛（箭头）进行鉴定，并用抗KIF3A抗体（A）进行双重标记。这些纤毛还含有轴突外臂动力蛋白（C，箭头）（AD2）和中间链（IC140，E），而阴性对照组（G）没有染色单侧纤毛。通过透射电子显微镜（I和J），内臂和外臂动力蛋白都定位在MT双峰（箭头）的表面。棒材：（A–H）5μm；（I和J）100纳米。
图10
图10
全山原位杂交。用探针探测野生型胚胎（A和C）和纯合胚胎（B和D）第6页（A和B）和Brachyury公司（C和D）9.5 dpc。在以下情况下声波刺猬野生型胚胎（上部胚胎）和纯合子胚胎（下部胚胎）的侧视图（E）和背视图（F）均显示为8.5 dpc。虽然正常的表达模式第6页几乎保存在基夫3A-缺陷胚胎，而其表达水平被下调（见正文）。的表达模式嘘和T型显著改变。注意没有嘘在中脑区域（箭头）。在面板（D）的头部区域可以观察到一些非特异性的信号沉积，这可能是由于沉淀物流过突变体中膨胀的中央管造成的。在7.5 dpc（G）时，与野生型胚胎（node）相比，shh的表达显著减少，但在节点（箭头）内没有强定位。棒材：（A–F）1 mm；（G） 150微米。
图10
图10
全山原位杂交。用探针探测野生型胚胎（A和C）和纯合胚胎（B和D）第6页（A和B）和Brachyury公司（C和D）9.5 dpc。在以下情况下声波刺猬野生型胚胎（上部胚胎）和纯合子胚胎（下部胚胎）的侧视图（E）和背视图（F）均显示为8.5 dpc。虽然正常的表达模式第6页几乎保存在基夫3A-缺陷胚胎，而其表达水平被下调（见正文）。的表达模式嘘和T型显著改变。注意没有嘘在中脑区域（箭头）。在面板（D）的头部区域可以观察到一些非特异性的信号沉积，这可能是由于沉淀物流过突变体中膨胀的中央管造成的。在7.5 dpc（G）时，与野生型胚胎（node）相比，shh的表达显著减少，但在节点（箭头）内没有强定位。棒材：（A–F）1 mm；（G） 150微米。
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