靶向性α-突触核蛋白过度表达诱导黑质纹状体系统帕金森样神经变性

材料和方法

动物和手术。年轻成年Sprague-Dawley大鼠（B&K Universal AB，斯德哥尔摩，瑞典）被关在笼子里，六只随意根据隆德大学研究伦理委员会制定的规则，在12小时的光/暗周期内获取食物和水。在氟烷麻醉下，将2μl载体悬浮液立体定向注射在右SN上，位于前角后方5.2 mm、外侧2.0 mm、硬脑膜腹侧7.2 mm处。在缓慢拔出之前，将针再放置5分钟。rAAV-CBA-α-突触核蛋白（8.2×10¹¹IU/ml），rAAV-CBA-μ-α-突触核蛋白（1.4×10¹²IU/ml）和rAAV-CBA-GFP（1.4×10¹¹IU/ml），并按所述进行滴定(McLaughlin等人，1988年;Conway等人，1997年;Zolotukhin等人，1999年). 如前所述，这里使用的CBA启动子是一个鸡β-肌动蛋白启动子，带有来自巨细胞病毒启动子的增强子元件(Xu等人，2001年). 为了进行组织学分析，在注射[绿色荧光蛋白（GFP）组，n个= 5; α-突触核蛋白基团，n个= 5–6; 和突变的α-突触核蛋白组，n个所有时间点=5，注射后3、8和27周进行生化分析(n个=3周时为4–5，以及n个=8周和27周时每组5人）。第二组动物(n个18例）双侧纹状体注射0.2μl 2%氟金（FG）溶液（前侧1.0 mm、外侧3.0 mm和腹侧5.0 mm），5天后进行单侧载体注射，如上所述(n个=每组6人）。这些动物在注射病毒后3周和8周被杀死(n个在每个时间点＝9）。第三组动物(n个=7）在右侧单侧黑质注射rAAV-CBA-α-突触核蛋白之前，在SN中双侧注射rAAV-CBA-GFP载体。这些动物在3点被杀(n个=3）和8周(n个=4）注射后。

一组单独的动物(n个=30）注射rAAV-CBA-GFP(n个=10），rAAV-CBA-α-突触核蛋白(n个=10），或rAAV-CBA突变型μ-α-synuclein(n个=10）载体，用于α-甲基治疗-d、 我-对位-酪氨酸甲酯如下所述。

免疫组织化学。在戊巴比妥麻醉下，动物通过升主动脉灌注生理盐水，然后灌注4%冰镇多聚甲醛。将大脑在相同溶液中固定2小时，转移到25%蔗糖中，并在冠状面40μm的冷冻切片机上切片。使用针对TH（小鼠IgG，1:2000；加州特梅库拉Chemicon）、GFP（鸡IgG 1:5000；明尼苏达州明尼阿波利斯R&D systems）、囊泡单胺转运蛋白-2（VMAT-2）（兔IgG：1:5000；Chemicon。Goldman，康奈尔大学）和人类α-突触核蛋白（小鼠IgG，1:2000；由宾夕法尼亚大学弗吉尼亚·M·李博士提供）。在每个培养期之间，将切片在磷酸钾缓冲液（KPBS）中冲洗三次。所有培养液均含有0.25%Triton X-100 in KPBS。在3%H中淬火10 min₂O（运行）₂/10%甲醇。用5%的正常马血清（NHS）预孵育2小时后，在室温下用一级抗体在2%NHS中孵育，用1:200稀释的生物素化马抗鼠抗体（BA2001；Vector Laboratories，Burlingame，CA）在2%NHS中孵养，然后用亲和素-生物素-过氧化物酶复合物（ABC Elite；Vector Laboratories，Burlingame，CA），并使用3,3-二氨基联苯胺作为显色剂进行可视化，安装在镀铬-明矾玻璃载玻片和盖玻片上。对于α-突触核蛋白和TH的双重荧光免疫组织化学分析，使用Alexa 488和Cy3-共轭二级抗体。

