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2018年8月7日；43(10):1897–1904. 数字对象标识：10.1007年/11064-018-2607-7

TLR2配体Pam3CSK4通过MAPK/NF-κB信号通路调节原代脑微血管内皮细胞MMP-2/9的表达

朱红艳 1,2,三，4,戴荣荣 5,周友泉 6,郝福 7,强蒙（Qiang Meng） 7,✉
PMCID:PMC6182369 PMID：30088235

摘要

血脑屏障（BBB）破坏与多种神经疾病有关。脑微血管内皮细胞（BMEC）是血脑屏障的关键组成部分。基质金属蛋白酶-2/9（MMP-2/9）和toll样受体-2（TLR2）在BMEC中共表达，并已被证明在血脑屏障破坏中发挥重要作用。目前尚不清楚TLR2是否能调节BMEC中的MMP-2/9。在本研究中，使用Pam3CSK4激活TLR2，并通过定量实时PCR和蛋白质印迹测量血脑屏障中MMP-2/9和紧密连接（TJs）的表达。用蛋白质印迹法测定磷蛋白。使用丝裂原活化蛋白激酶（MAPKs）和NF-κB抑制剂来确定TLR2调节BMEC中MMP-2/9表达的信号通路。本研究表明，Pam3CSK4上调了BMEC中MMP-9的mRNA和蛋白表达，同时下调了MMP-2和TJ的表达。Pam3CSK4还诱导了BMEC中MAPK和NF-κB信号通路的磷酸化。经ERK1/2和JNK抑制剂预处理后，MMP-9表达降低，但p38未降低。然而，添加NF-κB抑制剂后，MMP-2和MMP-9的mRNA和蛋白表达增加。我们的结果表明，Pam3CSK4能够通过ERK1/2和JNK信号通路上调MMP-9的表达，但NF-κB信号通路负调控TLR2对BMEC中MMP-2和MMP-9表达的影响。该发现为MMP-2/9在BMEC中表达的分子机制提供了新的见解。

关键词：Toll样受体-2、基质金属蛋白酶、Pam3CSK4、丝裂原活化蛋白激酶、脑微血管内皮细胞

介绍

Toll样受体（TLR）是跨膜模式识别受体（PRR），不仅参与全身细菌感染，也参与脑损伤[1]. TLR在哺乳动物天然免疫细胞和非免疫细胞中表达，如上皮细胞和内皮细胞[1]. 中枢神经系统（CNS）中几乎所有类型的细胞，包括小胶质细胞、神经元、星形胶质细胞[2]，和内皮细胞[三]，表示TLR。目前已知13个鼠TLR和10个人TLR[4,5]. TLR2是一种在细胞表面表达的TLR[2]. 先前的一项研究表明，在小鼠脑缺血模型中TLR2的mRNA表达上调[6]. 与野生型小鼠相比，TLR2缺乏小鼠脑缺血损伤后梗死面积减小[6].

血–脑屏障（BBB）在维持中枢神经系统微环境的稳态中起着关键作用。BBB由脑微血管内皮细胞（BMEC）形成，由紧密连接（TJ）和粘附连接（AJ）连接[7]. 内皮细胞之间的TJ和AJ维持BBB的完整性[三]. 血脑屏障破坏与一系列中枢神经系统疾病有关，如多发性硬化症[7]缺氧和缺血[8].

基质金属蛋白酶（MMPs）是一个锌依赖酶家族，通过降解内皮细胞的TJ破坏BBB完整性[9]. MMP-2/9降解脑血管周围基底层的主要成分，包括IV型胶原、层粘连蛋白和纤维连接蛋白[9]. 最近的报告表明，MMP-2/9和TLR2[三]以BMEC表示。TLR2可激活丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）通路[三]. 其他研究表明MMPs受MAPK信号通路调节[10]. 然而，其分子机制此前尚未进行研究。我们推测TLR2激活可能通过MAPK和NF-κB信号通路诱导BMEC中MMP-2/9的表达，从而导致BBB的破坏。因此，我们使用TLR2合成类似配体Pam三胱氨酸-丝氨酸-赖氨酸4（Pam3CSK4）激活TLR2，并探讨Pam3CSK4是否以及如何调节BMEC中MMP-2/9的表达。

