胞嘧啶甲基化对人类转录因子DNA结合特异性的影响

克隆、蛋白质表达和纯化

以pETG20A质粒为骨架，构建了含有N末端硫氧还蛋白-6×His标签、C末端链亲和素结合肽（SBP）或3×FLAG标签的细菌蛋白表达网关受体载体。通过哺乳动物基因收集（MGC）、ORFeome、Megaman cDNA文库中的聚合酶链反应（PCR）或基因合成（Genscript；参见表S1蛋白质序列和结构域），或来自先前发布的Gateway供体克隆(21).

蛋白质表达和纯化大肠杆菌细胞按中所述进行(64)，具有以下修改：30µM ZnSO₄被包括在培养基中以促进锌指蛋白的表达和折叠。通过SDS-PAGE电泳（E-PAGE蛋白凝胶，Invitrogen）和考马斯亮蓝染色检查纯化蛋白的表达。在−20°C储存之前，向蛋白质中添加50%的甘油。结果比较表明，使用这种重组细菌蛋白恢复的基序高度相似(图S1和表S2)在培养的人类细胞中表达TF的实验中(21,26).

HT-SELEX分析

HT-SELEX基本上按照Nitta所述执行等. (25). 简言之，由40 bp随机序列和Illumina测序适配器组成的选择配体由单链模板引物延伸生成。然后将配体（循环0时约1.5µg，之后约200 ng）与标记纯化的六组氨酸硫氧还蛋白孵育大肠杆菌重组蛋白（100至200 ng）在微孔板中，在聚dI:dC竞争物（75 ng）存在下，然后通过镍亲和珠回收蛋白质和结合DNA。该过程重复了四次，配体通过PCR扩增，并在每个循环后测序。反应在含有较低盐浓度的缓冲液中进行（4%甘油、1 mM DTT、500µM EDTA、10 mM Tris-Cl中50 mM NaCl，pH 7.5）在SELEX清洗步骤中，为了防止TF与DNA过度分离（低盐加强了TF和DNA骨架之间的非顺序特异性离子相互作用），在细胞核内发现的TF。获得的基序与我们使用生理水平KCl（140 mM；图S19B).

最初的DNA数量足以包含所有20 bp的缺口和未缺口序列的大多数。虽然由于DNA数量的限制，并非所有40 bp序列都被查询，但TF通常不会与40 bp（80位信息）的精确匹配相结合；通过使用DNA的数量，HT-SELEX可以识别信息含量约为40位的基序，超过了大多数人类TF的信息含量[约15位(26)]. 有关HT-SELEX方法和分析的更多详细信息，请参阅(21,26).

在SELEX中，由于TF对高亲和力位点的饱和，第一个周期低估了亲和力，随后的周期产生了高亲和力部位的指数富集。在晚期周期（>4）中，大多数序列将包含一个与TF结合的序列，高亲和力序列将开始竞争中等亲和力位点，最终产生极少的单个序列。我们之前已经将PBM和HT-SELEX与更直接测量（相对）亲和力的方法进行了比较，并且所获得的基序与PBM和早期周期（2或3）SELEX数据非常相似(21,26,33). 因此，在这里使用相对早期的SELEX循环生成图案（在表S2). 此外，由于相似性和丰富性的等级相同，精确的相似性对于使用阈值进行基序匹配的方法来说并不重要。然而，从SELEX PWM获得的相对值只是亲和力的粗略估计，以及使用标准和/或方法（如Spec-seq）校准图案(65)如果需要精确的相对亲和力值，则应使用。

甲基-SELEX

甲基SELEX工艺基于HT-SELEX(21,26)在每个选择周期之前添加DNA甲基化步骤。CpG甲基化由CpG特异性甲基化酶M.SssI执行。甲基化协议改编自(11)如下：将2.5µl（10U，用于初始文库）或1.25µl（5U，用于周期1-3）CpG甲基转移酶M.SssI（NEB；在周期0中过量2倍，此后过量10倍）与0.4µl（用于初始文库）或0.2µl（用于周期1-3）S-腺苷甲硫氨酸、3.4µl 50mM氯化镁一起添加到DNA配体中₂和0.2µl 100 mM DTT，总体积为20µl。将混合物在37℃下培养3小时，使双链DNA中的CpG二核苷酸甲基化，然后在65℃下培养20分钟，在每个选择周期之前使M.SssI酶失活。通过甲基化特异性限制酶BstBI检测配体的甲基化状态来优化甲基化反应(图S19A). 此外，在筛选中，在每个板中包括对照甲基特异性TF（HOXB13和/或ATF）。

CpG甲基化DNA配体和非甲基化DNA配体在不同的96 well板中对每个蛋白质进行平行的SELEX分析，选择过程重复4个周期以丰富结合序列，如(21,26). 对所有四个周期的富集寡核苷酸进行测序。

探讨盐浓度对疏水相互作用的潜在影响，这可能会影响TF对mCpG的偏好(66)，我们还进行了140 mM KCl存在下的对照实验。较高盐浓度的实验成功率较低，但获得的基序与使用50 mM NaCl缓冲液获得的基模没有实质性差异(图S19B).

