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。1999年3月16日；96(6):2840-5.
doi:10.1073/pnas.96.6.2840。

鉴定参与转铁蛋白循环的rab11的假定效应蛋白

曾俊华 1, M Ren先生, D格拉沃塔, C De Lemos-Chiarandini公司, M Lui先生, H仪表-堵塞, P温度, G Xu先生, T H Shen先生, T森本茂, M阿德斯尼克, D D萨巴蒂尼
附属公司

鉴定参与转铁蛋白循环的rab11的假定效应蛋白

曾俊华等。 美国国家科学院程序。 。

摘要

我们已经鉴定并克隆了一种912-aa蛋白rab11BP的cDNA，该蛋白与含有GTP的活性形式rab11相互作用，rab11是一种GTP结合蛋白，在受体循环中起着关键作用。虽然rab11BP主要是细胞溶质，但在分选和再循环小室的内胚层膜中，有很大一部分与rab11共定位。rab11与天然rab11BP的体外结合需要后者的部分变性，以暴露位于残基334和504之间的内部结合位点，该位点明显被蛋白质的C末端部分掩盖，其中包括六个重复，称为WD40结构域。在细胞内，rab11BP必须经历一个构象变化，其中rab11结合位点暴露，因为当与转染细胞中的rab11共表达时，这两种蛋白与膜形成丰富的复合物。此外，尽管rab11BP的过度表达并不影响转铁蛋白的循环，但包含rab11结合位点但缺乏WD40结构域的截短型蛋白质rab11BP（1-504）的过度表达与不结合GTP的显性阴性rab11突变蛋白一样强烈地抑制了循环。令人惊讶的是，当细胞也表达一种C末端缺失的、不可折叠的rab11形式时，截断的rab11BP引起的抑制作用被完全阻止，而rab11本身对再循环没有影响。我们认为rab11BP是rab11的效应器，其与该GTP结合蛋白的关联依赖于另一个膜相关因子的作用，该膜相关因子促进rab11BP中rab11结合位点的揭开。

