简介
在肿瘤生长过程中,肿瘤细胞的适应是由不利的微环境条件驱动的,如缺氧和饥饿( 1 ). 雷帕霉素复合物1的力学指标 ( mTORC1)通过磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)对局部营养状态和生长因子信号作出反应,以调节蛋白质合成和细胞内环境稳定,从而调节癌细胞的生长、代谢和转移( 2 - 4 ). 然而,使用变构mTOR抑制剂雷帕霉素或其类似物阻止肿瘤生长的尝试却收效甚微( 5 ). 虽然这些药物强烈降低了对两个特征明确的mTORC1靶点之一核糖体蛋白p70-S6激酶1(S6K1)的信号传导,但它们通常对另一个靶点——真核翻译起始因子4E结合蛋白1(4E-BP1)——真核起始因子4E的负调节因子(eIF4E)——的影响更为有限( 6 , 7 )与转移性生长有关( 8 , 9 ). 这种耐药性有时可以通过使用三磷酸腺苷(ATP)竞争性mTOR抑制剂来规避( 5 - 7 ),也阻断其他mTOR激酶复合物mTORC2。 然而,mTOR结构如何变化( 10 )或mTOR调节剂调节雷帕霉素敏感性仍然很有意思。
质子辅助氨基酸转运蛋白(PAT)或SLC36家族成员( 11 )被确定为生长和mTORC1信号的正调节因子 体内 苍蝇基因过表达筛查( 12 , 13 ). 通过对两个普遍转录的人类的特征分析,这些效应被证明是保守的 拍打 第页, PAT1型 ( SLC36A1型 )和 第四阶段 ( SLC36A4型 ) ( 14 ). 原型PAT家族成员PAT1是一种溶酶体氨基酸转运蛋白[AAT]( 15 , 16 ). 在快速生长的细胞中,它位于富含营养物质的晚期内胚体和溶酶体(LEL)室的表面( 13 ),其中mTOR因氨基酸刺激而积累。 mTOR的招募需要组装一个多蛋白复合物,包括猛禽、Ras相关Rag GTPases的异二聚体对、五聚体Ragulator和Vacuolar-H + -小室表面的ATP酶(V-ATP酶)质子泵,在( 2 , 三 ). PAT1还与该复合体相互作用,促进LEL上的mTOR定位和随后的mTORC1信号。 PAT的氨基酸感应可能涉及通过所谓的“受体”机制进行转运或信号传递( 4 , 13 , 17 ).
最近的研究在相关的SLC38家族中发现了一种AAT,即SLC38A9,它也与mTORC1调节机制在LEL上相互作用,可能对精氨酸产生反应( 18 , 19 )表明不同LEL定位的mTORC1调节性AAT可能感知不同的氨基酸。 此外,Golgi-localised Rab1A等分子的鉴定( 20 )和ADP核糖基化因子Arf1( 21 )和磷脂酶D( 22 , 23 )作为Rag-independent的调节因子,mTORC1激活表明其他氨基酸传感机制尚待发现。
这里我们研究PAT4在结直肠癌中的功能。 结直肠癌通常对雷帕霉素耐药( 6 )并且经常转移,严重影响临床结果( 24 , 25 ). 我们发现PAT4上调与癌症进展相关。 通过使用诱导物 第四阶段 在HCT116结直肠癌细胞中shRNA敲除,我们发现PAT4对两种快速代谢的非必需氨基酸谷氨酰胺和丝氨酸产生反应( 26 , 27 ),以驱动雷帕霉素耐药,mTORC1介导的细胞增殖。 此外,我们提供了PAT4与高尔基体上的Rab1A和mTORC1相互作用的证据,表明PAT4在该隔室的氨基酸传感中起作用。
结果
新型PAT4单克隆抗体的验证
我们产生了一种针对PAT4的高度特异性小鼠单克隆抗体(抗体PAT4/9/H10)。 用该抗体染色显示,PAT4定位于福尔马林固定、石蜡包埋的786-O肾癌细胞中的不对称核周区域,该细胞表达高PAT4水平,而在转染了 第四阶段 小干扰RNA( 图1A和B ). 在细胞裂解物的蛋白质印迹上观察到60-75kDa分子量的条带( 图1C )并在之后大幅减少 第四阶段 击倒,确认抗体特异性。 用糖苷酶、肽-N-糖苷酶F(PNGase F)对裂解产物进行预处理后,涂片分解成约30 kDa的条带,该条带小于预测的55 kDa分子量( 图1D ).
图1。
验证“内部”生成的抗PAT4单克隆抗体。 A类 和 B类 ,福尔马林固定,石蜡包埋786-O细胞与PAT4单克隆抗体(PAT4/9/H10)孵育并用3,3′-二氨基联苯胺(DAB)可视化。 在用干扰控制siRNA(A)处理的大多数细胞中,可见明显的核周染色区。 当 第四阶段 使用siRNA敲除转录本 第四阶段 (si435[ 14 ]; B) ●●●●。 C类 用PAT4单克隆抗体Pat/9/H10对携带IPTG诱导的shPAT4(43587;shPAT5)的786-O细胞池产生的细胞裂解物(15、7.5和3.8μg蛋白质)的系列稀释液进行western blot分析。 这揭示了一组60-75kDa的谱带,这些谱带被IPTG诱导的 第四阶段 击倒(+IPTG),表明它们是PAT4特有的。 还用抗微管蛋白抗体作为负载对照来探测蛋白质印迹。 D类 在电泳去除糖基之前,用PNGase F处理786-O细胞和GFP-PAT4过度表达的HEK-293细胞系的细胞裂解物的western blot。 这将未经处理的细胞裂解液中的交叉反应分子分解成更特异的条带,分别在约30和50 kDa处迁移,小于预测的55 kDa(PAT4)和85 kDa的分子量(GFP-PAT4( 43 ).