亚硫酸氢盐-SELEX

甲基-SELEX可用于对与包含和不包含CpG的两个位点都具有某种亲和力的TF进行分类。在甲基化块与最高亲和性位点结合的情况下，不含CpG的低亲和性序列比没有甲基化的序列更丰富。含CpG基序的相对缺失将表明TF为甲基-微量。然而，仅能与含CpG序列结合的TF很难分类，因为弱结合仍会产生一个基序，甚至被mCpG完全阻断的TF也可能由于M.SssI对DNA的不完全甲基化而在甲基-SELEX中产生更弱富集的含CpG-基序。为此，我们开发了亚硫酸氢盐-SELEX，它允许在单轮SELEX中分析CpG甲基化的定量效应。在该分析中，直接测量mCpG状态，因此M.SssI对DNA的部分甲基化不会影响结果。然而，检测中可能存在一些半甲基化DNA。使用亚硫酸氢盐-SELEX可以专门分析半甲基化DNA，因为该基序仅由一条DNA链生成；然而，半甲基化分析需要生成半甲基化DNA，例如在甲基化后执行一个PCR循环。由于根据结构分析，半甲基化的影响预计介于完全甲基化和非甲基化状态之间，因此未在此处进行分析。

在亚硫酸氢盐-SELEX中，混合的HT-SELEX和甲基-SELEX-富集的选择配体部分甲基化，并经受另一轮SELEX。然后使用标准和亚硫酸氢盐测序对附加SELEX轮中选择的输入混合物和配体进行分析，以确定每个TF对甲基化CpG亚序列的偏好。

对于亚硫酸氢盐-SELEX，在其结合位点中具有CpG亚序列的蛋白质，在第3周期之前执行HT-SELEX和甲基-SELEX-过程。然后将来自CpG甲基化和非甲基化DNA配体的富集DNA寡核苷酸混合在一起，然后一半的混合寡核苷酸进行如上所述的甲基化过程，然后与非甲基化寡核苷酸混合。随后对CpG甲基化和非甲基化寡聚物的混合物进行额外的SELEX过程循环（循环4），并在70μl微Q水中洗脱富集寡聚体。通过PCR扩增13μl洗脱液（Phusion DNA聚合酶，Fisher Scientific；65°C 10 s，72°C 36 s，97°C 15 s，分别用于退火、延伸和变性，20个循环），并通过qPCR（Roche LightCycler 480）分析3μl等分试样，以监测实验进展。随后，对40µl洗脱液和5µl来自循环3的CpG甲基化和非甲基化寡聚物混合物进行亚硫酸氢盐处理（EZ-96 DNA甲基化金试剂盒，ZYMO RESEARCH）并通过PCR扩增（PfuTurbo Cx Hotstart DNA聚合酶，安捷伦科技公司；前2个循环分别为60℃30 s、72℃60 s、95℃30 s，用于退火、伸长率和变性，随后的13或25个循环分别是65℃30 s和72℃60秒、95℃30s）。从正常洗脱和亚硫酸氢钠处理洗脱扩增的第4周期PCR产物、CpG甲基化和非甲基化寡聚物混合物以及从第3周期亚硫酸氢处理的CpG甲甲基化和未甲基化寡核苷酸混合物中扩增的PCR产物均进行了测序。

为了计算模体中mCpG增加的百分比，根据与亚硫酸氢盐SELEX种子完全匹配的子序列确定特定位置的二核苷酸频率(表S3)除了被询问的二核苷酸位置以外的所有其他位置。对于位置（以粗体显示表S3)如果甲基-SELEX或HT-SELEX-循环3的CpG计数高于10%，则mCpG频率从循环3到循环4的增加计算如下：（f）_imCG公司= (（f）_{nmCG_周期4}/（f）_{nmCG_周期3}− 1) ×100%. 对于循环3和4，甲基化的归一化频率（f）_纳米CG根据以下方程式计算得出：（f）_nmCG公司=平方英尺×（f）_微CG，其中尺寸系数平方英尺= 1/(（f）_umCG公司+（f）_微CG+假计数）和非甲基化CG的频率（f）_umCG公司= [(（f）_YG公司−（f）_TG公司) + (（f）_CG公司−（f）_微CG)]/2; YG是亚硫酸氢盐处理后的TG计数（umCG和TG），假计数为10⁻⁹包括在内以避免被零除。

