GeneMarkS：一种自训练方法用于预测微生物基因组中的基因启动。启示在调控区域中寻找序列基序

基因组序列数据

当前研究中使用的序列数据包括以下基因组可在GenBank数据库中找到：A.pernix公司(31),富氏A.fulgidus(32),枯草芽孢杆菌(33),大肠杆菌(34),流感嗜血杆菌(35),幽门螺杆菌(36)，甲烷杆菌(37),詹氏甲烷球菌(38),结核分枝杆菌(39)，协同孢子虫 PCC6803型(40)。

其他序列集

GenBank对完整原核基因组的注释经常是用作基因发现准确性测试的基准。然而，a完整原核基因组GenBank注释的简单分析提供了令人信服的证据，证明对基因的系统偏见通过最长的ORF规则开始注释（表1). 这种偏见在基因组中最为明显列在表的上半部分1，带有几乎所有被注释为最长ORF的基因（只有ATG被认为是可能的起始密码子）。在光谱的另一端（表1，底部），是几个原核基因组其注释基因与最长ORF在～80%的病例中一致。

除非涉及特殊的翻译机制有理由证明普遍缺乏帧内启动DNA序列中位于注释的基因起始点之间的密码子作为最长的ORF和第一个上游终止密码子。既然如此机制未知且可能不存在，GenBank注释，特别是表格上半部分的基因组1，应谨慎使用。我们假设这个枯草杆菌基因组是少数注释之一可用于评估基因准确性的完整基因组开始寻找针对基因的方法。评估稳健性基因标记S对基因长度的预测准确性我们使用了从枯草杆菌基因组序列及蛋白质验证相似性搜索。在另一项基因启动预测准确性测试中我们用了195个大肠杆菌启动基因通过对其N末端的测序实验证实蛋白质产品(41)。

GeneMarkS算法概述

序列数据处理和模型训练的阶梯图如图所示1。在第一步中，确定了启发式马尔可夫模型的参数通过前面描述的方法(13)。这组启发式模型包括三个周期的二阶蛋白质编码序列的马尔可夫模型和二阶齐次非编码序列的马尔可夫模型。过渡和初始概率启发式模型的参数可以从样本DNA中估计序列短至400 nt(13)。此方法使用之前列出的线性相关性特定核苷酸及其密码子位置特异性频率全局频率，以及物种蛋白质组中给定的氨基酸和基因组。这些线性函数的参数由以下公式确定17个完整细菌基因组的回归分析(13)。

这组启发式模型还包括用解析或数值描述的编码和非编码区域。该算法的准确性被证明是相当不敏感的这些长度分布中的物种特定变化（数据未显示）。因此，在程序中，我们使用了长度分布源自的GenBank注释大肠杆菌基因组。

新的2.0版GeneMark.hmm基因预测算法是用于连续基因发现和模型的多次迭代精致。吉布斯采样程序应用于每次迭代对齐预测基因的上游序列。未映射倍数比对挑选出基因上游的保守位点启动。该位点的位置核苷酸频率模型在GeneMark.hmm中使用了间隔棒的长度分布识别基因启动的2.0程序。

GeneMark.hmm的v2.0具有预测基因的能力具有任意长度的重叠（图。2). 这个新版本还集成了上游保守的两组分模型区域、位置核苷酸频率模型和间隔区长度分布到Viterbi算法中。相比之下，以前描述了GeneMark.hmm(9)使用RBS在后处理步骤的位置频率模型。

第一步中定义的启发式模型集不包含基因启动上游保守位点模型（即RBS）。尽管如此，该算法还是解析了输入的完整长度将序列划分为编码区和非编码区，并提供第一个基因启动的近似值（图。1). 鉴于根据这一信息，选择了一组上游序列。这个上游序列的长度是一个算法参数。在我们的计算中它被选择为等于25或50nt。注意对于模型来说，仅上游序列的子集可能就足够了推导。起始于某一特定位置的一组基因与前一个基因的距离（即至少50 nt）可能构成这样的子集。推测这些基因的上游序列包含保守的功能位点，不与编码区重叠。这个从这样的序列集中提取出的位点模体是预先期望的更加明显。注意，这个推测被发现是与下面引用的序列分析结果一致。一套上游序列，默认选择不包含预测编码区域，通过吉布斯抽样程序进行无间隙对齐(19,24)确定了具有最高信息内容的多重对齐窗口(24). 从这个窗外的街区对于多序列比对，可以立即定义守恒矩阵的位置频率矩阵模型位于翻译起始点上游并在下文中调用的功能站点起动前的信号。当使用25 nt长上游序列时，这种排列通常显示出一个具有一致序列互补的基序被研究物种16S rRNA的一部分。但是，如果在一些物种中使用了50 nt长的上游序列，如下所示，序列比对过程确定了启动子相关的典型基序地点。