根据光学分馏器原理，使用OlympusDenmark A/S（Albertslund，Denmarks）CAST-Grid系统评估SN中TH阳性神经元的总数，如下所述(Kirik等人，1998年). 计数程序中包括涵盖序列号整个范围的每八个部分。误差系数小于0.10是可以接受的。纹状体TH阳性纤维密度通过密度测定法在三个冠状水平（+1.0、0.0、-1.0）下测量（相对于前角）。数据表示为三个水平的平均值，并表示为完整控制侧的百分比。

生化分析。组织DA和DOPAC含量(Schmidt等人，1982年)和在体外TH酶活性(Reinhard等人，1986年)在来自纹状体和SN（在所有时间点）以及来自27周组动物的伏隔核和前额叶皮层的组织样本上测定。称量组织块并将其分别冷冻在干冰上，并在−80°C下保存，直到进行分析。

行为测试。在载体注射后8周、13周、19周和27周以及皮下注射0.25 mg/kg脱吗啡HCl（西格玛，圣路易斯，密苏里州）后评估药物诱导的旋转，并在自动旋转仪中监测40分钟。数据表示为每分钟净满圈数，对侧圈数为负值。

如前所述，在载体注射后24-25周进行爪伸楼梯试验(Kirik等人，1998年). 剥夺食物2天后，将动物放在试验箱中，在四个步骤中的每一步（45 mg）用10粒食物颗粒进行双边诱饵。使用标准平台（27 mm）连续9天进行15分钟以上的测试，使用更宽的平台（34 mm）再进行5天。在宽平台测试的最后3天内，成功回收球团的平均总数构成因变量。

按所述进行步进测试(Kirik等人，1998年)注射病毒载体后8周。动物(n个=每组10人），连续3天每天测试两次，以确定基线表现。第四天，在腹腔注射60 mg/kgα-甲基之前，对动物进行一次测试-数字图书馆-对位-酪氨酸甲酯（溶于0.02%抗坏血酸盐；Sigma）；注射后6、24和48小时再次注射。当大鼠沿着桌子表面正手方向侧向移动时（5秒内90厘米），计算调整步数。

统计分析。进行了双向重复测量方差分析临时的使用简单的主效应进行分析，并对可接受的α水平进行Bonferroni校正对= 0.05. 为了比较各组之间的黑质细胞数量和纹状体纤维密度测量值以及存活时间，采用双向因子方差分析和临时的使用简单的主效应进行分析，并对可接受的α水平进行Bonferroni校正对= 0.05.

结果

为了研究α-突触核蛋白过表达对黑色素的影响，大鼠接受了一次2μl的高滴度rAAV载体注射，该载体在SN致密部（SNc）单侧含有人类α-突触素基因的wt或A53T突变。对照组大鼠接受了编码GFP的rAAV载体的相同注射。免疫组织化学，使用识别人类（wt和突变）而非大鼠α-突触核蛋白的抗体(Giasson等人，2000a)α-突触核蛋白在SNc内的几乎所有神经元、SN网状部（SNr）内的大量神经元以及SN背侧中脑网状结构内的神经元中均有表达（图。2E–L公司). 腹侧被盖区（VTA）中数量不等的细胞也呈阳性。在注射rAAV-GFP的对照动物中也观察到类似的细胞表达模式（图。1). 双TH/α-突触核蛋白免疫荧光显示，SNc中90%以上的TH阳性神经元表达α-突触核蛋白转基因（图。2M–O型).