PAT4高表达与结直肠癌患者预后不良相关
为了检测PAT4在人类结直肠癌中的表达是否发生改变,我们对107例仅接受手术切除治疗的患者的原发肿瘤组织微阵列进行了染色。 病理学家(CS)将细胞质染色的强度分为三类( 图2A和B ; 见材料和方法),均高于正常大肠上皮。 统计分析表明,PAT4的高表达与标准临床或病理变量(包括肿瘤部位、肿瘤分期、淋巴结或远端转移、年龄、淋巴管、血管或神经侵袭、分化或性别)无关( 补充表S1 ).
图2。
PAT4的高表达预示着结肠癌的无复发生存率较差。 对107例原发性结肠癌患者肿瘤中PAT4的表达进行评估,并根据PAT4表达进行分层。 A类 , B类 由免疫组织化学测定的低和高PAT4表达水平的代表性图像。 二氨基联苯胺棕色染色显示免疫反应。 C类 Kaplan-Meier曲线比较高表达水平与低表达水平。 P值是对数库测试(Mantel-Cox)的结果。 D类 ,PAT4高表达和低表达患者的病例处理总结。 A中的比例尺为50μm。
在单变量分析中,高PAT4水平(P=0.01)、高肿瘤分期(P<0.01)、肿瘤分期评分(P<0.01)、肠穿孔(P=0.02)、神经侵袭(P<0.01( 补充表S2 ). PAT4表达较高的癌症患者的平均无复发生存期明显短于表达较低的癌症患者(P<0.01; 图2C和D ). 此外,在多变量生存分析中,较高的PAT4水平具有统计学意义(P<0.01; 补充表S3 ). 多变量模型包括了单变量分析中除总体分期外与复发显著相关的所有变量,因为这是根据肿瘤分期(T)、淋巴结转移(N)和远处转移(M)分期计算的。 我们得出结论,PAT4水平升高与结直肠癌患者的预后较差有关。
PAT4调节HCT116细胞增殖
为了分析HCT116结直肠癌细胞中PAT4的功能,我们建立了稳定的转导细胞系,每个细胞系携带三种不同的慢病毒构建物中的一种,表达 第四阶段 异丙基β-D-1-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导控制下的短发夹(sh)RNA。 对于每种结构,代表许多单独转导事件的集合细胞减少了 第四阶段 转录物水平,如通过定量实时PCR(qRT-PCR; 补充图S1A ). 选择两个shRNAs,49384和49387进行进一步研究。 诱导一致强大 第四阶段 从另一shRNA转导中分离到敲除的单细胞克隆,分别命名为shPAT4(4.8)和shPAT5(7.1( 补充图S1B ). 体外 这些克隆与含有IPTG诱导的非靶向shRNA基因(shNT)的HCT116细胞的培养显示,IPTG的诱导特异性抑制了shPAT4表达细胞的增殖(P<0.05; 图3A )对细胞死亡没有显著影响( 补充表S4 ).
图3。
PAT4调节HCT116细胞的生长 在体外 和 体内 . A类 用靶向PAT4的两个独立IPTG诱导shRNA结构之一,即shPAT4(4.8)和shPAT7(7.1),或IPTG引导的非靶向对照结构(shNT),在IPTG存在和不存在的情况下,测量稳定转导的HCT116细胞克隆的增殖(n=3)。 B类 和 C类 ,人类HCT116肿瘤异种移植物在免疫缺陷小鼠体内的平均生长曲线(±SEM),该免疫缺陷小鼠携带用shNT(B)转导的细胞池,具有(空白圆圈)或不具有(填充正方形)IPTG诱导,或shPAT4转导的HCT116细胞(C)具有(空白正方形,用红色勾勒)或不具备(填充正方体)IPTG-诱导(n=7)。 (B,C)中的数据通过非配对双尾独立Student t检验进行分析。 D类 和 E类 ,七只动物的Kaplan-Meier生存曲线,包括IPTG诱导和不诱导shNT-(D)和shPAT4-(E)HCT116肿瘤; 对数库(Mantel-Cox)测试:(E)的P=0.019。 对于shPAT4诱导型细胞,需要在36天内(中位生存时间为36天)处死7只未诱导的小鼠(实心正方形)中除1只外的所有小鼠,而从38天起处死所有7只诱导的小鼠(空心正方形,红色轮廓),中位生存时间为50天。 细胞增殖实验重复三次* P<0.05。
PAT4在异种移植模型中促进人类肿瘤生长
为了评估PAT4在肿瘤生长中的作用,在异种移植实验中使用了携带shPAT4(49387)的HCT116细胞的混合克隆。 我们推断 第四阶段 敲除这些细胞可能会更好地模拟表达不同PAT4水平的异质性肿瘤中发生的变化。 IPTG对肿瘤生长的影响 第四阶段 在60天的时间内评估小鼠shPAT4 HCT116细胞的敲除。 在免疫缺陷小鼠的饮用水中向其提供IPTG以诱导shRNA的表达。 IPTG没有改变shNT细胞形成的肿瘤大小( 图3B ). 然而,与非诱导shPAT4对照组相比,IPTG诱导的shPAT5表达显著降低了肿瘤生长( 图3C ; P<0.01)。 此外,shPAT4诱导将小鼠的中位生存时间从36天延长到50天(比值:0.72,95%CI比值:0.36到1.07;Gehan-Breslow-Wilcoxon试验,P=0.008; 图3D和E ). 诱导 第四阶段 第二次实验中的敲除也显著降低了平均肿瘤体积(P<0.05)并提高了动物存活率(P<0.05 体内 .