PWM模型的生成

如前所述，使用Autoseed管道分析来自非甲基化和甲基化配体的每个单独TF的结合模型(25,64). 简单地说，计算了8个和10个bp的未映射子序列以及中间包含间隙的子序列，并使用“Huddinge距离”度量分析了它们之间的相似性(25). Huddinge距离定义为d日−一，其中d日是两个比较子序列中任意一个子序列中定义的最大基数，以及一是在不引入新间隙的情况下，它们之间可以完美对齐的最大基数。每个TF的初始种子是使用局部最大子序列生成的（在Huddinge距离为1时，子序列的计数高于其任何相邻子序列）。使用多项式方法使用这些种子生成初始PWM模型(21)，随后通过专家分析对种子进行了精炼[参见(26,64)]. 使用的精确种子、SELEX循环和多项式模型如所示表S2.

TF分类

根据亚硫酸氢盐-SELEX，将每个TF分为甲基+、甲基-微量、轻微影响或多重影响类别(图5A和表S3)除亚硫酸氢盐实验富集度低、种子复杂度低或无数据的情况外；在这些情况下，未考虑亚硫酸氢盐-SELEX数据，分类基于甲基-SELEX。在23个案例中，亚硫酸氢盐-SELEX和甲基-SLEX的数据或两个亚硫酸氢-SELEX实验之间的重复数据不一致，未分类，并在表S3首先，将每个基序分类为多重效应，甲基加、甲基减、小效应或无CpG类。然后，将具有单个基序的TF指定为其基序类别，并将具有多个基序的TF分类如下：如果TF在多效应类别中具有任何基序，或两个或多个对CpG甲基化表现出不同影响的基序（不同的基序属于以下两个或两个以上类别：甲基+、甲基-微量或小影响），它被归类为多重影响。如果TF的基序没有CpG，而基序有CpG（s），则根据带有CpG的基序进行分类（参见数据S2详细信息）。

此外，甲基-plus和甲基-minus TF被分为A型或B型，以表明是否分别影响了最富集的位点或中等富集的位点（低于最大值但大于最大值的10%）。对于每个TF，这种分类基于从其主要基序（出现次数最多的基序）衍生的一致序列。使用基于一致序列的方法代替特定长度的kmer，因为不同TF的基序具有不同的长度，并且许多单个TF也丰富了两个或多个不同长度的基序。如果一致序列包含CpG，则TF被分类为a型，如果没有，则被分类为B型。甲基-plus和甲基-minus TF分别基于使用甲基化和非甲基化配体富集的基序进行分类。

蛋白质结合微阵列

对于蛋白结合微阵列分析，使用网关LR反应将DLX3、POU5F1、MAX、NFATC2、CUX1和CUX2的DBD克隆转移到带有N末端GST标记的pDEST15。从pDONR克隆中扩增出Nkx2.5的DBD并克隆到pETGEXCT的NcoI-SacI限制位点(67). 带有N末端GST标记的LHX9的DBD来自Dr。蒂莫西·休斯实验室（多伦多大学）。所有克隆均经过序列验证。

16×HK阵列设计，具有40000个独特的DNA特征[如所述(11,35)]如中所述的双绞线(11). 使用10μl CpG甲基转移酶M.SssI（20个单位/μl）（NEB）、1μl S-腺苷蛋氨酸和15μl 10×NEB缓冲液2在双链阵列上对CpG二核苷酸进行甲基化。用0.005%Triton X-100将反应体积调整为150µl，并在37°C下培养3小时。添加Triton X-100对阵列的完全甲基化至关重要。