两种类型的α-突触核蛋白（wt和突变体）都能有效地在异体内运输到各自的终末区：从SNc到纹状体，从VTA到边缘和皮质前脑区，从SNr到上丘和丘脑，从网状结构到广泛的间脑区。在黑质纹状体通路中，细胞体和轴突，包括纹状体终末的一部分，在1周时表达弥漫的细胞质α-突触核蛋白免疫反应（图。2A、 E类). 3周时，整个纹状体终末网络被填满（图。2B)包括VTA投射到嗅结节、伏隔核、外侧隔和前扣带回皮质的可变部分。在注射rAAV-GFP的对照动物中，GFP的转导和转运同样有效，完全填充了SNc神经元的细胞体、树突、轴突和轴突末端（图。1). 在最初几周内，表达逐渐增加；GFP或α-synuclein蛋白的最大表达在3-8周时观察到（图。1E–G公司,2E–G公司)并且在27周龄的动物中保持在较高水平（图。1D、 高、低,2D、 高、低). 与之前的观察结果一致（参见。Kirik等人，2000年)甲酚紫和苏木精染色切片在任何时间点均未观察到任何中毒或炎症反应的迹象。

讨论

这些结果表明，wt或突变型α-突触核蛋白的过度表达可导致黑质纹状体DA神经元发生进行性神经退行性病变，其特征是α-突触体阳性细胞质和轴突内含物、营养不良和分裂的神经突以及细胞死亡。这些退行性变化是黑质DA神经元特有的，在rAAV-α-突触核蛋白载体有效转导的三个中脑非多巴胺能神经元系统中没有发现。α-突触核蛋白表达的影响似乎是双重的：首先，当α-突触核蛋白呈弥散细胞质分布时（注射后3周），TH酶活性和纹状体DA水平受到抑制（约40–50%），随后黑质DA神经元减少30–80%，与细胞质内含物和营养不良性神经突起的出现以及DA神经元细胞丢失超过50-60%临界阈值的动物出现明显运动障碍相一致。SNc中90%以上的TH阳性神经元由rAAV载体转导。与之前使用该载体的研究一致(Mandel等人，1998年;Bjorklund等人，2000年;Kirik等人，2000年)α-突触核蛋白和GFP转基因在黑质纹状体神经元中长期稳定表达，载体注射27周后仍保持高表达。因为rAAV是一种单链DNA病毒，所以有可能两个cDNA互补的病毒必须感染一个细胞才能成功转导(Ferrari等人，1996年). 这开启了一种可能性，即不同数量的基因组拷贝被插入到给定的细胞中。因此，最终的表达水平可能会因转导细胞而异。这可能很容易解释为什么只有一些转导的SNc神经元退化，以及为什么不同动物的细胞丢失不同。

上一个在体外研究表明，α-synuclein的过度表达会对细胞产生毒性，该蛋白可以与氧化应激和线粒体损伤相互作用，发挥其细胞毒性作用(Ostrerova等人，1999年;Hsu等人，2000年;神田等人，2000年;Tabrizi等人，2000年). 因此，氧化应激以及细胞α-突触核蛋白水平的增加可能会促进α-突触核蛋白的聚集(Giasson等人，2000b;Hsu等人，2000年)从而可能导致线粒体损伤和有毒自由基的生成增加(Ostrerova等人，1999年;Hsu等人，2000年). 此外，Giasson等人（2000b）有报道称，α-synuclein是氧化损伤的靶点，α-sunuclein聚集成有毒内含物可能是由活性氧和氮物种硝化蛋白质引起的。我们的研究结果以及果蝇属(费尼和本德，2000年)表明DA神经元可能特别容易受到α-synuclein过度表达的影响。这可能是因为这些类型的细胞中DA和铁的含量都很高，所以自由基的产生量很高。类似地，氧化应激与线粒体复合物I和α-突触核蛋白聚集水平降低相结合被认为是人类PD中黑质DA神经元选择性死亡的基础(Hsu等人，2000年;大不里士等人，2000年).