PAT4调节抗雷帕霉素的mTORC1
确定如何 第四阶段 敲除可能抑制肿瘤生长,我们分析了稳定转染HCT116克隆中携带诱导物的mTORC1信号- 第四阶段 shRNAs、shPAT4(4.8)和shPAT5(7.1),以及非目标克隆shNT。 与786-O细胞相比,HCT116细胞中PAT4蛋白的表达水平要低得多,因此用PNGase F预处理HCT116大池细胞的裂解液以检测PAT4,PAT4分解成一个特定的30kDa带,在敲除细胞中加入IPTG后,该带明显减少( 图4A和B ).
图4。
PAT4选择性地影响mTORC1靶点4E-BP1。 携带IPTG诱导的shNT或shPAT4(4.8)(A,C)或shNT的HCT116细胞蛋白质提取物的蛋白质印迹,以及在有和无IPTG的情况下培养的shPAT5(7.1)结构体(B,D)。 A类 和 B类 , 第四阶段 敲除降低了电泳前用PNGase F培养细胞裂解物后检测到的PAT4蛋白水平。 C类 - F类 , 第四阶段 敲除显著降低了4E-BP1最磷酸化γ形式的水平,这既可以通过抗磷酸化Ser65-4E-BP1(p-S65-4E-BPl)抗体观察到,也可以通过pan-4E-BPl抗体观察到上层带(箭头所示;在三个独立实验中分别以直方图E和F中4E-BPI总染色的比例进行量化)。 磷酸-S6K(p-T389-S6K1)、磷酸-S6(p-S240/244-S6)、磷酸-Akt(p-S473-Akt)和磷酸-ERK(p-T202/Y204-ERK)水平基本上不受 第四阶段 击倒。 用抗微管蛋白抗体检测印迹作为负荷控制。 在三个单独的实验中重现了这些效果* P<0.05** P<0.01。
IPTG诱导 第四阶段 敲除选择性地减少4E-BP1的最高度磷酸化形式,在western blot上指定为γ带( 28 )而磷酸化程度较低的形式增加( 图4C-F ). 人类4E-BP1至少有八个磷酸化位点( 28 ). eIF4E结合的关键残基Ser65处4E-BP1的磷酸化( 29 )通常需要,以形成γ带。 抗磷酸化Ser65-4E-BP1抗体证实,该残基(p-S65-4E-BP1)的磷酸化通过 第四阶段 击倒。 相反,p-T37/46-4E-BP1的整体磷酸化保持不变,但在击倒后分布在多个4E-BP1带之间。 第四阶段 敲除对S6K1(p-T389-S6K1)和S6(p-S240/244-S6)磷酸化均无影响( 图4C和D ),或有时导致p-S240/244-S6的适度减少(例如。, 图5A 和 补充图S2C ).
图5。
PAT4在HCT116细胞中调节雷帕霉素抗性形式的mTORC1,并增加HEK-293细胞中的雷帕霉素抗性。 A类 和 B类 ,携带IPTG诱导物的HCT116细胞克隆 第四阶段 shRNA结构shPAT4(4.8)和IPTG诱导的非靶向对照结构shNT在无IPTG或有IPTG的情况下培养5天,如果需要,在最后24小时内用雷帕霉素处理。 雷帕霉素(3 nM;参见 补充图S2A和S2B )强烈降低磷酸化-S6水平(p-S240/244-S6),并部分影响Ser65磷酸化4E-BP1(p-S65-4E-BPl)γ带(箭头)。 这种抗雷帕霉素的磷酸化-4E-BP1γ带在 第四阶段 击倒(B)。 C类 shPAT4(4.8)细胞和shNT对照细胞在没有或存在IPTG的情况下培养8天,并用雷帕霉素处理3天。 然后对细胞进行计数,发现雷帕霉素存在时两种细胞系的增殖都降低,IPTG存在时shPAT4(4.8)的增殖也降低(n=3)。 雷帕霉素和IPTG的结合导致shPAT4的细胞数量进一步减少(4.8)。 D类 和 E类 正常HEK-293细胞或稳定转染有组成性表达的GFP-PAT4构建物的细胞在存在或不存在100 nM雷帕霉素的情况下培养24小时(参见 补充图S2F )然后对细胞裂解产物进行西方分析。 GFP-PAT4表达降低雷帕霉素对γ-磷酸化4E-BP1带(E)的影响,但不降低磷酸-S6(p-S240/244-S6)、磷酸Akt(p-S473-Akt)或磷酸ERK(p-T202/Y204-ERK)的影响。 用抗微管蛋白抗体检测所有印迹,作为负荷对照。 (*P<0.05;n=3)。 细胞增殖实验重复三次。
为了确认这一点 第四阶段 敲除并不是通过抑制上游PI3K/Akt信号而改变4E-BP1磷酸化,而是评估磷酸化mTORC2-reregulated Akt(p-S473-Akt)的水平; 未观察到任何变化( 图4C和D ). 致癌形式的KRAS对ERK MAPK(p-T202/Y204-ERK)的磷酸化也与结直肠癌对mTOR激酶抑制剂的耐药性有关( 30 ). HCT116细胞携带致癌KRAS-G13D等位基因,但 第四阶段 敲除并没有降低ERK磷酸化( 图4C和D )这表明它并不通过ERK调节mTORC1。
