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.1999年5月17日；145(4):659-72.
doi:10.1083/jcb.1454.659。

LST1是一种SEC24同源物，用于从内质网选择性输出质膜ATP酶

K J罗伯格 1, M Crotwell系列, P埃斯彭沙德, R吉梅诺, C A凯撒
附属公司

LST1是一种SEC24同源物，用于从内质网选择性输出质膜ATP酶

K J罗伯格等。 J细胞生物学. .

摘要

在酿酒酵母中，将蛋白质从内质网运输到高尔基体的囊泡被COPII外壳蛋白包裹。我们在10个基因中发现了与COPII突变sec13-1相结合的致命突变，即LST（与sec-thirteen致死）。LST1与全套COPII基因表现出合成-致死相互作用，表明LST1编码一种新的COPII功能。LST1编码与COPII亚单位Sec24p序列相似的蛋白质。与Sec24p一样，Lst1p是一种外周ER膜蛋白，与COPII亚单位Sec23p结合。LST1的染色体缺失不是致命的，但会抑制质膜质子-ATPase（Pma1p）向细胞表面的运输，导致在低pH值的培养基上生长不良。免疫荧光显微镜和细胞分馏的定位显示，lst1Delta突变株从内质网输出的Pma1p受损。来自ER的其他蛋白质的转运不受lst1Delta的影响，也没有发现Pma1p转运对其他COPII缺陷特别敏感。总之，这些发现表明，一种特殊形式的COPII外壳亚基，用Lst1p代替Sec24p，用于将Pma1p有效包装到ER衍生的囊泡中。