蛋白质结合反应按照(35). 简单地说，用4%脱脂奶粉在1×PBS（Sigma）中封闭双链微阵列1小时。然后用0.1%（vol/vol）吐温-20的PBS清洗一次微阵列5分钟，用0.01%Triton X-100的PBS洗涤一次2分钟。根据制造商说明，使用PURExpress体外蛋白合成试剂盒（NEB）表达带有GST标记的DBD。添加25μl IVT反应，使总体积为150μl的含PBS的蛋白质结合反应与2%（wt/vol）牛奶、51.3 ng/μl鲑鱼睾丸DNA（Sigma）和0.2μg/μl牛血清白蛋白（NEB）发生，并在20°C下孵育1小时。将预孵育的蛋白结合混合物应用于40K阵列的单个腔室，并在20°C下孵育1小时。在Coplin罐中用0.5%（vol/vol）吐温-20在PBS中清洗一次微阵列3分钟，用0.01%Triton X-100在PBS内清洗一次2分钟，最后用PBS清洗。将Alexa Fluor 647-共轭GST抗体（Invitrogen）涂敷到每个室中，并在20°C下培养1小时。最后，用含有0.05%（vol/vol）吐温-20的PBS清洗微阵列两次，每次3分钟，在PBS中清洗一次，每次2分钟。扫描蛋白结合微阵列以在640nm处检测Alexa Fluor 647缀合的抗GST。使用ImaGene（BioDiscovery）分析微阵列图像，并将提取的数据用于进一步分析（GEO:GSE94634标准). 为了估计每种8-mer的相对偏好，Z评分是根据包含每种8-mer的16或32个点的平均信号强度计算的(11).

细胞培养、细胞转导、ChIP-seq和ChIP-exo

泰特-TKO（缺乏测试1,测试2、和测试3)其生成方式和遗传背景与Dnmt公司-TKO线(51)经过以下修改：在选择嘌呤霉素后，克隆最初根据前面描述的扩增和RFLP消化进行基因分型(68)使用以下引物和限制性内切酶组合：测试1（TTGTTCTCTCCTGACTGC、TGATTGATCAAATAGGCCTGC、SacI），测试2（CAGATGCTTAGGCCAATCAAG、AGAGCACACATGAAGATG、EcoRV），测试3（CCACCTCTGAGCGCAGAGTG、GATGAACAGTTCTGACAG、XhoI）。这些研究中使用的阳性克隆在测试1，8 bp和10 bp缺失测试2和8 bp纯合缺失测试3.

野生型，Dnmt公司-TKO公司(51)（缺乏Dnmt1型,Dnmt3a型、和Dnmt3b型)和泰特-将TKO细胞无饲养细胞培养在DMEM中的0.2%明胶涂层培养皿上，补充15%胎牛血清、1×非必需氨基酸、2mM L-谷氨酰胺、LIF和0.001%β-巯基乙醇（37℃，7%CO）₂) (51).

表达野生型雄激素受体（LSH-AR）的永生人前列腺上皮细胞是William Hahn教授（波士顿达纳-法伯癌症研究所）赠送的礼物。细胞在PrEBM前列腺上皮基底培养基（Lonza）中培养，并添加生长因子补充剂（PrEGM SingleQuots（Lonsa）），并按上述方法传代(69).

利用网关重组系统将全长HOXB13 ORF克隆到pLenti6/V5慢病毒表达载体中。使用Lipofectamine 2000（Thermo Fisher Scientific）将表达载体与包装载体psPAX2和pMD2.G（Addgene）联合转染到293FT细胞中，从而产生病毒。第二天，用新鲜的培养基补充细胞，48小时后收集含病毒的培养基。使用Lenti-X浓缩器（Clontech）浓缩病毒。在存在8µg/ml聚brene的情况下进行转导。转导后16小时，用新鲜培养基替换LSH-AR细胞培养基，并进一步培养48小时。

染色质免疫沉淀法（ChIP）如前所述进行，但有轻微修改(70)通过在野生型和缺陷ES细胞中使用OCT4、KLF4、n-Myc抗体（Abcam cat.no.ab19857和R&D Systems cat.no.AF1759、AF3158和AF3640，以及Abcam cat.no.ab16898），或在转染的LHSAR细胞中使用HOXB13抗体。简单地说，在室温下将细胞固定在1%甲醛中10分钟，然后添加0.125 M甘氨酸。用冰镇PBS清洗细胞两次，并将其收集在裂解缓冲液中（5 mM PIPES，pH 8.0，85 mM KCl和0.5%NP-40）。将细胞悬浮液离心，并将颗粒重新悬浮在含有蛋白酶抑制剂（Roche）的300µl RIPA缓冲液（1%NP‐40，0.5%脱氧胆酸钠，1×PBS中0.1%十二烷基硫酸钠）中进行溶解。使用Bioruptor（Diagenode）将染色质超声至平均片段大小100–300 bp，然后在+4℃下以13000 rpm离心样品15 min，以收集上清液。将Dynal蛋白-G磁珠（Invitrogen）用5mg/ml BSA在PBS中预洗涤总共5次，并重悬于100μl洗涤缓冲液中。将感兴趣蛋白的特异性抗体与磁珠偶联过夜，并在+4 C下旋转。对于每个免疫沉淀（IP），用900µl RIPA缓冲液将100µl的超声染色质按1:10稀释，并将10%作为输入部分保存。在剩余的样品中，添加100µl抗体偶联磁珠，并在4°C的旋转器上培养过夜。培养后，用LiCl洗涤缓冲液（100 mM Tris-Cl，pH 7.5，500 mM LiCl，1%NP-40和1%脱氧胆酸钠）洗涤珠子5次，然后用含有1 mM EDTA的10 mM Tris-Cl（pH 8.0）洗涤两次。在65°C的IP洗脱缓冲液（1%SDS，0.1 M NaHCO）中孵育1小时，从珠子中洗脱染色质抗体样品_三，在10mM Tris-Cl中，pH 7.5），然后在65°C下孵育过夜以反向交联。使用酚氯仿纯化洗脱的DNA，然后准备文库进行Illumina测序。