The selective action of第四阶段 与mTORC1通路的S6K/S6信号臂相比,4E-BP1磷酸化的敲除与雷帕霉素在这些细胞中的作用是互补的( 6 ),其中4E-BP1γ-磷酸化对该药物特别具有耐药性。 即使在基本上阻止S6磷酸化的雷帕霉素浓度下,仍观察到残留的4E-BP1γ-磷酸化,以及Ser65上磷酸化的低分子量4E-BPl( 图5A , 补充图S2A和B ). 然而,当雷帕霉素和 第四阶段 结合敲除,磷酸化4E-BP1的γ型和剩余的p-S65-4E-BPl带几乎完全丢失( 图5A和B 和 补充图S2C和S2D ). 与雷帕霉素不同,mTOR的ATP激酶抑制剂PP242强烈影响HCT116细胞中4E-BP1γ-磷酸化和S6K活性( 补充图S2E ). 总之,这些发现表明,在HCT116细胞中,基本上所有4E-BP1γ-磷酸化都依赖于mTORC1(另见参考文献。 30 ),但某些磷酸化是雷帕霉素抗性的,并受PAT4的调节。 重要的是,雷帕霉素和 第四阶段 敲除对HCT116细胞增殖也有加性影响( 图5C )证明它们抑制不同的mTORC1复合物,这两种复合物都在细胞增殖中发挥作用。
为了测试PAT4表达与雷帕霉素耐药之间的联系,我们在HEK-293细胞中过度表达了GFP标记的PAT4。 我们之前已经在这些细胞中显示,siRNA诱导的PAT4敲除可降低4E-BP1和S6K/S6磷酸化,这一点已通过shRNA敲除得到证实( 补充图S3 ). 我们观察到4E-BP1过度磷酸化在HEK-293细胞中显示出一些雷帕霉素抵抗( 补充图S2F ). GFP-PAT4的强过表达,在PNGase预处理后,在western blot上产生几个蛋白带,分辨率为50kDa带( 图1D )过度磷酸化的p-Ser65-4E-BP1增强了雷帕霉素抵抗力( 图5D和E ). 这表明高PAT4水平可诱导多种不同类型细胞对雷帕霉素产生耐药性。
雷帕霉素耐药mTORC1对谷氨酰胺和丝氨酸的PAT4依赖性敏感性
由于PAT与氨基酸依赖性mTORC1激活有关,我们假设PAT4可能感知调节雷帕霉素抗性mTORC1的特定氨基酸水平。 我们使HCT116细胞缺乏特定氨基酸,包括HCT116生长所需的两种非必需氨基酸。 非必需丝氨酸被转移到糖酵解中,而谷氨酰胺通过谷氨酰胺水解作用为癌细胞(包括HCT116细胞)的三羧酸(TCA)循环提供燃料( 26 , 27 , 31 ). 在四个小时内减少任一氨基酸,尤其是谷氨酰胺,对4E-BP1过度磷酸化的抑制作用强于任何必需氨基酸的损失( 图6A ).
图6。
谷氨酰胺和丝氨酸选择性调节HCT116细胞中PAT4依赖性雷帕霉素抗性mTORC1信号传导。 A类 HCT116细胞在不同的培养物中饥饿必需氨基酸、甘氨酸(Gly)、异亮氨酸(Ile)、亮氨酸(Leu)、苏氨酸(Thr)和色氨酸(Trp)以及非必需氨基酸、丝氨酸(Ser)和谷氨酰胺(Gln)四小时,然后提取蛋白质并进行western blotting。 在此之后,谷氨酰胺消耗使4E-BP1的γ-磷酸化减少最多(箭头所示); 丝氨酸耗竭也会导致更温和的转变。 B类 ,携带IPTG诱导物的HCT116细胞克隆 第四阶段 shRNA构建物shPAT4(4.8)和IPTG诱导的非靶向对照构建物shNT在不含IPTG的情况下暴露于含有不同浓度谷氨酰胺的培养基中4小时。 在这些条件下,shPAT4(4.8)细胞表达约为正常细胞的50% 第四阶段 mRNA水平( 补充图S1B )由于泄漏 第四阶段 shRNA转录。 随着谷氨酰胺浓度下降,shPAT4(4.8)细胞中4E-BP1的γ-磷酸化明显降低。 S6磷酸化似乎也受到低谷氨酰胺浓度的影响。 C类 除培养基中丝氨酸含量不同外,实验与(B)相同。 同样,shPAT4(4.8)细胞在丝氨酸浓度降低时具有较低的4E-BP1γ-磷酸化。 D类 和 E类 经雷帕霉素处理的HCT116细胞在经历不同水平的谷氨酰胺(D)和丝氨酸饥饿(E)四个小时后,4E-BP1的γ-磷酸化水平显著降低。