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数字

图1
图1
对致命突变进行菌落分割筛查秒13-1.CKY423型(ade2 ade3 leu2 ura3 sec13-1【pKR4：第13页,ADE3型])在YPD上24°C下生长时，可能会丢失质粒pKR4阿德2阿德3在红色殖民地内形成白色部分的隔离物。获得第一次试验没有pKR4质粒，突变就无法生长，并形成非分割的固体红菌落。在132个非分割菌落中，57个通过第二次转化恢复了分割第13页-携带质粒（pKR1）。
图2
图2
的比较LST1型和第24节序列。相同之处用实线表示，相似之处用虚线表示。总的氨基酸一致性为23%。
图3
图3
之间的功能关系LST1型和第24节.（A）灵敏度lst1级Δ突变体到酸性介质。相同数量的野生型（CKY443）或lst1级Δ::LEU2级（CKY534）细胞被发现在pH 6.5的YPD培养基或酸性YPD培养液（通过添加HCl使pH值达到3.8）上。培养皿在37°C下培养2天后拍照。（B）A第一阶段Δ::LEU2级菌株CKY552转化为：仅载体pRS316；LST1型在着丝粒质粒pKR17上；第24节在着丝粒质粒pAF70上；或第24节在2μ质粒pKR34上；并在pH值为3.8的YPD培养基上划线。在37°C下生长2天后拍摄菌落照片。（C）野生型菌株（CKY473）通过携带质粒转化pGAL1–LST1型（pKR35）和病媒控制（pRS425），或使用pKR35%和第24秒在2μ质粒（pKR41）上。以800个细胞/厘米的密度对转化细胞进行电镀2在含有2%棉子糖的SMM板上，然后将3mg半乳糖溶液放置在草坪顶部的无菌1cm过滤器上。在30°C下生长2 d后，对平板进行拍照。
图5
图5
Pma1p将ER累加到lst1级Δ细胞的过度表达抑制了这种积累第24节将30℃下生长在SMM中的细胞用甲醛固定，然后用亲和纯化的抗Pma1p抗体和FITC-结合二级抗体进行免疫荧光显微镜染色。同样的细胞区域，用DAPI染色以标记核DNA，也显示出来。顶部面板，蒙太奇lst1级Δ细胞（携带空载体pRS316的CKY536）；中间板，基因型野生型细胞（CKY536携带LST1型质粒pKR17）；底部面板，lst1级Δ细胞被抑制第24节（CKY536携带2μ第24节质粒pKR34）。棒材，5μm。
图4
图4
Pma1p缺陷由lst1级Δ. （A）lst1级Δ细胞（CKY534）在pH3.8的YPD上37°C下生长后，使用差示干涉对比显微镜进行拍照。图中显示了多个芽状细胞的蒙太奇。这种类型的细胞占lst1级Δ培养，但从未在相同条件下生长的野生型中看到。棒材，10μm。（B） 质子泵容量减少lst1级Δ单元。野生型（CKY443）和lst1级Δ（CKY536）在37°C、pH 6.8的YPD培养基中生长到指数阶段。细胞在水中培养过夜，然后悬浮在pH 4.0的10 mM甘氨酸缓冲液中。添加葡萄糖后，质子从细胞流出被记录为外部培养基pH值的降低。根据添加葡萄糖后前5分钟pH值的平均变化率，lst1级Δ细胞的质子流出率为野生型的65%。
图4
图4
Pma1p缺陷由lst1级Δ. （A）lst1级Δ细胞（CKY534）在pH3.8的YPD上37°C下生长后，使用差示干涉对比显微镜进行拍照。图中显示了多个芽状细胞的蒙太奇。这种类型的电池包含约10%的lst1级Δ培养，但在相同条件下生长的野生型中从未见过。棒材，10μm。（B） 质子泵送能力降低lst1级Δ单元。野生型（CKY443）和lst1级Δ（CKY536）在37°C、pH 6.8的YPD培养基中生长到指数阶段。细胞在水中培养过夜，然后悬浮在pH 4.0的10 mM甘氨酸缓冲液中。添加葡萄糖后，质子从细胞流出被记录为外部培养基pH值的降低。根据添加葡萄糖后前5分钟pH值的平均变化率，lst1级Δ细胞的质子流出率为野生型的65%。
图6
图6
定位Pma1p的细胞分数lst1级Δ单元。野生型（CKY443）和lst1级Δ（CKY536）细胞在24°C的YPD中生长，然后转移到37°C中3 h。细胞裂解物在20–60%蔗糖的密度梯度上进行分级。通过免疫印迹和密度测定法定量每个组分中Pma1p、Gas1p（质膜标记物）和Sec61p（ER标记物）的相对水平。酶法测定GDPase（高尔基室标志物）。
图7
图7
转化酶的转运不受lst1级Δ. 野生型（CKY540），lst1级Δ（CKY542），以及秒12-4表达转化酶的（CKY541）菌株pTPI1–SUC2在不含蛋氨酸的pH 6.5的SMM培养基中，在24°C下生长到指数相。野生型和第一阶段Δ菌株转移至37°C，生长3 h秒12-4（CKY541）菌株在标记前5分钟转移至37°C。细胞被脉冲标记[35S] 蛋氨酸和半胱氨酸持续5分钟，然后添加过量的未标记蛋氨酸和半胱氨酸。从标记提取物中免疫沉淀转化酶，并通过SDS-PAGE进行解析。指出了核心糖基化ER型和成熟高尔基体以及转化酶分泌型的位置。
图8
图8
Lst1p-HA的免疫定位。CKY535型(马塔lst1Δ::LEU2列2-3,112乌拉3-52[pKR17HA]）从着丝粒质粒表达Lst1p-HA，并用小鼠抗-HA、FITC-偶联抗鼠抗体、兔抗Kar2p和罗丹明偶联抗兔抗体进行固定和标记。DAPI染色显示细胞核DNA。通过微分干涉对比显微镜（DIC）观察细胞体。棒材，1μm。
图9
图9
Lst1p的细胞内分布。（A） 轻轻地裂解来自着丝粒质粒（CKY535）表达Lst1p-HA的细胞，并进行顺序离心步骤，得到500个克, 10,000克和150000克颗粒组分（P）和150000克上清液部分（S）。每个样品都含有相同数量细胞的提取物。（B） 用2.5 M尿素、500 mM氯化钠、100 mM碳酸钠（pH 11.5）或1%Triton X-100在4°C下处理细胞裂解物1 h。然后通过50000离心分离颗粒（P）和上清液（S）部分克用SDS-PAGE和抗HA抗体免疫印迹法检测Lst1p-HA。
图10
图10
Lst1p/–Sec23p复合物是膜相关的。（A） Lst1p/–Sec23p复合物的亲和性分离。GST–Lst1p-HA或GST单独与Sec23p共表达，并通过与谷胱甘肽Sepharose珠亲和性分离。与谷胱甘肽珠结合的蛋白质装载在通道2和通道4中。总裂解液的六分之一装载在通道1和3中。（B） GST–LST1-HA，第23节，或两者都是从加仑1发起人。在300℃离心，清除细胞裂解液中的细胞碎片克2分钟后，通过10000离心分离清除细胞裂解液中的颗粒（P）和上清液（S）部分克30分钟。离心前取出一等分的全部清除的裂解液（T）。为每个样品加载相同数量的细胞当量。使用抗HA抗体检测GST-Lst1p-HA融合。对于A和B，使用抗Sec23p抗体检测Sec23p蛋白。
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参考文献

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