LoVo（ATCC，cat.no.CCL229TM）细胞在添加10%胎牛血清（FBS）和抗生素的DMEM中培养。当汇流达到60-70%时，ChIP-exo实验基本上按照Rhee和Pugh的描述进行(71)经过Katainen的修改等. (43)通过使用CEBPB和MAX（以及圣克鲁斯生物技术分类号sc-150 X、sc-197和细胞信号技术分类号4732S）的抗体。LoVo细胞KLF5的ChIP-exo数据来自Katainen等. (43).

使用bwa将ChIP文库中的原始测序读数映射到人类参考基因组（hg19）或小鼠参考基因组（mm9）(72)使用默认参数。对于ChIP-exo峰值调用，我们使用带有默认参数的Peakzilla(73). 对于ChIP-seq峰值呼叫，我们使用MACS（v1.4）(74)具有以下参数：未调整P（P）< 10⁻⁵; IgG控制的折叠转换≥2；错误发现率≤5%。LoVo、GP5D和VCaP细胞的ChIP-seq数据来自Yan等. (27)和黄等. (75). 使用UCSC liftOver将峰值呼叫从hg18坐标转换为hg19坐标。请参见表S1Illumina测序适配器的序列，以及表S4MEME检测到的峰区富集基序的对齐读取数和E值(76)每个实验。使用BEDtools（v2.24.0）计算峰值重叠，要求重叠至少20%。只要可用，重叠峰用于下游分析(表S4).

为了确定被占据的区域是否在体内被甲基化，我们首先确定了ChIP-exo/seq峰区域和侧翼区域内的最佳得分基序匹配，这些区域距离任一方向上每个峰的边界都大于1kb但小于11kb，然后测定含有CpG二核苷酸的基序匹配物中甲基化胞嘧啶的分数。从HT-SELEX中富集的基序用于甲基-微量和小效应类别中的TF，从甲基-HT-SELEX中富集的模序用于甲基-plus组中的TFs。使用程序MOODS从人类或小鼠基因组中搜索每个基序识别的得分最高的300000个位点(77)带有P（P）值截止值为10⁻⁴得分截止值为5。从产生ChIP-exo/seq数据的各个细胞的全基因组亚硫酸氢盐测序（WGBS）数据中获得峰值和侧翼区域内最佳评分基序匹配的CpG子序列中的胞嘧啶甲基化。然后使用R直方图比较胞嘧啶甲基化百分比在峰和侧翼区域的分布。包含了CpG子序列中的所有胞嘧啶，其具有≥2的读取覆盖率的最佳评分基序匹配。然而，结果对截止值的变化是稳健的(数据S3). OCT4和n-Myc峰的基序匹配来自泰特和Dnmt公司-合并TKO ChIP-seq数据，并使用BEDtools genomecov（v2.26.0），根据库片段长度延伸的ChIP-se序列读取计算峰值高度。两个细胞的两个ChIP-seq实验的平均片段覆盖率表示为图6A和图S13D,S14B型、和S14C系列.

测序和亚硫酸氢盐测序

使用PCR-纯化试剂盒（Qiagen）纯化未选择和选择的SELEX文库，并使用Illumina HiSeq 2000进行测序[复用400倍，否则与Jolma中的一样等. (21); 55 bp单读长度]。原始序列读取被解复用，并使用Autoseed管道进行分析(25). 每个周期和实验的读取计数范围约为100000到500000次读取。

