2.材料和方法
2.1. 化学品和试剂
Dasatinib(SML2589)购自Millipore-Sigma(加拿大安大略省奥克维尔)。 RIPA缓冲液来自Abcam(加拿大安大略省多伦多)。 停止蛋白酶和磷酸酶抑制剂一次性鸡尾酒(100X)由Life Technologies Inc.(加拿大安大略省伯灵顿)提供。 VWR一次性杵来自VWR International(加拿大安大略省米西索加)。 DMEM、FBS、青霉素-链霉素溶液、HEPES缓冲液、EDTA胰蛋白酶和无核酸酶的水从Life Technologies Inc.(Burlington,ON,Canada)获得。 SIRT1(ab189494)、COX4(ab197658)、TFAM(ab272885)、过氧化氢酶(ab223793)、SOD2(ab13534)和GAPDH(ab8245)从加拿大安大略省多伦多市的Abcam获得。 三甲基-Histone H3(Lys36)兔pAb(H3K36me3,PTM-625)从PTM Bio LLC(美国伊利诺伊州芝加哥)获得。
2.2。 细胞培养
293个T细胞(CRL-3216™)购自美国型培养物收藏中心(ATCC,弗吉尼亚州马纳萨斯,美国)。 293个T细胞在100x15mm Nunc™细胞培养皿(加拿大安大略省赛默飞世尔科学公司)中培养,初始密度为50000个细胞/板。 细胞保存在37°C、5%CO、添加10%胎牛血清(FBS)和1%青霉素链霉素的Dulbecco改良鹰氏培养基(DMEM)中 2 。将细胞培养至指定的时间,并用显微镜观察,直至达到~70%的融合。 达到该汇合水平后,用达沙替尼(1µM)或所选肽(50µM)处理细胞。
2.3. 肽合成
三种卵转铁蛋白衍生肽GWNI GWN和GW由GenScript(美国新泽西州皮斯卡塔韦)合成。 通过高效液相色谱-串联质谱法(HPLC-MS/MS)验证肽序列和纯度(99.8%)。 在水(100 mM储备)中重新配制肽,并将其等分样品储存在−20°C下,直到进一步实验。
2.4. 细胞治疗
如上所述培养胚胎肾细胞(293 T),并在达到~70%融合后用达沙替尼或肽处理。 选择这种汇合水平是为了给细胞提供充足的时间,使其在存在药理活性肽的情况下达到完全汇合。 简单地说,为了检查达沙替尼诱导线粒体DNA损伤的能力,添加1µM达沙替尼达6小时。 接下来,为了研究候选肽的细胞保护能力,用肽预先培养肾细胞24小时,然后用达沙替尼(1µM)进行细胞应激。 经过这些处理,获得了蛋白质、组蛋白和胰蛋白酶化细胞。 肽的剂量选择基于我们之前的报告,该报告显示有效剂量为50µM( Jahandeh等人,2016年 )而达沙替尼的剂量选择(1µM)基于其IC 50 在癌细胞系(IC)中的价值 50 <1μM)( Tryfonopoulos、O'Donovan、Corkery、Clynes和Crown,2009年 ).
2.5. 细胞活力
使用TC10™细胞计数器(加拿大安大略省米西索加市Biorad)评估细胞活力。 在用肽f、GWNI GWN和GW处理后,293个T细胞被胰蛋白酶化,用PBS洗涤两次,并在离心后重新悬浮在完全培养基中。 使用台盼蓝法在TC10™细胞计数器(加拿大安大略省米西索加市Biorad)的双琥珀色细胞计数玻片上评估细胞活力。
2.6. 蛋白质和组蛋白提取
使用添加蛋白酶抑制剂的RIPA缓冲液从细胞中提取蛋白质。 处理后,从培养板中取出培养基,用10mL冰镇PBS洗涤细胞两次。洗涤后,向10cm板中添加300µL带有蛋白酶抑制剂的RIPA裂解缓冲液,并用细胞刮片刮除细胞。 细胞裂解液在冰上培养15分钟,然后用一次性杵手动进一步裂解。 接下来,将裂解液再培养15分钟,并在4°C下在13000×g下离心5分钟,以收集蛋白上清液。 根据前面描述的方法,使用颗粒提取组蛋白( Shechter、Dormann、Allis和Hake,2007年 ). 在如上所述提取总蛋白后,如前所述进行组蛋白的酸基沉淀( Shechter等人,2007年 ). 在免疫印迹之前,用0.5 M NaOH(1:1 v/v)中和提取组蛋白的pH值。
2.7. 蛋白质印迹
在用载体、达沙替尼和/或候选肽处理后,去除培养基,并使用RIPA缓冲液裂解细胞,如前一节所述。 这些细胞裂解物在SDS-PAGE上运行,转移到硝化纤维素膜上,并根据制造商推荐的浓度用一级抗体进行免疫印迹。 在与二级抗体孵育后,使用Licor Odyssey BioImager(Licor Biosciences,Lincoln,NB)检测蛋白质带,并使用Image Studio Lite 5.2软件通过密度测定进行量化,如我们最近的报告所述( Bhullar等人,2021a ).