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数字

图1
图1
在过滤覆盖试验中与rab11-GTP特异性相互作用的130-kDa蛋白（rab11BP）的鉴定和cDNA克隆。(A类)泳道a–c，在MDCK（a）、293T（b）和3T3（c）细胞中rab11BP的存在。使用[α-32P] GTP-rab11作为探针。通道d–f虽然主要是细胞溶质（f），但rab11BP的一部分是膜相关的（e）。通过印迹试验分析MDCK细胞总裂解物（TH，lane d）和可沉淀（P，lane e）和可溶性亚组分（S，lane f）的等分样品，以确定是否存在rab11BP。通道g和h中，只有含有活性GTP的rab11形式与rab11BP结合。用MDCK细胞裂解物和[α-32P] GTP-rab11作为探针是在含有30倍过量rab11的情况下进行的，rab11充满非放射性GTP（g）或GDP（h）。(B类)rab11–rab11BP相互作用的特异性。当用作充满[α]的探针时-32P] GTP、rab 3a（b）、rab5（c）和rab11效应域突变体（rab11T43A）（d）不能与rab11BP结合。通过印迹法分析通过硫酸铵沉淀（25-45%饱和度）获得的大鼠脑胞浆亚组分的等分试样（100μg蛋白质），并用指示的[α-32P] GTP充电探头。Lanes e–h，当用作与脑细胞溶质亚组分的印迹分析中的竞争物时，rab8和显性阴性rab11突变体（rab11S25N）不会减少[α-32P] GTP-rab11至rab11BP。将不同的竞争对手孵育以加入冷GTP，并将其用于印迹分析，其浓度为标记浓度的30倍[32P] GTP-rab11探头。(C类)克隆的cDNA编码一种与rab11BP结合并结合rab11-GTP的蛋白质。泳道a是一种从部分纯化的脑胞质提取物中获得的免疫沉淀物，具有克隆cDNA氨基酸序列中肽（残基88–103）的抗体，用于[α-32P] GTP-rab11作为探针。结合探针（a）的免疫沉淀物中的蛋白质与原始牛脑蛋白质组分中的rab11BP（d）具有相同的电泳迁移率。通道b和c、仅转染pcDNA载体（b）或包含克隆cDNA（c）的载体的293T细胞裂解液的等分样品通过过滤覆盖试验进行分析。为了揭示内源性人类rab11BP，在lane b中分析的提取物量是lane c中使用的转染细胞的30倍。
图2
图2
Rab11BP的结构。(A类)来自cDNA的牛rab11BP的氨基酸序列。强调了最初在纯化蛋白中通过微测序鉴定的肽序列。富含脯氨酸的区域从残基210延伸到256。该蛋白质的计算分子量为101290 Da，pI为5.18。编码牛rab11BP的核苷酸序列已提交给GenBank，注册号为AF117897。(B类)Rab11BP在该区域包含6个WD40重复序列，从残基508延伸到813。（a） 这六个重复序列的位置由每个序列右侧括号内的数字表示，它们以对齐方式显示，以最大限度地与Neer定义的WD40重复序列的松散共识序列保持一致（阴影残差）等。（30），见b(C类)rab11BP结构示意图。除了WD40重复序列和富含脯氨酸的区域外，图中还显示了rab11-结合域的位置，如图3中的实验所定义。
图3
图3
rab11BP中的rab11-结合区位于残基334和504之间。(A类)在转染的293T细胞中表达HA标记的完整rab11BP（a区，1–912）或每个区（b–d）上所示的特定HA标记的缺失形式的蛋白，并用抗HA抗体进行免疫印迹分析细胞裂解产物(左侧，a–d）或，对于[32P] GTP-rab11结合，通过重叠分析(赖特，a′–d′）。白色星号表示rab11BP（1–912）的降解产物。(B类)含有大肠杆菌通过SDS凝胶电泳分离与rab11BP片段相连的麦芽糖结合蛋白，该蛋白从残基334延伸至504（a和a′）或从504延伸至912（b和b′），并转移至硝化纤维素。泊松红染色蛋白质模式(左侧)和[32P] GTP-rab11结合模式(赖特)如图所示。
图4
图4
富含内体的亚细胞组分中rab11和rab11BP的结肠化。对大鼠肝匀浆进行分馏（20），以获得富含细胞核和线粒体（P1-2）、细胞质较小颗粒组分（P3和P4）和最终上清液（S）的三个可沉淀部分（P1-2、P3和P3）。通过在不连续的蔗糖梯度中浮选对可沉淀的级分进行亚级分，以从每四个亚级分（A、B、C和D）和颗粒中获得。用针对rab11或rab11BP或每个图表中所示标记蛋白的抗体，通过Western blotting分析每个组分和亚组分的等分（100μg蛋白质）。检测到结合抗体125I标记蛋白A并通过磷成像仪分析定量。条形图表示图底部横坐标所示的不同组分和亚组分中每个蛋白质的特定活性。
图5
图5
rab11和膜相关rab11BP在内体和中心粒周围再循环室中的免疫荧光共定位。将表达人转铁蛋白受体（TRVb-1细胞）的中国仓鼠卵巢细胞永久转化体转染到质粒编码的HA标记的rab11BP。将盖玻片上生长的细胞用0.05%皂苷在PBS中渗透4分钟，释放可溶性细胞溶质成分，并用小鼠原代单克隆抗体对HA表位进行双标记免疫荧光(A类)和兔抗rab11抗体(B类)其次是德克萨斯州红结合驴抗鼠抗体和荧光素结合驴抗兔抗体。箭头和箭头分别指向转染细胞中的中心粒周围隔室和外周分选内体。请注意B类显示抗rab11抗体对中心粒周围室的强烈染色。
图6
图6
体内共转染细胞中rab11和rab11BP的相关性。用（a）基于pcDNA3的表达质粒单独或与编码HA-Rab11BP的质粒一起转染293T细胞培养物（b）WT Rab11，（c）Rab11Q70L（GTPase缺失突变），（d）Rab11 T43A（效应域突变），或（e）Rab11-S25N（GDP-结合突变）或（f）Rab11ΔC（一种缺失突变体，缺乏最后6个氨基酸，因此不能进行丙酰化）。转染后40小时，用固定化rab11多克隆抗体从洗涤剂溶解的细胞裂解液中免疫沉淀含有野生型或rab11突变蛋白的复合物。(A类)用单克隆抗HA抗体免疫印迹分析免疫沉淀物中HA-rab11BP的回收率。(B类)用兔抗rab11抗体分析相同免疫沉淀物中rab11或其突变体的回收率。(C类)HA-Rab11BP在所有转染细胞中表达的水平相当。用抗-HA抗体进行免疫印迹分析等分的细胞裂解物（占总数的2%）。
图7
图7
截断的rab11BP（1-504）对转铁蛋白循环的抑制作用以及非戊烯基化的rab11ΔC对其的缓解作用。如前所述（16），在TRVb细胞培养物中评估转铁蛋白再循环率，TRVb是中国仓鼠卵巢细胞的突变系，缺乏功能性内源性转铁蛋白受体，与编码人转铁蛋白接收器的质粒共转染(A类–天)和编码完整rab11BP的质粒(A类)，或其截短变体rab11BP（1-336）(B类)和rab11BP（1-504）(C类和天).A类还显示了表达受体的细胞与rab11显性阴性突变体（rab11S25N）的循环动力学。在天细胞除了表达转铁蛋白受体和截短的rab11BP（1-504）外，还表达非戊烯基化的rab11ΔC。在A类–天与编码转铁蛋白受体的质粒和缺乏插入物的pCDNA3载体共转染的对照细胞的循环动力学也显示（○）。
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