如果谷氨酰胺和丝氨酸对4E-BP1的某些选择性作用是通过PAT4依赖的传感机制介导的,我们推断PAT4水平的适度变化可能会改变HCT116细胞对谷氨酰胺和丝氨酸饥饿的敏感性。 我们的 第四阶段 击倒克隆显示IPTG非依赖性shRNA击倒泄漏( 补充图S1B )通常不影响4E-BP1磷酸化( 图5A )或扩散( 图3A ). 我们在没有IPTG的情况下测试了这些细胞的氨基酸敏感性。 4E-BP1过度磷酸化对shPAT4中谷氨酰胺和丝氨酸水平的降低更敏感(4.8)( 图6B和C )和shPAT4(7.1)( 补充图S4 )克隆,表明PAT4参与这些代谢重要氨基酸的传感。 有趣的是,在这些实验中,S6磷酸化似乎对减少的谷氨酰胺和丝氨酸更为敏感,这表明抗雷帕霉素的mTORC1在某些条件下可以直接或间接调节S6K活性,或者饥饿影响PAT4对抗雷帕霉素的mTORC的特异性。 谷氨酰胺或丝氨酸饥饿与雷帕霉素联合治疗对4E-BP1过度磷酸化的影响大于单独治疗( 图6D和6E )支持我们的结论,即这些氨基酸由PAT4调节的雷帕霉素耐药mTORC1感应。
Golgi-localised PAT4与mTORC1相互作用
HCT116细胞的免疫荧光染色显示,PAT4集中于反高尔基网络及其附近( 图7A ). 在786-O细胞中观察到类似的定位( 补充图S5A ). 此前的一份报告也表明,HEK-293T细胞中PAT4的过度表达并不在LEL上( 32 ). 有趣的是,尽管在正常培养条件下,大多数mTOR定位在LEL周围,但也观察到一些与转高尔基体网络的共定位( 图7B ),增加了它可能与该隔室中的PAT4相关的可能性。
图7。
PAT4和mTOR位于HCT116细胞的高尔基体上。 A类 ,内源性PAT4(绿色)在HCT116细胞中包含转高尔基体网络(TGN46;红色)的腔室中表达。 B类 ,虽然大多数mTOR(绿色)位于HCT116细胞中LAMP2阳性的晚期内体和溶酶体(蓝色)上,但一些mTOR染色也与反高尔基网络重叠(红色;由合并图像中的箭头指示)。 DAPI用A(蓝色)和B(白色)标记细胞核。 比例尺为5μm。 合并图像中的共焦通道显示如下:绿色(G)、蓝色(B)和红色(R)。
为了进一步研究这一点,我们使用了表达GFP标记的PAT4的雷帕霉素耐药HEK-293细胞( 图5D ). GFP-PAT4也位于trans-Golgi网络及其周围( 图8A ). Golgi-localised Rab1A是一种参与膜转运事件的单体GTPase,最近被证实与高尔基体mTORC1的氨基酸依赖性激活有关( 20 ). 我们测试了Rab1A是否可能与PAT4相互作用。 我们使用了邻近连接分析(PLA),它检测特定的蛋白质相互作用 就地 当识别这些分子的抗体非常接近时( 33 ). 尽管抗Rab1A染色主要局限于顺式高尔基体( 图8B )、Rab1A和GFP抗体在相邻隔间产生PLA信号( 图8C ),在不表达GFP-PAT4的细胞中不存在( 补充图S5B ). 该信号经常与GFP-PAT4重叠,部分位于trans-Golgi网络内( 图8D )表明Rab1A和PAT4可以在高尔基体上相互作用。 此外,PLA使用抗mTOR( 图8E )或反猛禽( 图8F 和 补充图S5C )抗GFP抗体也主要在含有GFP-PAT4的包含转高尔基体网络的隔室中产生特异性信号。这表明mTORC1与高尔基体上的PAT4相互作用,这与PAT4可以从该隔室调节mTORC2活性的想法一致。
图8。
PAT4与高尔基体上的Rab1A和mTORC1相互作用。 A类 HEK-293细胞中的GFP-PAT4融合蛋白(绿色)在转高尔基体上显示出与HCT116细胞相似的亚细胞定位(TGN46;红色)。 在图8D中,用相同的标记物对具有更高分辨率的替代细胞进行染色。 B类 ,Rab1A(蓝色)主要定位于顺高尔基体上,由GM130标记(红色)标记。 C类 , 就地 邻近连接分析(PLA;红色)揭示了Rab1A(蓝色)和GFP-PAT4(绿色)之间的相互作用,主要与含有GFP-PAT_4的隔间有关(GFP-PAT3和PLA信号之间的重叠在合并图中为黄色,右上角;箭头)。 PLA信号也与Rab1A集中在Rab1A和PLA合并处的隔间相邻并部分重叠,右下面板。 Rab1A/PAT4 PLA信号仅在GFP-PAT4表达细胞中观察到(参见 补充图S5B ). D类 ,一些GFP-PAT4/Rab1a PLA阳性相互作用小室(红色)也部分或全部被转高尔基体网络标记TGN46(蓝色;箭头)标记,但不是缺少GFP-PAT_4的转高尔基区域。 E类 ,PLA(红色)显示mTOR(蓝色)和GFP-PAT4(绿色)之间的相互作用,部分与包含GFP-PAT_4的隔间重叠(黄色表示包含绿色和红色通道的合并,包括右上面板中的放大图像;箭头)。 在低倍合并图像中,不表达GFP-PAT4的两个上部细胞没有发出PLA信号,表明该分析专门检测GFP-PAT_4/mTOR相互作用。 蓝色和红色通道合并(右下方面板)显示,mTOR染色通常与PLA信号非常接近,但也在细胞内的许多其他位置发现。 F类 ,PLA(红色)显示了Raptor和GFP-PAT4(绿色)之间的交互作用(红色),位于包含GFP-PAT3的隔间及其附近(绿色和红色通道合并中的黄色重叠,包括右上面板中的放大图像;箭头和箭头)。 蓝色和红色通道合并(右下方面板)显示,一些PLA信号与trans-Golgi相邻或部分同位(TGN,蓝色;箭头),而其他信号则不相邻(箭头)。 Raptor/GFP-PAT4 PLA信号仅在表达GFP-PAT4的细胞中观察到(参见 补充图S5C ). DAPI标记合并中A(蓝色)和B-F(白色)的细胞核。合并图像中的共焦通道如下所示:绿色(G)、蓝色(B)和红色(R)。 比例尺为5μm。