2.8. 流式细胞术
流式细胞术在阿尔伯塔大学流式细胞仪核心设施进行。 细胞线粒体的含量或密度由MitoTracker™Green FM(Invitrogen™,M7514)根据制造商的说明使用流式细胞仪(FACS Canto II,BD Bioscience,CA,USA)测量。 简单地说,按照上述方法培养和处理细胞。 处理后,用400 nM浓度的MitoTracker™Green FM将细胞胰蛋白酶化、收集并重新悬浮在PBS和FBS(3:1)制成的缓冲液中。 在37°C下与染料孵育45分钟后,使用BD FACSCanto™(BD FACS Canto II)流式细胞分析仪(BD Biosciences,San Jose,CAL,USA)分析线粒体含量。 FlowJo软件用于流式细胞术数据分析(Tree Star,Inc.OR,USA)。
2.9. DNA提取和琼脂糖凝胶
首先,根据我们最近的报告,线粒体是从细胞中提取出来的( Bhullar等人,2021a ). 接下来,根据之前的报告,进行了DNA提取( Boccellino等人,2003年 ). 简单地说,将来自10 cm板的细胞重新悬浮在500μL Tris–EDTA缓冲液中,并用0.2%Triton X-100进行裂解。 在0.5 M NaCl存在下,DNA在乙醇中沉淀6 h。 然后,采用高速离心进行DNA沉淀,并用异丙醇沉淀水相中的片段DNA提取物。 Tris–EDTA缓冲液再悬浮后,在37°C下用RNase A(0.1 mg/mL)培养样品30分钟。 最后,在琼脂糖凝胶上用SYBR™Safe DNA凝胶染色法对提取的DNA进行染色。
2.10. KO电池
使用我们最近报告中描述的CRISPR-Cas9方法制备293 T SIRT1 KO细胞( Bhullar等人,2021b ). 寡核苷酸序列包括SIRT1 crRNA:CUGAAAUACCUCAGCGCCA、SIRT1测序引物Fwd:TTTCACACTTCCCTCTCTCTCTCAT、SIRT1测序引物Rev:TTCTTGCTCCTATCGAGTTCACA。 如上所述,用达沙替尼(1µM)和/或肽(50μM)处理KO细胞。
2.11. 活性氧和抗氧化酶测定
使用从Abcam(加拿大安大略省多伦多)获得的活性氧分析试剂盒测量细胞中的活性氧(ROS)。 该试剂盒使用细胞渗透试剂2′,7′-二氯荧光素二乙酸酯(DCFDA)定量评估活细胞样品中的活性氧,可在485 nm/535 nm激发/发射荧光光谱法检测。 对于ROS测量,细胞以每孔25000个细胞的密度接种在96孔板的黑色底板中。 所有步骤均按照供应商粘附细胞协议(ab113851)中给出的说明进行。 抗氧化酶、SOD2和过氧化氢酶的蛋白质水平通过细胞处理(如第2.4节所述)和western blot分析进行测量。
2.12. 代谢预测
通过SwissADME进行代谢预测,并通过软件方法分别评估详细的代谢参数。 拓扑极表面积(TPSA)等关键参数; 基于GB/SA在水和正辛醇中计算的吉布斯溶剂化自由能的iLOGP(隐式对数P); log Kp(Kp单位为cm/s),皮肤渗透指数; 生物利用度得分,化合物在大鼠模型中具有至少10%口服生物利用度的概率; 计算GI和脑吸收。 简单地说,两种活性肽GWN和GW的典型微笑是使用Open Babel软件生成的。 将两个肽串NCC(=O)N[C@@]([H])(CC(=CN2)C1=C2C=CC=C1)C(=0)N[C@@]O)O}和奥美拉唑{CC1=CN=C(C(=C1OC)C)CS(=O) C2=NC3=C(N2)C=CC(=C3)OC}。 运行该程序以获得煮蛋结果,而药理学数据是使用瑞士ADME提供的CSV文件获得的。
2.13. 统计分析
