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.1999年5月3日；145(3):481-90.
doi:10.1083/jcb.1453.481。

蛋白酶体机械和中心体的动态关联

W C威格利 1, R P Fabunmi公司, M G Lee先生, C R马里诺, S穆阿勒姆, G N德马蒂诺, P J托马斯
附属公司

蛋白酶体机械和中心体的动态关联

W C威格利等。 J细胞生物学. .

摘要

虽然已知的由蛋白质折叠不当引起的疾病数量仍在增加，但错误折叠多肽的识别和最终处置机制仍不清楚。例如，如何以及在何处识别和处理此类基底尚不清楚。我们在这里报告了一种特殊的亚细胞结构的鉴定，在基本条件下，20S蛋白酶体、PA700和PA28（分别为700-kD和180-kD蛋白酶体激活物复合物）、泛素、Hsp70和Hsp90（分别为70-kD热休克蛋白）集中在HEK 293和HeLa细胞中。该结构为核周结构，被内质网包围，毗邻高尔基体，与γ-微管蛋白（一种已建立的中心体标记物）共定位。含有纯化中心体的密度梯度组分富含蛋白酶体成分和细胞应激伴侣。中心体相关结构因蛋白酶体活性的抑制和错误折叠蛋白的水平而增大。例如，CFTR的折叠突变体在蛋白酶体活性受到抑制时从中心体产生大的内含物。在错误折叠蛋白水平较高的情况下，结构不仅扩大，而且广泛吸收泛素、Hsp70、PA700、PA28和20S蛋白酶体的细胞溶质池。因此，中心体可以起到支架的作用，它集中并招募系统，这些系统充当折叠、聚集和退化之间平衡的检查器和调制器。