讨论
尽管mTORC1对抑制剂的耐药性可以部分地解释为差异 在体外 底物靶点的灵敏度( 34 ),越来越多的证据表明,在癌细胞中也存在不同的mTORC1复合物( 20 - 23 , 35 )这可能使他们对雷帕霉素等药物有不同的敏感性。 在本研究中,我们证明PAT4调节HCT116细胞中的雷帕霉素耐药mTORC1,并且在HEK-293细胞中过度表达时可以诱导雷帕霉素耐药性增加。 PAT4和雷帕霉素抗性mTORC1对正常细胞增殖至关重要 在体外 此外,PAT4表达水平可预测结直肠癌的早期复发,提示在获得更具侵袭性的肿瘤表型方面具有病理生理作用。
我们的发现支持了一种模型,即mTORC1的雷帕霉素耐药型和雷帕霉素敏感型可以独立控制,并提供了一种新的遗传工具来分离这两种信号功能( 图9 ). 雷帕霉素耐药的mTORC1选择性地(但不限于)调节4E-BP1过度磷酸化,而4E-BPl过度磷酸化也是小鼠红白血病细胞中P53活化的特异靶点( 27 )进一步支持了这是一个独特的综合体的观点。 然而,这种选择性效应( 图4 和 补充图S2C )不是普遍的。 在其他类型的细胞中,PAT4主要调控mTORC1复合物,控制4E-BP1和S6K( 补充图S3 ; 裁判。 14 )表明细胞类型特异性调节因子或PAT4表达水平调节该转运蛋白控制mTORC1的特异性。 事实上,只有当PAT4过度表达时,HEK-293细胞才会表现出可检测到的PAT4依赖性雷帕霉素耐药性( 图5D ).
图9。
HCT116细胞中雷帕霉素敏感和耐药mTORC1复合物的示意图。 S6K和4E-BP1是真核生物起始因子(eIF4E)的负调控因子,是mTORC1最具特征的下游靶点。 尽管雷帕霉素治疗强烈抑制S6K磷酸化,但它对Ser65处4E-BP1γ带磷酸化的影响较弱。 较少磷酸化形式的4E-BP1与eIF4E结合导致翻译抑制( 8 ). 降低PAT4活性主要影响抗雷帕霉素的mTORC1形式。 这导致4E-BP1的Ser65磷酸化形式减少,但对S6K磷酸化的影响较小。 SLC36(PAT)和/或SLC38家族中的其他氨基酸转运蛋白可能参与雷帕霉素敏感性mTORC1调节,例如PAT1和SLC38A9。 PP242是一种mTORC1-ATP激酶抑制剂,对雷帕霉素敏感型和耐药型mTORC1都起作用。 箭头表示正信号,横线表示抑制信号事件。
有人认为,PAT4通过跨质膜运输氨基酸来调节mTORC1信号传导( 36 ). 然而,这在我们的细胞模型中似乎不太可能,原因有三:第一,细胞表面PAT4蛋白水平很低( 图1A , 7 和 8 ) ( 32 , 36 ); 其次,PAT4似乎是一种低容量运输工具( 37 ); 第三,很难解释细胞表面转运体如何仅影响雷帕霉素耐药mTORC1。 我们支持PAT4与高尔基体上的mTOR相互作用的模型,尽管它也可能从其他亚细胞亚区调节mTORC1。
我们的研究还揭示了HCT116细胞中mTORC1靶点4E-BP1对两种非必需氨基酸谷氨酰胺和丝氨酸的还原具有选择性敏感性,但对mTORC1-调节因子亮氨酸没有选择性敏感性,后者的细胞内水平可由谷氨酰胺调节( 38 ). Arf1 GTPase调节包括高尔基在内的多个隔室的贩运,最近也被mTORC1牵连到谷氨酰胺传感中( 22 ). 一个关键问题是PAT4和Arf1是否参与常见的mTORC1调节机制。 由于PAT4的氨基酸特异性不同于精氨酸敏感性,因此mTORC1调节SLC38A9( 18 , 19 )和PAT1( 15 ),一系列AAT可能决定mTORC1对不同氨基酸的敏感性。 SLC38A9独特的N末端结构域似乎与Ragulator复合物结合,具有比其他转运蛋白更高的亲和力( 18 ). SLC38A9还通过包括其跨膜结构域在内的序列与V-ATP酶以较低亲和力相互作用,这些序列与其他SLC38和SLC36(PAT)家族成员具有相似性。 这可能解释了为什么其中一些转运体可以调节mTORC1,但有些,如PAT4,即使PLA表明它们相互作用,也不能抑制其他mTORC1超复杂成分 就地 .