所有数据均表示为至少三个独立实验的平均值±标准偏差(SD)。 所有统计分析均使用GraphPad Prism软件版本5.02(GraphPad-software,San Diego,CA,USA)进行。 采用单因素方差分析(ANOVA)和Dunnett的事后检验(w.rt车辆)对数据进行分析。 P<0.05为显著性。
3.结果
3.1. 达沙替尼对肾细胞的影响
首先,使用达沙替尼(1µM)在293T胚胎肾细胞中诱导线粒体损伤( 图1 A) ●●●●。 接下来,提取线粒体,DNA凝胶分析显示,达沙替尼暴露导致线粒体DNA显著断裂( 图1 A) ●●●●。 达沙替尼诱导的DNA片段明显高于整个研究中使用的载体(DMSO)。 此外,与提取线粒体的载体组相比,用达沙替尼(1µM)处理肾细胞也导致COX4蛋白水平显著降低(p<0.05)( 图1 B) ●●●●。 这两个实验证实了达沙替尼诱导肾细胞线粒体损伤的建立 在体外 。
图1。
达沙替尼诱导肾细胞线粒体损伤。 (A) 达沙替尼(1µM)诱导线粒体DNA断裂,(B)降低人胚胎肾293 T细胞中线粒体编码的呼吸链复合物IV亚单位(COX4)的蛋白质水平。 简而言之,使用达沙替尼(1µM)对293个T细胞施加压力6小时,导致线粒体损伤。 收集线粒体DNA和总蛋白,并按照上述章节中描述的方法进行DNA凝胶和免疫印迹。 实验至少进行了三次,通过单因素方差分析和Dunnett事后检验确定显著差异,以比较肽组和对照组的平均值* p<0.05,**p<0.01,***p<0.001****p<0.0001。
3.2. 卵转铁蛋白肽的毒性和组蛋白分析
比较级 在体外 进行毒理学研究以评估卵转铁蛋白肽(GWNI、GWN和GW)对293 T细胞的影响 在体外 ( 图2 A) ●●●●。 台盼蓝活性分析表明,所有测试肽(GWNI、GWN和GW)在人类胚胎肾细胞中的细胞活性均大于90%( 图2 B) ●●●●。 然而,在这些肽中,GWNI表现出具有统计学意义的细胞毒性(p<0.05),表现为细胞活力下降,而GW和GWN保持了最高的细胞活力,并表现出低毒性 在体外 ( 图2 B) ●●●●。 我们还测试了三种肽(GWNI、GWN和GW)在肾细胞中诱导细胞保护组蛋白修饰H3K36me3的能力( 图2 C) ●●●●。 在GWNI、GWN、GW中,GWN和GW(50μM)导致活性组蛋白标记H3K36me3的显著积累(分别为p<0.05和p<0.01),表明GW和GWN肽对细胞氧化应激和DNA损伤具有强大的细胞保护能力。 然而,与溶媒组相比,GWNI治疗(50μM)并未增强细胞保护活性组蛋白标记H3K36me3( 图2 C) ●●●●。 这些实验建立了GWN和GW的安全毒理学和细胞保护特性,而GWNI不包括在进一步的一组实验中。 尽管需要注意的是,GWNI治疗确实表现出>90%的生存能力,这突出了可接受的安全性,但在将其排除在进一步的一组实验之外时,考虑了统计分析。
图2。
卵转铁蛋白多肽的毒性和组蛋白修饰能力。 (A)三种抗氧化肽中的两种肽GWN和GW诱导(B)对人胚肾293 T细胞的毒性最小,(C)显著提高活性组蛋白标记H3K36me3。 简而言之,用三种肽GWNI、GWN和GW处理293个T细胞; 并进行细胞活力和组蛋白提取。 用台盼蓝法在双琥珀细胞计数玻片上评估细胞活力,同时用酸沉淀法提取组蛋白。 实验至少进行了三次,通过单因素方差分析和Dunnett事后检验确定显著差异,以比较肽组和对照组的平均值* p<0.05,**p<0.01。
3.3. GWN和GW对达沙替尼应激的细胞保护能力