间隔棒的长度定义了预启动的精确位置关于平移开始的信号。因此，有两种模型描述了启动前信号、图案或位置频率矩阵和间隔棒长度频率分布。在每个步骤中在GeneMarkS培训中，这两个模型是通过定义的启动前序列的吉布斯采样多重比对上一次运行GeneMark.hmm 2.0时。反过来，GeneMark 2.0程序使用预启动母题和间隔棒长度分布除第一步外的所有步骤（图。1). 在在第一步中，该程序仅使用编码和非编码区域并生成第一个序列解析分为编码区和非编码区。编码的马尔可夫模型和在正则的所有后续步骤中派生的非编码区域循环被称为伪本机模型，因为它们是从真正的DNA序列分类生物信息学作为编码和非编码区域。伪本地模型捕获物种特异性寡核苷酸频率模式比启发式模型更接近(13)。

在每次迭代中使用一组预测的开始来确定启动密码子ATG、GTG、，CTG、TTG。GeneMark.hmm中使用了更新的频率集2.0版本。

重复GeneMarkS迭代，直到序列解析与上一个迭代的99%相同，或者直到身份百分比开始波动相当高的水平。最终生成的序列解析迭代运行是程序输出以及导出的模型并完善到这一点。注意非典型基因模型成为原始GeneMark.hmm程序的一部分(9)在GeneMarkS迭代中被有效关闭。因此，GeneMarkS产生的蛋白质编码区的马尔可夫模型必须被视为典型的基因模型。请注意，有用启发式模型代替非典型模型的有趣选择基因模型。我们在下面解决这个问题。

GeneMarkS过程不限于派生和使用二阶马尔可夫模型。它可以建立更高的模型订单，如果认为申请合理。然而，类似地之前报告的观察结果(9)，在我们的GeneMarkS测试中使用高阶模型（未显示数据）。The robustness of the原核基因类型的二阶模型具有频繁的长非中断蛋白编码区的组织。由于这种能力，低阶模型可以检测到这些基因要累加的GeneMark.hmm最大似然框架长ORF偶数内的“编码区域信号”当使用低信噪比的低阶模型时。

基因检测的准确性

首先我们讨论检测基因或预测蛋白质的准确性用“开放式开始”对ORF进行编码传统上，原核基因发现工具的准确性得到了表征通过它们在鉴定原核基因独特标记方面的表现，他们的3′端。GeneMarkS程序在八个匿名原核序列上运行全基因组富氏杆菌、枯草芽孢杆菌、大肠杆菌,流感嗜血杆菌,幽门螺杆菌、M.jannaschii、， 热自养M和协同孢子虫。于完成GeneMarkS迭代，一次特殊运行的GeneMark.hmm执行2.0。在此运行中，新推导的马尔可夫模型蛋白编码区被用作典型的基因模型由GeneMarkS导出的启动前信号的另两个模型，位置频率基体和间隔棒长度分布。此外，要完成我们使用了一组可以在GeneMark.hmm 2.0中使用的模型非典型基因模型和非编码区定义模型通过启发式方法(13). 这个比较预测基因的3′端带有基因3′端注释在GenBank中。表征敏感性和特异性的数字所有八个基因组的预测结果如表所示2.数字表明精度相当高用于一个自我训练的单序列基因查找器。

精确基因预测的准确性

GeneMarkS在精确基因预测中的性能测试已完成枯草杆菌基因组。预付款迭代过程的步骤如左图所示表的一半三.在第一次迭代时带有启发式模型的GeneMark.hmm 2.0枯草杆菌编码和非编码序列检测到注释的4099个基因中98.0%在GenBank中。然而，随着程序的RBS模块切换除此之外，只有56.6%的人准确预测了基因启动基因。RBS模型的生成和添加提高了百分比基因的准确预测为80.8%，而检测到的基因中，98.1%的基因基本相同。下一次允许生成的伪本机模型的步骤、生成和使用83.1%的准确预测枯草杆菌基因而检测到的基因的百分比下降到97.0%。检测到的基因数量的变化证实了早期观察到GeneMark.hmm程序中使用的启发式模型能够检测典型和非典型类别的基因(13). 启发式敏感性的增加然而，模型是以特异性下降为代价实现的。经过三个常规周期后，预测值相同的百分比到前一个达到99%，迭代停止。在最后一步，预测了4224个基因。与相比GenBank中注释的基因似乎有83.2%枯草杆菌基因被精确预测，而96.7%的注释基因被检测到。RBS图案图中显示了由GeneMarkS导出的间隔棒长度分布在图中三序列形式的A和B徽标(42)和线图。以前精确预测精度的报告数字枯草杆菌基因如下所示。框架式程序(15)发现85.8%的基因启动和ORPHEUS(14)预测80.2%的基因起始于346个基因的测试集。比较的精度数据表明，GeneMarkS是一种自我训练程序，是两种帧对帧的合理替代方案该计划利用大量以前的注释序列和ORPHEUS，用于非监督从序列比较到综合数据库的训练数据集已知蛋白质序列。