来自GP5d、LoVo、VCaP、LHSAR、野生型和缺陷ES细胞的亚硫酸氢盐序列库是按照Illumina的说明准备的，只做了少量修改。基因组DNA加入0.5%的非甲基化λDNA（Promega），并使用Covaris的200-bp靶峰大小协议在Covaris中进行片段化。对声波DNA样本进行末端修复、dA-tailed并连接到测序适配器。使用ZYMO-EZ DNA甲基化金试剂盒处理连接的DNA片段以进行亚硫酸氢盐转化。亚硫酸氢盐转化的DNA样本通过PCR（4至7个周期）进行富集。使用Illumina HiSeq4000进行测序，使用100 bp配对读取，原始测序读取是高质量的，适配器使用Trim Galore中的cutadapt版本1.3进行修剪。使用Phred得分截止值30进行低质量末端修剪。适配器修剪是使用具有默认参数的标准Illumina双端适配器的前13 bp进行的。使用Bismark（版本v0.10.0）对hg19或mm9参考基因组进行读取比对(78)和Bowtie 2（版本2.2.4）(79). 使用Bismark重复数据消除功能删除重复数据。甲基化调用的提取是通过Bismark甲基化提取器完成的，从第一次读取（–no_overlap参数）中丢弃配对读取重叠部分的前10 bp读取和读取甲基化调用。GP5d、LoVo、VCaP、LHSAR、野生型和有缺陷ES细胞的WGBS覆盖范围的宽度和深度见数据S3。DSS检测到不同的甲基化区域(80). 用于小鼠ES细胞的DNAse I超敏位点图S13C从UCSC的ENCODE数据（wgEncodeUwDnaseEscj7S129ME0PkRep1）下载。窄峰），类似于Stadler之前的研究等. (8)和热图是使用deepTools（2.4.1版）生成的(81). 所有序列数据以注册号PRJEB9797保存在ENA（欧洲核苷酸档案馆）。

ES细胞的ATAC测序

使用转座酶可获得染色质的测序分析（ATAC-seq）捕获野生型和TKO ES细胞的开放染色质区域。ATAC-seq基本上按照Buenrostro所述执行等. (82)经过以下改进：通过胰蛋白酶法获取培养的细胞（70%融合），重新悬浮成单个细胞，用冰镇PBS洗涤并在500×g下离心5min。将细胞颗粒（50000个细胞）重新悬浮在2×溶解缓冲液（10mM NaCl，3mM MgCl）中₂，在10mM Tris-HCl中的0.1%Igepal CA-630，pH 7.5）和细胞核，通过在4°C下以500×g离心30分钟，使用具有低加速度和制动设置的摆动桶转子将其制成颗粒。丢弃上清液，在25µl体积中对细胞核进行标记反应，其中含有2µl Tn5转座酶和12.5µl 2×TD缓冲液（来自Illumina的Nextera DNA Library Prep Kit，目录号FC-121–1030）。在37°C的摇晃培养箱（650 rpm）中进行标记1小时。标记后，添加5µl清洁缓冲液（900mMNaCl，300 mM EDTA）、2µl 5%SDS和2µl蛋白酶K（Thermo Fisher Scientific，目录号EO0491），并在40°C下进一步培养反应30分钟，剧烈摇晃（650 rpm）。使用2×Agencourt AMPure XP SPRI珠（Beckman Coulter，目录号A63881）分离标记DNA，并使用22.5µl洗脱缓冲液（10 mM Tris-Cl，pH 8.0）洗脱DNA。文库扩增分别使用6个周期和8个周期的两个连续PCR进行。第一次PCR后，使用反相0.55X AMPure XP SPRI珠进行文库大小选择（对于小于800 bp的片段），收集上清液并使用MinElute PCR纯化试剂盒（QIAGEN，目录号28004）分离DNA。使用2µl索引引物（来自Illumina的Nextera Index Kit，目录号FC-121–1011）和KAPA HiFi HotStart ReadyMix（KAPA Biosystems，KK2601）进行两次连续PCR（Illuminia的Nextra DNA Library Prep Reference Guide）。使用Qubit 3.0荧光计（Thermo Fisher Scientific）测量最终DNA浓度，并使用2100生物分析仪（安捷伦科技公司）确定库大小。根据制造商的说明，使用Illumina HiSeq 4000进行单基因55 bp测序。

使用bwa将原始测序读数映射到小鼠参考基因组（mm9）(72)使用默认参数。使用Picard Tools MarkDuplicates去除重复，使用MACS2（2.0.9版）检测开放染色质区域(74)使用默认参数进行宽峰值调用。ATAC-seq校准和峰值呼叫统计汇总于表S4两个重复的重叠峰（至少20%重叠）用于下游分析。