首先,我们评估了两种卵转铁蛋白衍生肽GWN和GW对抗达沙替尼诱导的细胞损伤的能力( 图3 A) ●●●●。 据报道,SIRT1是一个NAD + 依赖性蛋白脱乙酰酶,调节细胞应激反应。 用GWN和GW(50μM)预处理肾细胞,通过显著增加293个T细胞中SIRT1的蛋白水平来对抗达沙替尼应激(p<0.01)( 图3 B) ●●●●。 我们的结果还表明,GWN(50μM)(而非GW)显著增加了SIRT3的蛋白水平(p<0.01),SIRT3是一种细胞保护性线粒体sirtuin,表明线粒体对达沙替尼应激具有保护作用。 与这些结果一致,通过GWN治疗(50μM),线粒体健康的重要生物标志物COX4的蛋白质水平显著提高(p<0.01)( 图3 D) ●●●●。 这些结果有力地证明了GWN和GW对达沙替尼诱导的细胞损伤具有线粒体保护和恢复作用。
图3。
源自卵转铁蛋白的肽对肾细胞达沙替尼损伤的细胞保护作用。 (A) Dasatinib(1µM)损伤人类胚胎肾293 T细胞后,两种肽GWN和GW增加了(B)SIRT1(C)SIRT3(D)和COX4水平。 简而言之,用GWN和GW预处理293个T细胞24小时,然后用达沙替尼(1µM)细胞应激6小时。 在这些处理后,使用RIPA缓冲液收集总蛋白并进行免疫印迹。 实验至少进行了三次,通过单因素方差分析和Dunnett事后检验确定显著差异,以比较肽组和对照组的平均值** p<0.01。
3.4. 肽GWN和GW增加抗氧化酶并降低ROS
与细胞保护性sirtuins水平的增加相一致( 图3 B、 D),我们观察到GWN和GW治疗导致达沙替尼损伤引起的ROS水平急剧下降(p<0.001)( 图4 A) ●●●●。 通过将ROS水平恢复到损伤前水平,卵巢转铁蛋白衍生肽GWN和GW在细胞中重新建立氧化还原稳态( 图4 A) ●●●●。 GWN(p<0.001)和GW(p<0.01)显著增加了抗氧化酶过氧化氢酶的水平,证实了它们对氧化应激的保护作用( 图4 B、 C)。 然而,只有GWN预处理显著增加了SOD2(超氧化物歧化酶2)水平(p<0.05)( 图4 C) ●●●●。
图4。
卵转铁蛋白多肽对肾细胞Dasatinib损伤的抗氧化作用 在Dasatinib(1µM)损伤人类胚胎肾293 T细胞后,两种肽GWN和GW(A)降低ROS并增加(B)过氧化氢酶和(C)SOD2水平。 简而言之,用GWN和GW预处理293个T细胞24小时,然后用达沙替尼(1µM)细胞应激6小时。 在这些处理后,使用RIPA缓冲液收集总蛋白并进行免疫印迹。 实验至少进行了三次,通过单因素方差分析和Dunnett事后检验确定显著差异,以比较肽组和对照组的平均值** p<0.01。
3.5. GWN和GW对达沙替尼应激的线粒体保护作用
接下来,我们进行流式细胞术以评估GWN和GW对抗达沙替尼诱导的线粒体丢失的能力( 图5 ). 我们的结果表明,与载体相比,达沙替尼(1µM)导致肾细胞线粒体密度显著下降( 图4 A-B)。 这种下降证实了先前观察到的肾细胞中达沙替尼损伤后线粒体DNA损伤和COX4水平的损失( 图1 B) ●●●●。 然而,GWN和GW预处理肾细胞可显著消除达沙替尼在检测浓度(50μM)下诱导的肾细胞线粒体丢失( 图5 B-C)。 然而,GWN保护肾细胞线粒体抵抗达沙替尼的能力强于GW( 图5 C-D)。 流式细胞仪分析结果证实了GWN和GW能够减轻达沙替尼损伤引起的肾线粒体丢失和损伤。
图5。
来自卵转铁蛋白的多肽保护线粒体免受达沙替尼对肾细胞的损伤。 与(A)载体相比,(B)达沙替尼(1µM)治疗导致线粒体数量急剧下降,而线粒体数量在人类胚胎肾293 T细胞损伤后由(C)GWN和(D)GW池恢复。 简而言之,用GWN和GW预处理293个T细胞24小时,然后用达沙替尼(1µM)细胞应激6小时。 经过各种处理后,使用胰蛋白酶化法收集细胞,用400µM浓度的MitoTracker™Green FM培养细胞,并进行流式细胞术。 实验至少重复三次,并使用FlowJo软件进行分析。 (对于本图例中颜色参考的解释,请读者参阅本文的网络版。)
3.6. GWN和GW的SIRT1依赖性表现出线粒体保护
