乳腺癌细胞中雌激素受体α靶基因和反应元件的发现

雌激素反应的全球基因表达谱

高密度DNA微阵列是一种强大的工具，可以同时确定数千个基因的转录谱，特别适合于转录因子功能的研究。以前的研究确定MCF-7激素治疗后基因表达谱的变化[21-25,27]和ZR-75-1[26]急诊室⁺乳腺癌细胞株产生了许多新的雌激素反应基因，并证明了这种基因组技术在研究雌激素生物学中的实用性。然而，这些早期的研究只包括在有限的时间点进行抗雌激素和环己酰亚胺（CHX）治疗，或仅在少数假定应答基因的验证分析中进行。因此，为了更全面地绘制由ER调节的转录调控网络，并在额外的ER中生成数据⁺乳腺肿瘤细胞背景下的跨细胞系分析，我们治疗雌激素依赖性T-47D ER⁺含有17β-雌二醇（E2）和E2与纯抗雌激素ICI 182780（ICI）或蛋白合成抑制剂CHX联合的乳腺癌细胞系，并进行了高分辨率的时间进程基因表达分析（见图第1页治疗和时间点）使用斑点寡核苷酸（60-mers）微阵列，其中包含约19000个人类基因的探针。本研究中使用的E2（1 nM）和ICI（10 nM）浓度分别足以驱动和抑制激素反应性细胞增殖。T-47D细胞在核型异常和核受体共调节因子表达水平上与以前使用的细胞系MCF-7和ZR-75-1不同，但具有在更生理水平上表达ER的优势[28,29]. 在激素治疗后的前8小时（0-8小时），每小时采集一次样本，在接下来的16小时（10-24小时），每两小时采集一次样本，总共调查了16个时间点（图第1页).

通过使用双尾配对对E2处理的样本与模拟处理的对照组中的表达比率进行统计分析，确定雌激素应答基因t吨-使用测试第页-价值截止。此外，在三个或更多时间点内，基因在同一方向上的变化至少为1.2倍。我们选择数据选择标准的依据是观察到的已知激素应答和ER靶基因的表达水平和特征，如孕酮受体、组织蛋白酶D和锡酸钙2。E2反应性选择反应基因(第页<0.052）并过滤ICI灵敏度(第页<0.057）和CHX不敏感(第页>0.24）通过比较E2处理样品与E2+ICI和E2+CHX样品，分别分离出推测的ER下游靶点和直接靶点。图1亿总结了选择过程的统计信息。通过Eisen聚类图显示雌激素反应基因的表达谱，并通过层次聚类对基因进行排序[30].

雌激素反应基因（图2a个)，表达谱分为两组：激素治疗上调的基因（图2a个，红色）和那些被下调的（图2a个，绿色）。在应答基因中，58.5%（226/386）在雌激素治疗后上调。图第2页显示了由雌激素受体（ER）特异性调节的137个基因的表达谱（定义为对雌激素有反应并被ICI治疗阻断，图第2页，右侧面板）。这些基因以与雌激素反应基因相似的方式聚集。一项值得注意的发现是，由E2反应和ICI敏感性决定的ER调节基因仅占所有雌激素反应基因的35.5%（137/386），这表明在介导激素暴露的转录反应中可能存在ER依赖性信号转导机制。有趣的是，ICI对E2-上调基因的影响似乎大于下调基因，因为这些上调基因占ICI敏感亚群的71.5%（98/137）。89个主要反应基因构成了推测的ER直接靶点，定义为对激素治疗有反应，对ICI敏感，但不受CHX治疗的影响（图2厘米，右侧面板）。从这些观察结果来看，参与乳腺癌细胞启动激素反应的直接靶基因数量可能仅占人类基因组中基因的0.47%（89/18912）。表中列出了推测的ER靶基因1E2应答基因的完整列表见附加数据文件4。先前显示为ER靶基因的基因以粗体显示（见表1). 我们注意到，我们列表中的五个直接靶基因与唯一一项已发表的微阵列研究中的结果一致，该研究将抗雌激素和CHX治疗作为实验设计的一部分[26]. 这两个数据集之间的差异可能是由于细胞系、实验设计、阵列平台和用于选择靶基因的过滤参数的差异。例如，Soulez和Parker的研究[26]使用仅在两个时间点（6小时和24小时）测试的ZR-75-1细胞。此外，该研究中使用的Affymetrix HuGeneFL阵列包含5600个基因的探针，而我们的阵列上有近19000个基因，代表了具有已知局限性的早期阵列技术。同样，我们的直接靶基因列表中缺少已知的靶基因TFF1/pS2和细胞周期蛋白D1可能是由于T-47D细胞中转录辅因子和基因组异常的差异。c的缺失-MYC公司我们名单上的原癌基因可能是因为我们研究中使用的阵列中没有探针。