材料和方法

试剂

TLR2激动剂Pam3CSK4购自InvivoGen（美国加利福尼亚州圣地亚哥）。U0126（ERK1/2抑制剂）购自Cell Signaling Technology（美国马萨诸塞州贝弗利）。SB203580（p38 MAPK抑制剂）、SP600125（JNK抑制剂）和BAY11-7082（NF-κB抑制剂）购自Calbiochem（加利福尼亚州圣地亚哥，美国）。

对于western blot分析，抗TLR2（目录ab108998；1:1000）、抗MMP-9（目录ab76003；1:1000。Anti-claudin 5（目录号ABT45；1:1000）和anticolagen IV（目录号ab6586；1:2000）分别从默克Millipore（美国马萨诸塞州Billerica）和Abcam（中国上海）购买。Anti-ZO-1（目录61-7300；1:4000）从Invitrogen（美国加利福尼亚州卡尔斯巴德）购买。β-actin来自Proteintech（美国伊利诺伊州罗斯蒙特）。抗磷酸化ERK1/2（目录号4377）、pJNK（目录号4668）、pP38 MAPK（目录编号4511）和pNF-κB p65（目录号3033）的抗体购自Cell Signaling Technology。

原代脑微血管内皮细胞（BMEC）培养

所有实验均按照美国国立卫生研究院《实验动物护理和使用指南》进行，并经中国昆明理工大学动物护理委员会批准。BMEC培养自先前发表的Sprague–Dawley新生大鼠大脑皮层[11]. 内皮细胞在含有20%胎牛血清（FBS）的DMEM/高糖中培养24 h，并用4µg/mL嘌呤霉素进行筛选（美国俄亥俄州Amresco）。用von Willebrand因子（vWF，1:50，Proteintech，Rosemont，IL，USA）免疫荧光染色鉴定BMEC。

定量实时聚合酶链反应

使用Eastep™Total RNA Extraction Kit（中国上海Promega）从BMEC中分离出总RNA。通过NanoDrop2000（Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA，USA）测量分离RNA的质量和数量。根据制造商的方案，使用GoScript™逆转录系统（Promega）合成第一链cDNA。使用SYBR®Premix Ex TaqTM II（TliRNaseH Plus，Takara，Dalian，China）在Roche LightCycler 480上对1 uL cDNA产物进行定量实时聚合酶链反应（qRT-PCR）。

底漆β-肌动蛋白、MMP-2和MMP-9大鼠引物的设计如下：

β-肌动蛋白（正向：5′-GGAGATTACTGCCTGGCTCCTA-3′，反向：5′-GACTCATCGTACTGCTTGCTG-3′）；

MMP-2（正向：5′-ACCTTGACCAGACACACACATCGAG-3′，反向：5′-CAGGGTCCAGTGTGTA-3′）；

MMP-9（正向：5′-CATGCGCTGGGCTTTAGATCA-3′，反向：5′-GAGGCCTGGGTCAGGTTAGAG-3′）。PCR条件为：一个周期的初始变性（95℃30 s）、40个周期的扩增（40个周期95℃5 s、55℃30 s、72℃30s）和一个周期扩增曲线分析（95℃5s、60℃60s、95℃）。每个反应重复三次。比较mRNA表达水平表示为2-ΔΔCt.

Western Blot分析

用含有蛋白酶抑制剂鸡尾酒（Calbiochem，加州圣地亚哥，美国）和PhosSTOP（Roche Applied Science，伊利诺伊州罗克福德，美国）的RIPA裂解缓冲液（Beyotime Biotechnology，中国上海）收集细胞裂解产物。上清液中的蛋白质浓度通过双钦尼克酸（BCA）分析（Beyotime Biotechnology）进行检测。蛋白质通过western blot分离，然后转移到聚偏二氟乙烯膜（Merck Millipore），然后用含有0.1%吐温20和5%（w/v）脱脂奶的Tris缓冲盐水（TBS；Sangon Biotech，中国上海）封闭。将膜与一级抗体在4°C下孵育过夜，然后在室温下与辣根过氧化物酶（HRP）结合的二级抗体（1:5000，Proteintech）孵育2小时。抗体稀释率为：TLR2抗体（1:1000）、MMP-9抗体（1:100）、MMP2抗体（1:11000）、闭塞素抗体（1:12000）、克劳丁5抗体（1:10000）、IV型胶原抗体（1:2000）、ZO-1抗体（1:4000）、β-肌动蛋白抗体（1:5000）、p-ERK1/2、p-JNK、p-p38和p-NF-κB p65抗体（1:1000。使用增强化学发光（Proteintech）对带状物进行可视化，并使用膜成像系统（Bio-Rad，Hercules，CA，USA）进行拍照。使用ImageJ软件（美国马里兰州贝塞斯达NIH）半定量测量带强度。