由于SIRT1与肾脏保护密切相关( Huang等人,2020年 , Sun等人,2021年 )以及GWN和GW激活SIRT1,我们询问这些肽的细胞保护作用是否依赖于SIRT1。 我们的细胞活力结果表明,与SIRT1相比,GWN和GW在WT细胞中对达沙替尼损伤提供了更强的保护 −/− 细胞(p<0.001)( 图6 A) ●●●●。 同样,GWN增加COX4的能力( 图3 D) 在SIRT1中减少 −/− 单元格( 图6 B) ●●●●。 同样,GWN和GW增强SIRT1中H3K36me3组蛋白标记的能力也显著下降 −/− 单元格( 图6 C) 与WT电池相比( 图2 C) ●●●●。 总的来说,SIRT1的缺失导致GWN和GW表现出的细胞保护和表观遗传机制消失,表明GWN和GF具有SIRT1依赖性生物活性。
图6。
源于卵转铁蛋白的多肽对达萨替尼损伤的细胞保护的SIRT1依赖性。 Dasatinib(1µM)以SIRT1依赖性方式损伤293 T细胞后,两种肽GWN和GW维持(A)细胞活性(B)COX4水平和(C)H3K36me3水平。 简而言之,用GWN和GW预处理293 T WT和293 T SIRT1 KO细胞24小时,然后用达沙替尼(1µM)细胞应激6小时。 处理后,收集细胞,并按照方法中所述进行细胞活力、免疫印迹和组蛋白标记分析。 实验至少进行了三次,通过单因素方差分析和Dunnett事后检验确定显著差异,以比较肽组和对照组的平均值** p<0.01。
3.7. 肽GWN和GW具有潜在的生物利用度
最后,我们进行了代谢预测研究,以预测这两种肽的代谢和摄取。 我们的结果表明,GWN和GW这两种肽具有生物利用度雷达显示的截然不同的特性( 图7 A、 B)。 TPSA表明,GWN的极表面积高于GW,考虑到硫和磷是极性原子( 图7 A、 B)。 接下来,在BOILED-Egg模型中显示的对被动人体胃肠吸收(HIA)和血脑屏障(BBB)渗透的预测表明,与GWN肽相比,GW的吸收更高( 图7 C) ●●●●。 然而,两种肽的预测生物利用度得分相等( 图7 D) ,表明10%饲料肽的生物利用度为~55% 体内 。
图7。
来自卵转铁蛋白的GWN和GW肽的代谢预测。 图形显示(A-B)生物利用度雷达(C)BOILED Egg吸收模型和(D)两种肽的关键药理特性。 使用Open Babel软件生成两种活性肽GWN和GW的标准笑容,并使用SwissADME和适当的控制分子进行处理。 运行该程序以获取煮蛋结果,同时使用软件提供的CSV文件获取药理数据。
5.结论
在本研究中,我们报道了GWN和GW作为细胞保护性抗氧化肽,能够保护胚胎肾细胞免受达沙替尼诱导的线粒体损伤。 这些肽具有激活细胞保护组蛋白标记H3K36me3以及SIRT1和SIRT3的能力。 这两种肽都能恢复达沙替尼诱导的线粒体损伤,这可以通过增加COX4、抗氧化酶、降低ROS和肾脏细胞中持续的线粒体密度来证明。 综上所述,我们的研究结果支持生物活性肽作为细胞保护剂对抗化疗引起的线粒体损伤和肾毒性的潜在作用。 对深入机制的进一步研究以及动物研究将有助于更好地理解研究肽延伸的肾脏保护相关的细胞过程。
CRediT作者贡献声明
Khushwant S.Bhullar: 概念化、调查、数据管理。 法特梅赫·阿什卡尔(Fatemeh Ashkar): 调查。 吴建平: 概念化、项目管理、资源、监督。
竞争利益声明
作者声明,他们没有已知的竞争性财务利益或个人关系可能会影响本文所报道的工作。
致谢
这项工作得到了加拿大自然科学和工程研究委员会(NSERC)的资助。 所有作者感谢Basil P.Hubbard博士提供293T WT细胞和293T SIRT1 KO细胞,感谢Aja Rieger博士帮助流式细胞术实验和分析。
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