模体守恒与相似性分析

为了确定与基序的匹配是否被保存，根据(64)该程序在900个基序中检测到598个基序（66.4%）的基因组保守性，家族错误率<0.05。简单地说，每个基序的两万个顶级亲和位点是从人类限制的元素中选择的（不是全基因组，只有哺乳动物中的序列是保守的），并根据中解释的基序在99种脊椎动物物种中进行了保护检查（从UCSC基因组浏览器hg19版下载的多重比对）(64). 为了将模体与保守结合位点的替换模式进行比较，我们选择了前千个亲和力最高的保守位点，或者如果少于千个位点，则选择所有保守位点进行进一步分析。对于保守结合位点的每个位置，使用SiPhy程序（任务7）根据该位置的多重比对估计特定位置的平衡基分布π。基分布π描述了作用于位置的进化约束，假设位置独立进化(83). 守恒模式是通过平均保守位点每个位置的π频率来构建的。修正获得的多重假设检验P（P）值（霍尔姆方法）和测试位点中保守基序位点的数量如所示图S12.

由于甲基化CpG的高突变负荷，这种分析往往低估了含CpG序列的保守性。然而，为了避免测量变量依赖于校正项，我们没有校正突变率。HT-SELEX图案和保守图案之间的差异标志是通过减去相应的基频来实现的。

使用SSTAT计算Motif相似性(42)使用严格的I型误差阈值0.01限制低亲和力位点的影响（其他参数50%GC背景模型，伪计数正则化）。我们以前曾报道过，这种方法通常与其他常用方法产生类似的结果，但当两个不同的基序共享一个公共部分时，效果更好(26). 如果SSTAT相似性得分>1.5×10，则将结合模型相互连接⁻⁵然后，使用所得网络的最小支配集来选择具有代表性的PWM(25,26). 最小支配集是在相似网络中直接连接到原始集的所有PWM的最小PWM集。

富集分析

通过考虑TFs的集合进行富集分析，我们获得了一个基序作为参考群体，以避免采样偏差。由于SELEX富集是使用甲基化和非甲基化配体进行的，我们不认为这两类配体之间的种群会有特定的偏差。使用PANTHER进行GO富集分析(84)过度陈述测试（2016年7月15日发布），注释版本11.1。

结构分析和等温滴定量热法

人LHX4（残基153–220）、HOXB13（残基209–283）、MEIS1（残基279–333）、CDX1（残基154–217）和CDX2（残基169–262）的DNA结合域片段的表达和纯化如(85). 结晶中使用的DNA片段以单链寡核苷酸（Eurofins MWG）的形式获得，并在含有150 mM NaCl、1 mM三（2-羧乙基）膦（TCEP）和5%甘油的20 mM HEPES（pH 7.5）中退火。首先将纯化和浓缩的蛋白质与退火DNA双链溶液混合，LHX的摩尔比为2:1.2，HOXB13、CDX1和CDX2的摩尔比是1:1.2，HOXB13:MEIS1复合物的摩尔比则是1:1:1.2，然后在冰上放置1小时后进行结晶试验。使用Jena Bioscience JBScreen Nuc-Pro HTS（Jena Bios science，Jena，Germany）优化结晶条件。所有蛋白-DNA复合物在室温下通过蒸汽扩散技术在坐滴液中结晶。LHX4-DNA从含有50 mM Tris缓冲液（pH 8.0）、40 mM甲酸镁、30%（w/v）聚乙二醇单甲醚[PEGmme（5000）]和4%2-甲基-2,4-戊二醇（MPD）的溶液中结晶。HOXB13-MethDNA复合物从含有50 mM Tris缓冲液（pH 8.0）、100 mM MgCl的溶液中结晶₂，150 mM KCl，24%（w/v）PEG（3350）和8%甲基丙醇。从含有50 mM Tris缓冲液（pH 8.0）、100 mM MgCl的溶液中结晶CDX1-MethDNA和CDX2-MethDNA复合物₂，150 mM KCl，28.8%（w/v）PEGmme（5000）和5%的MPD用于CDX1_methDNA或8%的聚乙二醇（400）用于CDX2_methDNA。从含有50 mM Tris缓冲液（pH 8.0）、100 mM MgCl的溶液中生长了HOXB13、MEIS1与甲基化DNA的异二聚物晶体₂，150 mM KCl，24%（w/v）PEG（3350）和8%的1-戊醇。

所有数据集都是在欧洲同步辐射设施（ESRF，法国格勒诺布尔）收集的，在100 K时，使用储存溶液作为防冻剂，从束线ID29（LHX4和HOXB13:MEIS1_methDNA）和ID23–1（HOXB13_methDNA、CDX1_methDNA和CDX2_meth脱氧核糖核酸）上的单晶收集。使用BEST程序优化数据收集策略(86). 数据与程序XDS集成(87)并使用SCALA进行缩放(88). 数据收集统计数据见表S6.