整体上的类似测试大肠杆菌基因组表明GeneMarkS的预测与GenBank注释相匹配只有69.7%的病例出现基因突变。然而，考虑到缺乏已验证基因启动的数据，应采用此数字谨慎行事。在一个更现实的测试中，我们使用了一组195大肠杆菌起始基因已通过实验验证通过蛋白质N末端测序(41)。表三（右半部分）详细介绍对这个测试的描述，一次又一次的迭代。在最后一步，195个基因中有184个得到了准确预测（94.4%）共检出195例（100%）。这里有以下预订应该注意。195人的GeneMark得分分析大肠杆菌基因(5)表明得分较高的基因比例，表明密码子使用偏倚越高，可能表达水平越高，与平均得分分布相比略有提高对于大肠杆菌相同大小的基因集。因此，准确度也可能略有提高。

短基因

区分短基因和随机ORF是众所周知的困难。为了测试GeneMarkS发现短基因的能力，我们使用476枯草杆菌长度为300nt的基因或更短，如GenBank中所述。该集合的三个子集是根据蛋白质分析结果汇编BLAST的产品(43). 第一个该组包括123个基因，其蛋白产物至少具有与已知蛋白质的一个重要序列相似性（与电子-值<1e–4）。请注意，任何点击到枯草杆菌蛋白质或注释为“假定”或“假设”的蛋白质忽略。第二组包含72个基因，其中至少有两个强基因在蛋白质水平上的相似性。第三组有52个基因，包括这些基因的蛋白产物与已知蛋白质。

精确预测和检测的基因百分比表中引用了每一组中的GeneMarkS4可以看出，精度参数与整体相比，短基因的变化不明显基因集。因此，这些数据证明了基因长度方面的程序性能。

与其他项目的比较

比较GeneMarkS与Glimmer和ORPHEUS的性能我们不得不下载并运行这两个程序。Glimmer 2.02是按照分发文件中的说明运行。注释就基因检测而言，Glimmer 2.02运行使用默认参数检测到的基因明显多于注释的基因两者都适用枯草杆菌和大肠杆菌。虽然其中一些预测可能检测到未注释的真实基因在GenBank中，假设百分比GenBank中遗漏的真实基因数量如此之大。然而，我们没有将Glimmer的默认参数更改为设计决策(7). 得到Glimmer 2.02使用无核糖体结合的精确基因预测能量计算。此功能需要16S rRNA的事先数据给定物种的序列。提供16S rRNA序列每个物种。核糖体结合自由能的选择在Glimmer文档中评论为“不完全测试。”然而，我们观察到Glimmer结果总是启用此功能时得到改进；因此，这个选项是打开。

在运行ORPHEUS之前，非冗余蛋白质数据库是通过合并更新的SWISS-PROT、TrEMBL和PIR数据库创建借助NRDB2软件（W.Gish，未出版材料）。这个ORPHEUS的默认参数设置阻止查找<105的基因nt。然而，在大肠杆菌测试集合以及在短集合中枯草杆菌基因：最短为114nt长。

就整体而言枯草杆菌基因组闪光2.02检测到98.1%的注释基因，而GeneMarkS检测到96.7%，ORPHEUS检测到85%（表4). 反过来，GeneMarkS准确地发现了83.2%的ORPHEUS的基因精确预测了73.9%的基因和Glimmer占62.4%。请注意，GeneMarkS位于中间步骤（步骤4.1，图。1)得出了与Glimmer几乎相同的结果检测到的基因数量（表三). 在这里步骤GeneMark.hmm 2.0使用启发式马尔可夫模型并检测98.1%的注释枯草杆菌基因。尽管如此，GeneMark.hmm 2.0在这一步做出了4316个基因预测Glimmer 2.02做出的5075个预测。

195台经实验验证大肠杆菌基因，GeneMarkS和Glimmer 2.02都检测到了所有的基因（表4). GeneMarkS准确鉴定了94.4%的基因启动，而ORPHEUS和Glimmer 2.02精确预测基因起始位置分别为75.9%和71.3%。