统计分析

结果表示为平均值±标准误差（SE）。采用单因素方差分析（ANOVA）进行统计分析，然后进行最小显著性差异检验。第页 ≤ 0.05被认为具有统计学意义。

结果

Pam3CSK4上调BMEC中MMP-9的表达但下调MMP-2的表达

据报道，BMEC可以表达两种MMPs[12]和TLR2[三]. 为了研究TLR2激活对BMEC中MMP-2/9的影响，我们用1µg/mL Pam3CSK4处理细胞1、2、3、6和24小时。MMP-9的mRNA和蛋白表达分别在3和6小时增加(第页 < 0.05，图1b、 d）。MMP-2 mRNA水平在第1、2和3小时显著降低(第页 < 0.05，图1a） ●●●●。然而，MMP-2蛋白水平在2小时后下降(第页 < 0.05，图1c） ●●●●。

图1。

图1

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Pam3CSK4刺激的BMEC中MMP-2和MMP-9的mRNA和蛋白表达水平。用Pam3CSK4（1µg/mL）刺激BMEC 1、2、3、6和24小时。MMP-2的mRNA表达水平(一)，基质金属蛋白酶-9(b条)用qRT-PCR分析β-actin。收集细胞检测MMP-2(c（c）)和MMP-9(d日)蛋白质表达采用western blot，蛋白质水平采用ImageJ软件定量，并用β-肌动蛋白水平进行标准化*第页 < 0.05, **第页 < 与用PBS处理细胞的对照组相比，0.001

Pam3CSK4下调BMEC中TJ的表达

基质金属蛋白酶降解BMEC中的TJ蛋白（如克劳丁5和闭塞素）和基底膜蛋白（如层粘连蛋白和胶原），导致BBB的破坏[13,14]. 为了观察TLR2刺激是否能破坏BMEC中的TJ，加入TLR2激动剂Pam3CSK4后，用western blot法测定克劳丁5、闭塞素、ZO-1和IV型胶原蛋白水平。发现克劳丁5（图2a） 和IV型胶原蛋白（图2c） 2小时后，ZO-1水平下降（图2d） 经Pam3CSK4治疗后，BMEC在3小时时下降（全部第页 < 0.05). 然而，闭塞素水平没有改变（图2b） ●●●●。

图2。

图2

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Pam3CSK4刺激的BMEC中TJ的蛋白表达水平。用Pam3CSK4（1µg/mL）刺激BMEC 1、2、3、6和24小时。收集细胞检测克劳丁5(一)，咬合蛋白(b条)，IV型胶原蛋白(c（c）)和ZO-1(d日)蛋白质表达采用western blot，蛋白质水平采用ImageJ软件定量，并用β-肌动蛋白水平进行标准化*第页 < 0.05, **第页 < 与用PBS处理细胞的对照组相比，0.001

Pam3CSK4诱导BMEC中MAPK和NF-κB磷酸化

在用1μg/mL Pam3CSK4处理BMEC 1、2、3、6和24小时后，我们通过蛋白质印迹检测MAPK和NF-κB的磷酸化。ERK1/2的磷酸化（图三a） ，JNK（图三c） 和第38页（图三b） 1小时检测到MAPK(第页 < 0.05). ERK1/2和JNK的磷酸化倾向于持续3小时，尽管在2小时和3小时没有统计学意义(第页 > 0.05，图三a、 c）。在3和6小时诱导NF-κB磷酸化(第页 < 0.05，图三d） ●●●●。