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数字

图1
图1
中心体蛋白酶体成分的定位。用（A和D）20S蛋白酶体和γ-微管蛋白（A）抗体或荧光标记的WGA（D）抗体对HEK 293细胞进行免疫染色。（B和E）PA700和γ-微管蛋白（B）或荧光标记的WGA（E）。（C和F）PA28和γ-微管蛋白（C）或BiP（F）。（G） 泛素（Ub）和γ-微管蛋白，以及（H）Hsp70和荧光标记的WGA。按照材料和方法所述获得共焦图像。用（I）多克隆鸡抗PA700抗体或（J）多克隆鸡抗PA700，在室温下对纯化牛PA700进行预吸收，对HEK 293细胞进行抗血清染色，以研究抗血清的特异性。在同一天以相同的放大倍数、虹膜设置和增益获得共焦荧光图像。注：为了清楚显示每个面板，蛋白酶体机械、Hsp70和Ub的免疫荧光始终显示为绿色，而γ-微管蛋白、WGA和BiP的反染色始终显示为红色。面板A–H中的箭头表示核周蛋白酶体富集的中心体的位置。比例尺以微米为单位表示尺寸。
图2
图2
蛋白酶组分和热休克蛋白与γ-微管蛋白在蔗糖梯度上共沉淀。中心体由7×10制成7从不连续蔗糖梯度中收集293个细胞和组分，详见材料和方法。等量的单个组分进行Western blot分析。馏分1-10是自下而上收集的梯度馏分，即70-30%的蔗糖。W表示10μg全细胞裂解物作为每个印迹的对照。BiP、醛缩酶、层粘连蛋白B1β-cop分别是内质网腔、胞浆、细胞核和高尔基体的标记物，仅在全细胞裂解液中检测到，而在中心体部分中未检测到，从而确定了中心体预处理的纯度。每个蛋白质的大小以kD表示。
图3
图3
中心体因蛋白酶体抑制而膨胀。用PA28抗体（绿色）和荧光标记的Con A（红色）对（A和B）HEK 293细胞进行染色。如材料和方法中所述，用10μM乳胱氨酸处理B细胞。每个面板中的箭头表示代表性中心体的位置。比例尺单位为μm。（C） 形态计量学测量量化并比较经乳糜蛋白酶处理的（+）细胞和对照细胞（−）的表观中心体直径，用抗血清对所示蛋白质染色，表示为9–16次测定的平均±SEM。
图3
图3
中心体因蛋白酶体抑制而膨胀。用PA28抗体（绿色）和荧光标记的Con A（红色）对（A和B）HEK 293细胞进行染色。如材料和方法中所述，用10μM乳胱氨酸处理B细胞。每个面板中的箭头表示代表性中心体的位置。比例尺单位为μm。（C） 形态计量学测量量化并比较经乳糜蛋白酶处理的（+）细胞和对照细胞（−）的表观中心体直径，用抗血清对所示蛋白质染色，表示为9–16次测定的平均±SEM。
图4
图4
CFTR的免疫荧光细胞内定位。表达所示CFTR构建体的瞬时转染HEK 293细胞用兔多克隆抗CFTR染色，然后用罗丹明标记的山羊抗兔IgG染色，用小鼠单克隆抗BiP染色，然后用荧光素标记的驴抗小鼠IgG染色。A和B、C和D以及E和F是来自相同字段的对。比例尺以微米为单位表示尺寸。
图5
图5
中心体因错误折叠的蛋白质而膨胀。表达野生型或突变型P205S CFTR（如图所示）的瞬时转染HEK 293细胞用CFTR抗体（红色）和PA28（A）或20S蛋白酶体（B）抗体（均为绿色）染色。箭头表示中心体在表达CFTR的细胞中的位置。箭头表示来自相同区域的非表达细胞中的中心体，以进行相对比较。比例尺单位为μm。
图6
图6
错误折叠蛋白的细胞内内含物来自中心体。表达中等水平CFTR-ΔF508的细胞用10μM乳酸菌素处理12 h，并用（A和C）兔多克隆抗CFTR染色，然后用荧光素标记的山羊抗兔IgG和（B和D）小鼠单克隆抗γ-微管蛋白染色，最后用罗丹明标记的驴抗鼠IgG染色。A和B、C和D是来自相同字段的对。箭头表示γ-微管蛋白-可见的中心体集中在突变CFTR聚集形成的位点。比例尺以微米为单位表示尺寸。
图7
图7
蛋白酶体机械用于CFTR聚集体。按照材料和方法中的描述，用10μM的乳酸菌素处理瞬时转染了所示CFTR表达结构的HEK 293细胞。然后用（A）小鼠单克隆抗CFTR（红色）、兔多克隆抗20S蛋白酶体（绿色）、（B）兔多克隆抗体CFTR、鸡多克隆抗体PA700（绿色，和兔多克隆抗泛素（绿色），或（E）兔多克隆抗体CFTR（红色）和小鼠单克隆抗Hsp70（绿色）。每个面板中的箭头表示，由于中心体相关内含物的募集，细胞溶质中的可检测蛋白酶体成分被清除。中心体和CFTR聚集体相对膨胀的形态计量学分析见面板（F）。通过至少八次测量，确定了单独使用乳酸菌素和野生型低表达乳酸菌素ΔF508和P205S CFTR抑制蛋白酶体引起的膨胀。虚线表示未经处理的中心体的相对大小。误差为±SD。比例尺以微米为单位表示尺寸。
图8
图8
中心体、Hsp70和蛋白酶体在包裹体形成中的核心分布。2.5 × 105如材料和方法所述，将表达P205S突变CFTR并用10μM乳酸菌素处理12 h的HeLa细胞和未处理的模拟转染对照细胞裂解并分离成上清液（S）和颗粒（P）组分。通过SDS-PAGE分离组分，并通过Western blotting对每个指示抗体进行分析。
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工具书类

    1. Adams GM、Falke S、Goldberg AL、Slaughter CA、DeMartino GN、Gogol EP。PA700和调节蛋白对蛋白酶体的结构和功能影响。分子生物学杂志。1997;273:646–657.-公共医学
    1. Ahn J、Tanahashi N、Akiyama K、Hisamatsu H、Noda C、Tanaka K、Chung CH、Shibmara N、Willy PJ、Mott JD等。PA28的两个同源亚单位的一级结构，这是20S蛋白酶体的γ-干扰素诱导蛋白激活剂。FEBS信函。1995;366:37–42.-公共医学
    1. Andrews CA，Lesley SA。基于改变的β-内酰胺酶特异性的定点突变选择策略。生物技术。1998;24:972–980.-公共医学
    1. Baumeister W，Walz J，Zuhl F，Seemuller E.蛋白酶体：自分隔蛋白酶的范式。单元格。1998;92:367–380.-公共医学
    1. Bercovich B、Stancovski I、Mayer A、Blumenfeld N、Laszlo A、Schwartz A、Ciechanover A。某些蛋白质底物在玻璃体内的泛素依赖性降解需要分子伴侣Hsc70。生物化学杂志。1997;272:9002–9010.-公共医学

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