对于短集枯草杆菌基因（as如表所示4)预测人GeneMarkS似乎比Glimmer的更准确。

就基因检测而言，我们又进行了一次利用基因组进行比较测试大肠杆菌和枯草杆菌.我们已经指出了过渡从对大量基因的不太精确的预测到随着GeneMarkS迭代，对较少数量的基因进行更精确的预测进度。这种变化是由于从更敏感而不太具体的启发式进行训练的过程模型更具体，敏感性略低模型。本质上，这种转换给了GeneMarkS更多的功能在失去某些能力的情况下找到典型班级的基因寻找非典型基因。

为了结合启发式模型和伪原生模型的强度，我们在另一次运行GeneMark.hmm时同时使用了这些模型2.0如上所述（见表2). 这个通过此程序设置获得的结果枯草杆菌和大肠杆菌基因组也如图所示4其中比较了GeneMark.hmm 2.0预测，在基因检测方面，用GenBank注释这两个细菌基因组以及Glimmer 2.02的预测。

基序的功能和进化变异性在上游序列中

GeneMarkS为研究序列模式提供了新的机会位于基因启动上游的区域。在许多原核生物中基因组，上游序列携带一个功能位点（即RBS位点）具有两个核苷酸频率基序（图。三A） 以及垫片长度分布（图。三B） 。

有趣的是，GeneMarkS导出了上游信号的模型可能因研究中的基因组和环境而异程序参数的。如下所示，上游序列集可能是不均匀的。通常，如果上游序列集有助于序列基序，通过Gibbs采样的未映射多重比对不太适合派生模式。然而，可能有是一些有趣的模式配置，其中方法仍然作品。下面我们分别讨论分析的细节细菌种类和两类古细菌和克里纳恰奥塔。

在所研究的细菌基因组中，25或50 nt长的上游序列导致提取RBS图案，类似于为枯草杆菌基因组（图。三). 然而，仍有几个担忧。一种是RBS序列在一个基因组。为了探索这种可能性，我们进行了额外的对几个数据集的分析。我们选择了一组基因启动子被同一条链上的前一个基因重叠。请注意4nt的链基因重叠是最常见的基因重叠。我们扫描并表征了上游序列中的六聚体根据RBS主题和背景得出的log-odds分数模型。背景模型是编码的普通马尔可夫模型基因重叠情况下的区域。对于非重叠启动这是一个非编码序列的普通马尔可夫模型。通过识别假定苏格兰皇家银行在50 nt上游地区内得分最高，我们对枯草杆菌,大肠杆菌和M.jannaschii先生基因组。RBS站点的分数分布与前一项重叠编码区与非重叠区相比没有显著差异（图。5). 间隔棒长度分布重叠RBS的确有三个周期（未显示数据），整个间隔棒长度分布完全缺乏（图。三B） 。

作为此分析的扩展，我们导出了集合的RBS基序与重叠基因启动子相关的上游序列。在几个这些基序与衍生基序之间的显著差异观察到非重叠启动。有趣的是，对于结核分枝杆菌基因组RBS基序前一个基因与4nt重叠的基因更加明显而非重叠基因衍生的RBS基序。请注意G+C丰富度结核分枝杆菌基因组使RBS模式难以检测(30,39)。

古生物基因组的GeneMarkS分析结果如下符合转录和翻译的概念古生菌的机械是真核生物和细菌的复杂混合物特性(44). 转录古生菌的形成机制与真核生物有很多相似之处。尤其，基本起始因子TFIIB和TFIID以及八个“小”亚基RNA聚合酶显示出与真核生物对应物的同源性。此外，真核生物TATA-box结合蛋白被证明具有几种古生物中的同源蛋白质。另一方面，细菌和古生菌的翻译起始机制长期以来一直被认为是功能上的不同组件类似，以细菌型多顺反子的加工为中心信使核糖核酸(45). 两者之间的重要区别翻译起始的古代和真核机制真核生物中是否缺少蛋白质的古代同源物mRNA CAP识别。

GeneMarkS应用于几个古生物基因组提取TATA盒或RBS型图案作为模型位于上游序列的保守位置。这个特别的结果显然与第一个操纵子和与操纵子内部基因相关的分离基因。RBS和启动子位点在比对过程中的竞争可以通过简单限制上游长度来排除序列。特别是，长度必须至少为50 nt to检测TATA盒相关模式。对于25 nt长的上游序列非重叠基因的多重比对过程通常会产生RBS类型模式。许多古生物都观察到了这一结果物种，但不是所有物种。