4E-BP1过度磷酸化对4小时谷氨酰胺或丝氨酸饥饿的PAT4依赖性敏感性可能反映了这两种非必需氨基酸在HCT116细胞中的快速代谢( 23 , 27 ). 尽管它的名字,当异源表达在 爪蟾 卵母细胞,PAT4可以通过非质子耦合机制运输氨基酸。 它似乎对脯氨酸和色氨酸具有很高的底物亲和力,但容量很低( 37 ). 其他几种氨基酸,包括谷氨酰胺和丝氨酸,以较低的亲和力结合,可以与高亲和力PAT4底物竞争,尽管它们可能不会被转运。 这可能提供一种运输依赖的、氨基酸敏感的“受体”机制,与先前对PAT的建议一致( 17 ). 通过表达更多的PAT4,细胞将对高代谢氨基酸的消耗具有更强的抵抗力,这解释了结直肠癌患者的临床数据。
总之,我们的研究表明,通过阻断雷帕霉素耐药的4E-BP1选择性途径,对结直肠癌中上游mTORC1激活物(如PAT4)的药理抑制可以补充雷帕霉素的作用。 PAT4还可能为雷帕霉素耐药的侵袭性更强的大肠肿瘤提供新的生物标记物。
材料和方法
细胞培养
HCT116细胞在McCoy的5A改良培养基(Gibco ® 含10%胎牛血清(FCS;Gibco)的Invitrogen ® Invitrogen),除非另有规定。 786-O和HEK-293细胞在含有10%FCS的DMEM中培养。 细胞在37°C和5%CO中培养 2 在播种后24小时进行雷帕霉素处理。 用3nM(HCT116)或100nM(HEK-293)雷帕霉素(从二甲基亚砜(R8781;Sigma)中的储备溶液中稀释)或按剂量-反应曲线规定处理细胞24小时或72小时进行细胞增殖分析。 从ATCC中获得Founder细胞系,并在复苏后6个月内使用(<25代)。 用于击倒的si435 第四阶段 表达和干扰控制siRNA( 图1 )之前在中描述过( 14 ).
诱导性shRNA-表达慢病毒
西格玛使命 ® 携带以下克隆的慢病毒颗粒:TRCN0000043984 5′-CCGGCTTGATAATAGAGCAGAATT-CTCGAATTCTCATTACAGGTTTTTTG-3′,称为shPAT4(43984),TRCN000004985 5′-CGG-CCTGGAGAGAAGTAGAGTTATACTCGAG-ATAAACACTTCCAGTTTTG-3’(shPAT4[43985]) ]将IPTG诱导慢病毒载体pLKO IPTG_1×LacO中的TRCN00000439887 5′-CCGGCAGATGTTGTCAGGAACATCTCGAG-ATGTCGAG-ATGTCGACACATGGTTTTG-3′(shPAT4[43987])和非靶向控制结构(SHC312V;shNT)转导至HCT116细胞。 虽然shPAT4(43984)与siRNA(435)部分重叠,但shPAT4(43985)和(43987)与先前使用的siRNA没有重叠( 14 ). 在大多数实验中,克隆shPAT4(7.1)比克隆shPAT_4(4.8)产生更强的敲除作用,对增殖和mTORC1信号传导的影响更大。
shRNA株的产生和诱导
用慢病毒载体转导细胞,在聚brene存在下,以三种病毒颗粒对细胞的多重感染。 在转导后两天开始选择嘌呤霉素,以产生来自多个转导事件的细胞池。 转导后不久,用极限稀释法分离出单细胞克隆。 添加100μM IPTG进行诱导。 IPTG处理的细胞在电镀前提前诱导五天。
氨基酸饥饿培养基
培养基基于DMEM(11995-065;Invitrogen),但内部制作,因此可以单独省略不同的氨基酸。 对于谷氨酰胺,已经有一种缺乏这种氨基酸的培养基(McCoy的5A不含谷氨酰胺[M8403;Sigma])。 细胞连续四个小时缺乏氨基酸。
GFP-PAT4稳定细胞系的建立
将来自IMAGE Clone ID:531323的PAT4开放阅读帧重组为pOPINE载体,其中包含帧内C端GFP序列(pOPINE-GFPc;来自J Beale和S Newstead的礼物)。 中的以下错误 第四阶段 使用Quickchange校正cDNA序列(与注释的转录物序列相比) ® 定点突变试剂盒(Invitrogen):I209L(ATA->CTA)H376P(CCT->CAT)I429L(ATA->CTA)。 通过PCR扩增PAT4-GFP融合并克隆到pcDNA3.1(+)中 千磅 我和 Xba公司 I站点。 扩增的PAT4和GFP ORF作为GFP-PAT4融合物重新接入pcDNA3.1(+)。 用该构建物或空pcDNA3.1(+)载体用脂质体转染HEK-293细胞 ® 2000(Invitrogen)。 48小时后,使用800μg/ml Geneticin(Gibco)筛选稳定转染细胞 ® ; Invitrogen),如中所述( 14 ).
