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.1999年3月30日；96(7):3540-5.
doi:10.1073/pnas.96.7.3540。

肿瘤坏死因子受体家族成员RANK介导骨保护素配体诱导的破骨细胞分化和活化

H Hsu公司 1, D L莱西, C R邓斯坦, I索洛维耶夫, 哥伦比亚人, E提姆, H L棕褐色, G Elliott公司, M J Kelley先生, I萨洛西, L Wang（L王）, X Z夏, R Elliott公司, L Chiu先生, T黑色, S史卡利, C卡帕雷利, S莫罗尼, G岛本, M B低音, W J博伊尔
附属公司

肿瘤坏死因子受体家族成员RANK介导骨保护素配体诱导的破骨细胞分化和活化

H Hsu公司等。 美国国家科学院程序. .

摘要

通过初级破骨细胞前体细胞cDNA文库的基因组分析，已鉴定出一种介导骨保护素配体（OPGL）诱导破骨细胞分化和活化的受体，该受体与肿瘤坏死因子受体（TNFR）家族成员RANK相同。RANK mRNA在分离的骨髓源破骨细胞祖细胞和体内成熟破骨细胞中高度表达。重组OPGL与转染的细胞系和纯化的破骨细胞祖细胞表达的RANK特异性结合。表达可溶性RANK-Fc融合蛋白的转基因小鼠由于破骨细胞减少而患有严重的骨质疏松症，与OPG转基因小鼠相似。重组RANK-Fc在体外与OPGL高亲和力结合，并在体内外阻断破骨细胞的分化和激活。此外，针对RANK胞外结构域的多克隆抗体可促进骨髓培养中的破骨细胞生成，这表明RANK激活可介导OPGL对破骨细胞途径的影响。这些数据表明，OPGL诱导的破骨细胞生成是通过破骨细胞前体细胞上的RANK直接介导的。

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数字

图1
图1
RANK介导OPGL诱导的破骨细胞生成。(A类)破骨细胞前体细胞中RANK的表达。使用RANK特异性探针对从OPGL阴性结合群体、OPGL阳性结合群体或32-D细胞制备的4μg总RNA进行Northern blot分析。(B类)破骨细胞前体表面OPGL–RANK复合物的交联。用FACS制备OPGL阳性和阴性结合细胞，用125I标记的OPGL，然后用1mM酒石酸二琥珀酰亚胺交联。用SDS/PAGE直接分馏1/1的细胞裂解物（通道1和2）。剩余的细胞裂解物用免疫前血清（3和5道）或抗RANK抗体（4和6道）免疫沉淀。(C类)抗RANK抗体刺激破骨细胞生成。在不同浓度的抗RANK抗体或兔IgG存在下，用CSF-1（30 ng/ml）和5 ng/ml小鼠OPGL（158-316）培养小鼠骨髓细胞。破骨细胞生成通过TRAP溶液分析定量。A405表示405 nm处的吸光度，表示为平均值±SD(n个= 3). 底部显示TRAP细胞化学染色。（巴=200μm）
图2
图2
RANK mRNA在发育中和成人骨中的表达定位就地杂交。将胚胎和成人长骨切片与33RANK的P标记反义核糖探针，处理并用苏木精/伊红染色。面板A–E来自胎儿股骨（E15.5）B类和D类成为的暗场图像A类和C类分别是。面板F–I型来自成人（6周）股骨G公司成为F类RANK由附着在基质上的多核细胞表达，与胎儿和成人主动骨建模区域的破骨细胞一致。成人生长板中的肥大软骨细胞似乎也表达RANK转录物。箭头表示破骨细胞的位置，而箭头表示肥大软骨细胞的位置。[棒材=400μm(A类和F类)，100微米(C类)和25μm(E类和H（H）).]
图3
图3
可溶性RANK-Fc增加骨密度。(A类)RANK-Fc转基因小鼠的骨密度增加。对RANK-Fc高表达小鼠（动物6）、中等表达小鼠（小鼠78）和对照同窝小鼠（动物4）进行放射分析(左侧)和组织学分析(中部和赖特). 在高表达和低表达中均检测到长骨、骨盆骨和椎骨的放射密度增加(左侧)骨骼形状没有变化。RANK-Fc转基因小鼠的股骨干含有未被吸收的骨和软骨，其中表达量最高（动物6）的骨和骨软骨的蓄积量最大(中部). 骨TRAP组织化学染色显示RANK-Fc表达的破骨细胞数量减少(赖特). (B类)用RANK-Fc重组蛋白处理的小鼠的PQCT分析。3周龄的雄性BDF1小鼠每天皮下注射指定剂量的RANK-Fc融合蛋白，持续4天。周围定量计算机断层扫描测量胫骨近端干骺端的骨密度。总密度表示为平均值±标准偏差(n个= 4). RANK-Fc治疗导致总骨密度的剂量依赖性增加(P（P）< 0.001).
图4
图4
RANK与TRAF蛋白的相互作用以及NF-κB和JNK通路的激活。（A） RANK的TRAF结合域的定位。编码融合到GAL4 DNA结合域的RANK细胞内域全长或缺失突变体的表达载体与表达与TRAF2、TRAF5或TRAF6融合的GAL4激活域的载体共同转化为HF7C酵母菌株，如所述（21）。+，在选择板上生长1周。(B类)RANK和TRAF蛋白的免疫共沉淀。转染24小时后，用免疫前血清或针对RANK胞外区的抗体免疫沉淀293个细胞裂解物。用山羊抗TRAF2或抗TRAF6抗体（Santa Cruz Biotechnology）进行免疫印迹分析，检测共沉淀TRAF2和TRAF6。(C类)RANK转染293细胞中NF-κB的激活。24小时后测量荧光素酶活性，并根据β-半乳糖苷酶表达水平进行标准化。数值（平均值±SD）表示与载体转染相关的荧光素酶活性，用于重复进行的代表性实验。(D类)RANK转染293细胞中JNK的激活。转染24小时后，用单克隆抗HA表位抗体免疫沉淀293个细胞裂解物。以2μg GST-JUN（Stratagene）为底物检测免疫沉淀物的激酶活性，并用SDS/PAGE进行解析。
图5
图5
OPGL和抗RANK激动剂Abs刺激小鼠髓系RAW 264.7细胞系破骨细胞分化。(A类)来自不同来源的RNA的Northern blots与RANK探针杂交。(B类)大约106将RAW细胞暴露于100 ng/ml OPGL，持续指定的时间。细胞裂解物用单克隆抗JNK抗体免疫沉淀。免疫沉淀物用GST-JUN作为底物测定激酶活性，并用SDS/PAGE进行解析。(C类)将RAW细胞接种在骨切片上，并用OPGL处理7天。这个上部和下部面板分别显示TRAP细胞化学和甲苯胺蓝染色结果。注意，OPGL诱导TRAP阳性细胞的形成(上部)形成吸收陷窝(下部). （棒材=50μm）(D类)从仅用培养基处理的RAW细胞（第1道）或添加100 ng/ml OPGL（第2道）或1750 ng/ml抗RANK抗体（第3道）的培养基中提取总细胞RNA。来自OPGL和CSF-1处理的骨髓培养物的RNA作为阳性对照。使用降钙素受体（CTR）、β3整合素（B3）、c-fms、组织蛋白酶k（cathK）、TRAP、c-src、PU.1和亲环素（cyclophilin）探针进行核糖核酸酶保护试验。Lanes P和Y分别代表未消化探针和酵母杂交对照。
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参考文献

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