在克里特岛，如A.pernix公司和嗜气芽孢杆菌我们发现了TATA盒是为非重叠基因的上游序列。这一结果得到了证实实验观察到的对无领导抄本的强烈偏见在里面嗜气芽孢杆菌（M.Slupska、A.King、S.Fitz-Gibon、，J.Besemer，M.Borodovsky，J.Miller，出版中）。另一方面，重叠基因样本的上游序列集，据推测，操纵子中的那些内部分子表现出了这个主题与16S rRNA的一部分互补。请注意，对于重叠的基因A.pernix公司，GeneMarkS预测几乎相等启动密码子ATG和GTG的频率，一个有趣的偏差不是在任何其他物种中观察到。另一种Crenarchaeote的基因组序列，硫矿硫化叶菌，之前进行了分析并检测到上游序列中发现的基序的二重性翻译启动的两种不同机制的存在(46)。

类似地，在嗜热亚麻子的上游序列中富氏A.fulgidusGeneMarkS检测到这两种转录和翻译起始相关的主题（图6和7). 尤其是占主导地位的保守派50 nt长上游序列中的基序似乎不是RBS由于其与16S rRNA和位置周围的定位–30（图。8)。这个主题有一个共识[G/a，G/a，A、 A，A，A]，可以被解释为真核生物类型启动子基序。这一结果与获得的结果形成了鲜明对比用于嗜热性欧亚茶素M.jannaschii先生谁的根据GeneMarkS的测定，上游基序对定位在距离基因起点更短的地方（图。8)并被公认为RBS图案与16S rRNA序列互补。

在搜索中的RBS图案富氏A.fulgidus基因组序列，我们对25 nt长的上游序列进行了吉布斯比对重叠的基因更可能存在于操纵子内部。这个富氏A.fulgidus基因组包含相对较大的允许进一步减少集合的基因重叠数仅使用与他们上游的邻居正好减少了4 nt。事实上，吉布斯采样这组上游序列的比对检测到一个带有共识对3′端的补充的富氏A.fulgidus16S rRNA（图。7). 这一发现表明，无领导的成绩单在Crenarcheota中观察到的一些广角海龙物种中也可能存在，而含铅成绩单的比例似乎要高得多。

有趣的是，在最近的NCBI注释中，发现了欧亚海龙类物种热等离子体火山岩(ftp://ncbi.nlm.nih.gov/genemos/细菌/热质_火山/),GeneMarkS程序使用了上游序列的默认长度作为50 nt。我们对运行上游长度为25 nt的GeneMarkS的测试序列长度导致了非常接近的结果，98.4%的基因开始预测在同一位置。

在细菌基因组中，我们观察到吉布斯取样非重叠基因的50nt上游序列比对汇聚成带有RBS图案的路线。这个观察结果提示启动子相关的基序在度比RBS基序。

GeneMarkS在某些情况下产生的结果显示出非同质性带有RBS基序的序列集。我们举例说明的结果枯草杆菌和热自养M基因组在图中9A和B。如果枯草杆菌二六聚体AGGAGG和AGGTGA可以叠加在Gibbs中上游序列的采样多重比对。两种六聚体是对重叠部分的补充枯草杆菌16秒rRNA。六聚体对内部位置有不同的偏好与基因启动有关的mRNA（图。9A） ●●●●。顺便提一下，这些偏好使得16S rRNA的结合将核糖体定位在一个或另一个六聚体上与翻译起始地点的距离。这个解释实验突变的结果也支持了观测数据的翻译起始效率研究(47)。

注意，将上游序列集拆分为两个（或更多）同质子集暗示了一个事实，即整个基因集一个特定物种可以分为两个（或更多）同质物种类，即典型和非典型基因类。还有，更进一步分析没有提供任何明显的证据表明六聚体与基因类型相关（数据未显示）。

对于古生物基因组热自养MGeneMarkS分析导致了对集合非均匀性的类似观察如图所示9B.两个六聚体，GGAGGT和GGTGAT，可以叠加在Gibbs中采样多重对齐。这两种六聚体都是对的重叠部分热自养M16秒rRNA。有趣的是，与枯草杆菌案例，GGTGAT六聚体通常位于较短的距离从基因开始。

网络资源

GeneMarkS可通过互联网访问http://dixie.biology.gatech.edu/GeneMark/基因标记.cgi。输入序列由GeneMarkS分析，最终预测如下通过电子邮件返回给用户。预测数据库由GeneMarkS为许多公开可用的原核基因组制造位于http://dixie.biology.gatech.edu/基因标记/基因标记S/。三组短片枯草杆菌基因强在这个位置可以获得与用于测试的已知基因的同源性以及一套经过实验验证的大肠杆菌基因。