为了控制ICI和CHX的混杂直接作用，我们也在不依赖E2的情况下，仅用ICI处理细胞2、8、12或24小时，或仅用CHX处理细胞2或8小时。CHX治疗通过诱导CHX、E2或E2+CHX治疗后可检测到的E2样效应，部分掩盖了89个符合假定直接靶基因选择标准的基因中4个（4.5%）的反应（见附加数据文件5和6）。由于这个结果不排除这些基因作为直接靶点，我们将它们列入直接靶点列表，但在表中注意到了这一警告1在32个E2应答基因中，CHX单独处理与E2处理的效果相反（8.3%；32/386）。然而，在激素和药物同时存在（E2+CHX）的情况下，CHX不会拮抗这些基因的E2反应，因此不会影响假定直接靶点的选择。仅ICI处理就在九个（2.3%；9/386）E2应答基因中引发了意料之外的E2样反应（即E2、ICI或E2+ICI处理后的相同反应）。由于这9个基因不符合ICI拮抗的选择标准，因此推测的直接靶基因也没有受到影响。因此，ICI和CHX的独立效应并没有实质性改变我们分析中的最终基因列表或结论。

T-47D和MCF-7雌激素反应谱的比较

许多乳腺癌细胞系已用于在体外雌激素反应的研究，但大多数数据，包括已发表的微阵列研究，都来自使用MCF-7细胞的实验。因此，我们有兴趣比较我们研究中使用的MCF-7细胞和T-47D细胞对激素治疗反应的表达谱。为了进行分析，我们获得了一个公开的MCF-7激素和三苯氧胺反应数据集[31]来自斯坦福微阵列数据库[32].

使用构建166中的Unigene簇ID作为两个数据集之间的通用标识符，我们从137个T-47D ER调节基因中的104个中提取了表达数据（图3a年)也存在于MCF-7数据集中。对于MCF-7数据中具有多个条目的基因，选择具有最完整数据或与T-47D结果类似表达谱的条目进行分析。总的来说，MCF-7实验的结果对应于T-47D细胞中获得的响应基因的大多数（64%；66/103）表达谱，如激素治疗后MCF-7细胞中可用数据点的相同方向变化所定义（见图3a年). 使用MCF-7 E2反应和三苯氧胺治疗敏感性数据的严格选择标准（见材料和方法），我们在MCF-7和T-47D数据集中发现了24个可被定义为ER调节的基因。值得注意的是，这两项研究之间高度一致，24个基因中有23个（96%）的基因对雌激素的表达反应一致（图第3页). 相反，尽管使用了相似的实验系统和相同的阵列平台，但来自无关干细胞研究的微阵列数据集几乎没有一致性[33]. 这项研究中确定的基因与Frasor及其同事报告的雌激素反应基因之间的许多重叠进一步证实了这些发现（数据未显示）[23]. 我们使用不同的实验设计和阵列平台观察到的两个ER研究之间的相似性表明，这两个ER⁺细胞系具有共同的雌激素反应途径。

乳腺肿瘤中ER调节基因的差异表达

我们希望解决的一个关键问题是在体外细胞系中的观察反映了生物学意义体内为了解决这个问题，我们探索了在我们的在体外乳腺肿瘤标本中ER状态相关表达谱的分析。我们假设ER靶基因在乳腺肿瘤中的差异表达与ER状态相关。例如，在MCF-7细胞中，pS2/TFF1和cyclin D1均被雌激素上调，但在ER中表达水平较高⁺肿瘤[34,35].