图3。

图3

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Pam3CSK4诱导BMEC中ERK、JNK、p38和NF-κB磷酸化。用1µg/mL的Pam3CSK4处理细胞不同时间后，磷酸化ERK的表达(一)，第38页(b条)、JNK(c（c）)和NF-κB(d日)western-blot分析并用β-actin蛋白水平进行归一化*第页 < 0.05, **第页 < 与用PBS处理细胞的对照组相比，0.001

Pam3CSK4通过ERK1/2、JNK和NF-κB途径调节MMP-2/9的表达

为了研究TLR2调节BMEC中MMP-2/9表达的信号通路，用ERK1/2抑制剂（20µM U0126）、p38 MAPK抑制剂（20μM SB203580）、JNK抑制剂（20µM SP600125）和NF-κB抑制剂（10µM BAY11-7082）或DMSO（0.1%溶媒对照）预处理细胞1小时，然后用1µg/mL Pam3CSK4处理6小时。用qRT-PCR和western blotting检测MMP-2和MMP-9的表达。如图所示4b、 d、U0126和SP600125显著抑制MMP-9的表达，而Pam3CSK4上调了MMP-9表达（所有第页 < 0.05). 与载体+Pam3CSK4组相比，SB203580和BAY11-7082未抑制MMP-9的上调（图4b、 d）。然而，BAY11-7082预处理细胞后，MMP-2的mRNA和蛋白表达(第页 < 0.001，图4a、 c）和MMP-9的mRNA分别与载体对照组和载体+Pam3CSK4组相比增加(第页 < 0.001，图4b） ●●●●。

图4。

图4

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Pam3CSK4通过MAPK/NF-κB信号通路影响BMEC中MMP-2和MMP-9的表达水平。用ERK1/2抑制剂（U0126）、p38 MAPK抑制剂（SB203580）、JNK抑制剂（SP600125）和NF-κB抑制剂（BAY11-7082）或DMSO预处理BMEC 1 h，然后用1µg/mL Pam3CSK4处理6 h。MMP-2的mRNA表达水平(一)，基质金属蛋白酶-9(b条)用qRT-PCR分析β-actin。收集细胞检测MMP-2(c（c）)和MMP-9(d日)蛋白质表达采用western blot，蛋白质水平采用ImageJ软件定量，并用β-肌动蛋白水平进行标准化*第页 < 0.05, **第页 < 0.001，与用PBS处理细胞的载体对照组相比

讨论

中枢神经系统中血液和大脑之间有三个主要屏障：血脑屏障、血脑脊髓液屏障和蛛网膜屏障[15]. BBB功能障碍与几种神经疾病的病理生理学相关[15]例如中风、多发性硬化症（MS）和阿尔茨海默病（AD）。BBB分解也与细胞因子、趋化因子和其他物质有关，包括基质金属蛋白酶[16].

MMPs家族包括20多种蛋白水解酶[17]. 它们通常分为四类：胶原酶、明胶酶（MMP-2和MMP-9）、基质溶素、基质溶酶和膜型MMPs[18]. MMPs家族参与组织重塑、癌症转移、慢性炎症和神经疾病[19]. 基质金属蛋白酶还能够降解几种蛋白酶、生长因子、细胞表面受体和细胞-细胞粘附分子[20]. 在受损的脑组织中，各种细胞表达MMPs，包括常驻细胞（内皮细胞、星形胶质细胞和神经元）和浸润性炎症细胞[9]. MMP在成人大脑中的表达通常很低，但许多研究表明，缺血性卒中后几种MMP被激活，并且其水平增加[21,22]. MMP活性在四个不同水平上受到严格调节：转录水平的基因表达；分区；前酶激活；和抑制蛋白水解[23].

当激动剂配体与TLR结合时，配体分子将激活TLR信号通路。TLR信号通路有两种类型：髓系分化因子88（MyD88）依赖性通路和TIR-域适配器诱导干扰素-β（TRIF）依赖性（MyD88-independent）通路[2]. TLR2激活MAPK[三]和转录因子（NF-κB）通过MyD88依赖性信号通路，导致促炎细胞因子的表达，如白细胞介素（IL）-1、IL-6和肿瘤坏死因子（TNF）-α以及基质金属蛋白酶的产生。MAPKs包括三个主要成员：细胞外信号相关激酶（ERKs）、c-Jun N-末端激酶（JNKs）/应激激活蛋白激酶和p38[24].