使用Phaser程序通过分子替换技术求解所有结构(89)在凤凰城实施(90)和CCP4(88)和CCP4程序套件下的Molrep。首先利用MEIS1（PDB条目4XRM）结构作为搜索模型的Phaser程序，通过分子替换求解HOXB13:MEIS1_methDNA的结构。所找到的MEIS1的解决方案是固定的，并且使用来自HOXA9/PBX1复合体的HOXA9的坐标（PDB条目1PUF）来确定HOXB13的位置。两种蛋白质定位后，DNA密度清晰，并使用COOT手动构建分子(91,92). 使用REFMAC5进行刚体细化，然后使用REFMAC进行约束细化，如CCP4和Phenix refine中所实现的那样(93). HOXB13的精细模型后来被用作搜索模型，以确定HOXB12与甲基化DNA的结构，并用于求解CDX1_methDNA和CDX2_methDNA结构（序列一致性为43%）。DNA与蛋白质相互作用的部分清晰可见，并手动构建到出现的电子密度并进行精细化。

LHX4的搜索模型是大鼠胰岛素基因增强子蛋白ISL-1的同源结构域，作为搜索模型，该同源结构域与LHX4（PDB条目1BW5）的DBD具有48%的一致性。LHX4-DNA复合物第二亚单位的电子密度在这个阶段不太明显。包含LHX4和部分DNA的结果模型是固定的，第二个LHX4分子的位置由程序Molrep使用实现的球形平均相转移函数（SAPTF）确定，如(94). 两个蛋白质分子定位后，DNA密度清晰，DNA分子使用COOT手动构建(91,92).

使用Phenix对包含一个DNA和两个蛋白质分子的结果模型进行了改进。提炼(93)使用TLS功能。由于缺乏填料接触，第二亚基的密度远低于第一亚基的呈现密度。第一亚基N端和C端的前3个和最后4个氨基酸以及第二亚基N末端的7个第一氨基酸和C末端的4个最后氨基酸被发现是无序的，没有被纳入最终模型。细化统计信息如所示表S6实验数据和原子坐标已提交给蛋白质数据库，加入代码为5HOD（LHX4）、5EF6（HOXB13_methDNA）、5EGO（HOXB1 3:MEIS1_methDNA），5LUX（CDX1_methDNA）和5LTX（CDX2_meth脱氧核糖核酸）。

为了确定ONECUT2、LHX4、HOXA11和HOXB13 DBD对各自甲基化和非甲基化DNA基序的亲和力，使用ITC200微量热量计（美国马萨诸塞州北安普敦MicroCal）进行了等温滴定量热实验PSF（瑞典卡罗林斯卡研究所蛋白质科学设施和瑞典GE Healthcare）。通过直接滴定蛋白质到含有指示双链DNA配体的细胞，测定DNA的结合等温线。在20°C下进行测量。蛋白质和DNA均在含有20mM HEPES pH7.5、300mM NaCl、10%甘油和0.5mM TCEP的缓冲液中制备。共进行20次注射，每次注射间隔240秒。所有数据均使用热量计附带的OriginPro 7.0软件包（Microcal）进行评估。表观离解常数K（K）_d日，结合焓ΔH（H）-和化学计量n个以及它们相应的标准偏差，通过非线性最小二乘法将数据拟合到标准绑定方程中，使用软件包中实现的一组独立和相同的绑定位点的模型进行绑定。结合熵和自由能由Δ关系得到G公司= −RT公司自然对数K（K）_d日=ΔH−T型ΔS公司.

荧光素酶分析

由EurofinsGenomics公司合成了含有8个HOXC11结合位点的寡核苷酸(表S1)利用Sbf I和Spe I限制性内切酶将其克隆到pCpGfree启动子报告质粒（InvivoGen）中，该质粒含有报告基因（分泌型荧光素酶Lucia），完全不含CpG二核苷酸。利用CpG特异性甲基化酶M.SssI将重构的pCpGfree_promotor质粒中的胞嘧啶甲基化。将含有甲基化或非甲基化CpG位点的质粒与含有HOXC11基因的pCDNA3.1–3×FLAG-V5表达载体（多伦多大学Mikko Taipale赠送）和含有雷尼利亚使用FuGENE HD转染试剂（Promega）的荧光素酶（Promeca）。露西亚和雷尼利亚36小时后，通过双Glo萤光素酶测定系统（Promega）和EnVision多标记读取器（PerkinElmer）测量萤光素酶活性。