异种移植研究
根据内政部的规定,所有协议都是在项目许可证30/2771下执行的( 39 )使用6-7周龄女性BALB/c SCID 努 / 努 老鼠(Harlan Sprague Dawley,Inc)。 2.5 × 10 6 将50μl无血清培养基中的HCT116细胞和50μl Matrigel(BD Bioscience)皮下注射到一侧(每组7只小鼠;动物未随机,研究人员未盲法;数量基于之前的异种移植研究)。 将10 mM IPTG(Carbosynth Inc)添加到治疗小鼠的饮用水中。 每周使用卡尺测量肿瘤生长三次,并根据公式1/6π×长×宽×高计算体积。 重复该实验,生长和存活时间的影响也发生了类似的显著降低。
定量实时PCR
如前所述进行RNA提取和定量实时PCR(qRT-PCR)( 14 ),具有的Ct值 第四阶段 根据 HPRT1型 家政基因。
细胞增殖分析
细胞增殖实验重复三次,每次至少使用三个孔。 如果发现具有统计意义的结果,则在所有情况下都会观察到这些结果。 根据中描述的方法对细胞进行计数( 14 )
蛋白质斑点
蛋白质裂解物通常装在10%聚丙烯酰胺凝胶上。 为了进行免疫印迹,在推荐的稀释液中使用了以下主要抗体:磷酸化-S6K1 Thr308(细胞信号技术[CST#9205])、S6K1(CST#9202)、磷酸化-Ser240/244-核糖体S6蛋白(细胞信号技术[CST#2215]),S6核糖体蛋白(CST#2217),磷酸化-Ser 65-4E-BP1兔多克隆(CST#19451), 4E-BP1(CST#9644)、磷酸化-Ser473-Akt(CST#4060)、Akt、磷酸化-Thr202/Tyr204-p44/42 MAPK(Erk1/2;CST#4370)、p44/42 MAPK(Erk 1/2;CST#4695)和α-微管蛋白(Sigma#T6199)。 用二级抗体(Promega#W401B,#W402B)检测并使用SuperSignal进行可视化 ® West Pico化学发光基板套件(Thermoscific)。 根据制造商的说明,用PNGase F(新英格兰生物实验室;#P0704)对PAT4进行脱糖。
PAT4单克隆抗体的制备
通过使用基于PAT4 N末端内抗原氨基酸序列(REELDMDVMRPLINEC)的锁孔帽贝血蓝蛋白-(KLH−)偶联半胱氨酸偶联肽(Severn Biotech Ltd)免疫小鼠,制备了抗PAT4的单克隆抗体。
免疫组织化学
使用了以下商业一级抗体:mTOR(CST#2983;1/100)、LAMP2小鼠单克隆抗体(Abcam,ab25631:1/100)、TGN46绵羊多克隆抗体(Novus Biologicals NB110-40767:1/200)、Rab1a兔单克隆抗体, 猛禽兔多克隆(Merck Millipore,09-217:1/100)和驴体内产生的二级抗体(Jackson ImmunoResearch:1/500)。 如中所述对细胞进行处理和成像( 13 , 40 ). 使用Duolink进行近端结扎分析 ®
现场 橙色初级鼠标/兔子套件(DUO92102,Sigma)符合制造商的说明。
对于患者样本,使用柠檬酸缓冲液pH 6.0(Sigma-Aldrich)和加压脱浊室(Biocare Medical)对载玻片进行脱蜡和再水化,并进行抗原回收。 细胞质染色的强度由病理学家(CS)以0-3的半定量等级进行评估。 肿瘤切片中的高表达量为3分,低表达量为0分、1分或2分。
如前所述进行免疫组织化学( 41 ). 使用标准技术和4μm切片对福尔马林固定肿瘤样品中的石蜡包埋组织块进行切片、脱蜡和再水化。
患者材料
1997年至2000年,在牛津约翰·拉德克利夫医院接受手术切除治疗的111名结肠癌患者的知情同意下,获得了福尔马林固定和石蜡包埋组织。 由于有完整的临床病理数据、随访数据和伦理批准的组织,样本量限制在107个。 牛津组织病理学研究中心(项目编号12/A172)和当地研究伦理委员会(C02.216)批准在本项目中使用组织。 没有患者接受术前化疗。 手术时的平均年龄为71岁(37-96岁),64名患者为男性(58%),平均随访时间为4.1年(截至2009年1月)。 根据肿瘤、淋巴结转移和远处转移(TNM),切除时患者的癌症分期如下:; 1期患者10例(9%); 55例(49%)2期患者; 35名患者(32%)为3期患者,11名患者(10%)为4期患者。 所有的切除都产生了清晰的边缘。 无复发生存期定义为肿瘤切除和首次记录的任何部位肿瘤复发之间的时间。 排除因无关原因死亡的患者。 如前所述组装组织微阵列( 42 )每个患者使用两个肿瘤代表性核心和两个相邻正常结肠粘膜上皮代表性核心。
统计
所有数据(平均值±标准误差[异种移植物]或标准偏差[ 在体外 ])使用Excel或GraphPad Prism 5进行分析。 对于肿瘤生长分析,使用GraphPad Prism 4.0b软件执行参数化广义线性模型。 对于western blot分析、细胞增殖和qRT-PCR,使用Kruskal-Wallis单向方差分析确定统计显著性。 全部 在体外 实验重复了至少三次。 对于患者数据,χ 2 该测试用于确定PAT4表达和分类临床变量之间的关联( 补充表S1 ). Cox回归分析用于确定单变量预后因素( 补充表S2 )和多元生存模型( 补充表S3 ). 采用对数秩检验(Mantel-Cox)评估Kaplan-Meier曲线之间无复发生存率差异的显著性。 使用SPSS统计学(21.0版)进行统计分析。
致谢
我们感谢Alan McIntyre、Elena Favaro、Thomas Roberts、Aaron Leiblich和MargretÖgmundsdóttir在本研究期间提供的建议和技术帮助,感谢Katharine Carr、Kristie McCormick和Dan Stevens对手稿的批评性阅读,并特别感谢Richard Boyd促进了关键的合作互动。 这项工作得到了英国癌症研究所(C191591/A6181、C19591/A9093、C7713/A6174)和C38302/A12278的资助,这些资助是通过英国癌症研究牛津中心发展基金、威康信托基金(WT093326MA)、英国癌症研究中心(BB/L007096/1)、CS Nuffield医学奖学金、, 德国沃尔克斯研究院和拜仁马克斯·韦伯项目向SH提供资金,英国耶稣会省(626791)向SMWP提供奖学金。
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