最近的研究表明，MMP-2/9与中枢神经系统疾病密切相关。先前的研究人员揭示了MMP-9在不同细胞类型中的表达受MAPKs的调节[25–27]. 此外，转录因子NF-κB参与调节几种细胞类型中MMPs的表达。几种TLR激动剂可以激活NF-κB并调节MMP的表达[26]. 然而，BBB的BMEC的分子机制尚未阐明。我们的研究表明，TLR2配体Pam3CSK4可以显著上调BMEC中MMP-9的表达，下调MMP-2的表达。同时，TLR2的刺激导致克劳丁-5、IV型胶原和ZO-1的下调，这与人类大脑内皮细胞系hCMEC/d3的研究一致[三]. MMP-2/9是炎症反应的关键介质，可能导致BMEC中的TJ降解和中枢神经系统疾病中BBB完整性的缺乏。先前的研究表明，MMP-9可以损伤TJ蛋白[28]. 据报道，活性MMP-9诱导ZO-1表达降低[29]MMP-9基因敲除小鼠缺血后ZO-1的降解减弱[30]. 可以合理地得出结论，TLR2激活可能通过增加BMEC中MMP-9蛋白水平来降解ZO-1。然而，MMP-9蛋白诱导的时间为3-6小时，而本研究中仅在治疗2小时后观察到克劳丁-5或IV型胶原的减少。我们只通过western blot和qRT-PCR检测细胞中MMP-9的含量。因此，推测上清液或其他物质中分泌的MMP-9会导致治疗2小时后克劳丁-5和胶原蛋白IV的减少。

Pam3CSK4是TLR2的特异配体[31]在本研究中，Pam3CSK4在1小时诱导了BMEC中ERK、JNK和p38 MAPK的磷酸化，在3和6小时诱导了NF-κB的磷酸化。此外，为了研究Pam3CSK4影响MMP-2/9表达的信号通路，我们用抑制剂预处理BMEC 1小时，然后用Pam3CSK4处理细胞6小时。ERK1/2抑制剂（U0126）和JNK抑制剂（SP600125）显著阻断Pam3CSK4诱导的MMP-9表达。与溶媒对照组相比，p38 MAPK抑制剂（SB203580）不抑制MMP-9的上调。结论：TLR2可能通过ERK1/2和JNK信号通路调节BMEC中MMP-9的表达。相反，在用NF-κB抑制剂（BAY11-7082）预处理细胞后，MMP-2/9的mRNA和蛋白表达与载体对照组相比明显增加，但只有MMP-9 mRNA表达与载体+Pam3CSK4组相比显著增加。结果表明，TLR2通过NF-κB信号通路负调控BMEC中MMP-2和MMP-9的表达。先前的研究表明TLR2激活了两条下游通路，包括IKK复合物和MAPK家族，然后激活NF-κB和激活蛋白-1（AP-1），导致促炎细胞因子的表达[32]. 然而，一项研究报道磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）负调控TLR2信号[33]. 因此，推测Pam3CSK4对MMP-2表达的调节涉及NF-κB信号通路和其他信号通路（如PI3K通路）之间的平衡。然而，这个实验有局限性。选择Pam3CSK4刺激BMEC 6 h以研究TLR2调节MMP-2表达的信号通路是不合适的，因为刺激Pam3CSK4 6 h后，BMEC中MMP-2的mRNA和蛋白水平没有变化（图1a、 b）。

总之，TLR2通过ERK1/2和JNK信号通路调节MMP-9的表达，通过NF-κB信号通路负调控MMP-2/-9的表达。该发现可能为MMP-2/-9在BMEC中表达的分子机制提供新的见解。

致谢

本研究得到国家自然科学基金资助（81460188）；云南省应用基础研究项目（No.2011FB148）；云南省科技厅与昆明医科大学应用基础联合专项（No.2013FB201）；云南省中青年学术技术带头人和后备人才（No.2012HB028）；云南省卫生系统领导（No.D-201235）；王龙德院士工作站。

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利益冲突

提交人声明他们没有利益冲突。

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