这种“双重打击”模型可能解释了以下事实：本研究中α-突触核蛋白过度表达导致了一些但不是所有黑质DA神经元的病理变化和细胞死亡。尽管wt或突变α-突触核蛋白的细胞表达维持在高水平，但持续病理学的迹象，包括α-突触核蛋白阳性内含物和营养不良神经炎，随着时间的推移而消退。这表明，那些在α-突触核蛋白过度表达的最初影响下存活下来的神经元即使在转基因产物的细胞水平保持不变、增加的情况下也能存活和发挥功能。因此，只要细胞不暴露于过度氧化应激或其他可能损害线粒体功能的事件，α-突触核蛋白本身可能对细胞无毒。然而，神经化学数据表明，即使在没有任何明显的病理迹象的情况下，α-突触核蛋白也可能对DA神经元功能产生负面影响。因此，在长期存活的动物中，在载体注射6个月后，纹状体DA水平和纹状体TH酶活性平均降低了40–50%，而纹状体TH阳性神经支配在这个时间点显示出部分恢复（至正常的约75%）。与短期存活动物的观察结果一致，即载体注射后3周，这些数据表明，细胞内α-突触核蛋白水平增加可能对DA合成和储存产生直接抑制作用。

虽然长期以来，氧化应激被认为与PD的发病机制有关，但泛素蛋白体处理系统导致的蛋白质降解功能障碍只是最近才被认为是主要的发病机制。对这种蛋白质降解机制的关注源于多种形式家族性PD的鉴定，其中突变基因：α-突触核蛋白、parkin和泛素C末端水解酶L1（UCHL1）都与蛋白质体降解系统有关(Shimura等人，2000年). 因此，在本研究达到的水平上，黑质DA神经元中α-突触核蛋白的过度表达可能会压倒蛋白质体途径成功处理和清除细胞中多余α-突触核蛋白的能力。此外，α-突触核蛋白的过度表达可能导致细胞内22kDa形式的α-突触核蛋白水平增加(Shimura等人，2001年). 虽然这种糖基化α-突触核蛋白亚型尚未得到很好的表征，但它可能对某些神经元有毒，但对其他神经元则没有毒性(Shimura等人，2000年). 根据该模型，如果所有形式的α-突触核蛋白（wt或突变体）在足够高的水平上表达，或者如果它们受到氧化损伤（例如，通过黑质神经元中DA的氧化代谢），则可能有毒，或者是因为α-突触核蛋白的细胞处理受损（parkin基因突变的患者可能会出现这种情况；Shimura等人，2001年). 这一论点进一步表明，黑质外的非多巴胺能神经元，或黑质内的多巴胺抵抗神经元，可能通过更有效地处理过量的α-突触核蛋白而得到保护。这里看到的α-突触核阳性包涵体没有泛素染色，这一事实与α-突触核蛋白本身可能不是泛素化的底物这一事实相一致(Tofaris等人，2001年). 此外，神经退行性变发生的速度（在本文研究的过度表达模型中为3-8周，而在PD患者中为数月或数年），至少可以部分解释为细胞内α-突触核蛋白的过度表达水平以及细胞处理该蛋白降解的能力。

使用rAAV载体在黑质纹状体系统中靶向α-突触核蛋白过度表达的技术提供了一种新的PD模型，该模型再现了人类疾病的一些主要病理、神经化学和行为特征，因此，这为阐明家族性或特发性PD神经变性的发病机制提供了一个有趣的工具。使用病毒载体过度表达假定的毒性蛋白，如α-突触核蛋白，可能比标准转基因小鼠具有明显优势。首先，在动物生命周期内的任何时候，都可以将病毒载体注射到大脑中的任何特定解剖位置。第二，病毒载体可以在一个半球投与，让另一个半球作为对照，在这里使用的模型系统中，允许使用依赖于行为不对称的功能测试。第三，病毒载体转导的优点是可以在大鼠身上使用，也就是说，在一种比小鼠更适用于行为研究的物种中。最后，病毒载体策略的使用也适用于其他物种，因此也可以研究灵长类动物中α-突触核蛋白过度表达的影响。事实上，使用病毒载体策略的α-突触核蛋白过度表达导致黑质纹状体DA系统的神经病理学和细胞死亡比迄今为止使用转基因技术在小鼠中实现的更为显著。因此，病毒载体战略将增加一个重要的研究工具，以补充其他众所周知的，体内基因修饰策略。