许多乳腺癌微阵列研究表明，ER状态仍然是最重要的预后标志物和肿瘤分类器。来自六项乳腺癌微阵列研究的表达数据（L.D.M.、B.M.F.Mow、L.A.V.和E.T.L.，未发表的工作和[36-40])被挖掘出差异表达的基因(第页-值<0.01错误发现率，ER⁺与ER相比^-)与ER状态相关的人类乳腺肿瘤样本。在T-47D研究中确定的137个ER调节基因（E2反应，ICI敏感）中，至少有一项乳腺癌研究中有44个基因存在差异表达（图4). 在3812个符合选择标准的ER状态相关基因中，44个ER调节基因仅占约1%（44/3811）(第页<0.01（在一项或多项研究中），表明雌激素反应途径仅代表乳腺肿瘤中ER状态相关转录组的一小部分。这与Meltzer及其同事之前的观察结果类似[22,39]. 然而，与我们研究中使用的微阵列中这些ER调节基因的频率相比，ER状态相关基因中的ER调节基因似乎显著丰富（1.15%，44/3811 vs 0.72%，137/18912，第页=0.006（通过X平方分析）。

为了比较反应基因和差异表达基因的表达谱，我们绘制了每个基因的平均相对表达率（ER⁺/急诊室^-)乳腺癌研究的所有样本（图4). T-47D细胞中的雌激素反应基因与乳腺肿瘤中差异表达的基因之间存在惊人的一致性（70.5%；31/44）。例如，激素治疗上调了基因（图4，左面板，红色）也在ER中过度表达⁺乳腺肿瘤（图4，右侧面板，红色）。我们注意到雌激素治疗后有一组（29.5%；13/44）基因表现出相反的反应在体外与肿瘤中ER状态相关表达相比。然而，这13个在细胞系和肿瘤数据之间不一致的基因在两个细胞系（T47-D和MCF-7）中是一致的。这表明一些下游通路的调控依赖于环境，这在原发性肿瘤和实验性细胞系之间可能是不同的。综上所述，我们注意到在体外经验证的雌激素反应基因在ER中也有差异表达⁺因此可能具有直接的生物学和临床意义。

ER结合位点的计算建模和预测

先前的研究已经确定DNA中的一致ERE和AP-1-或Sp1-结合位点可能是的靶基序。这表明89个直接反应基因应该在转录控制区内富集这些结合基序。为了进一步探索这一点，我们通过计算提取了候选基因转录起始位点（TSS，见材料和方法部分）侧翼（-3000至+500）的序列，该位点被定义为NCBI RefSeq数据库中参考转录物的最大5'核苷酸，并查询其潜在的ER-binding位点。之所以选择起始位点两侧序列的大小和位置，是因为大多数具有特征的ER-binding位点都已映射到已知靶基因中的这些区域[5].

对于结合位点预测，我们使用了前面描述的ERE模型[41]TRANSFAC数据库中的AP-1和Sp1结合位点位置权重矩阵[42]. 我们还将GATA1转录因子的结合位点作为阴性对照，因为它不参与ER结合。在检测模型训练数据中已知结合位点时，所有被调查位点的模型灵敏度设置为ERE模型的83%灵敏度的既定最佳设置。图5显示了ERE的性能（图5a级)，AP-1（图5亿)，Sp1（图5厘米)和GATA1（图5天)结合位点模型。这个年-每个图的轴表示结合位点预测的相对频率，由具有预测结合位点的基因占查询基因总数的比例决定；这个x个-轴表示每个基因组中被调查的最重要基因的数量，按统计显著性排序（参见材料和方法）。由于短结合位点基序在人类基因组中普遍存在，我们询问与无反应基因相比，在3.5 kb的反应基因上游窗口中是否存在此类反应元件的富集。每个基序的丰富性由假定靶基因结合位点预测相对频率的差异表示（图三，实线）和非应答基因（图三，支离破碎的线条）。对于ERE预测，我们观察到10个最重要的初级反应基因中的推定位点比最无反应的对照组富集了三倍（图3a年)25个和50个最重要的基因分别富集了两倍和大约70%。总的来说，ERE位点在推测的ER直接靶基因中的富集具有统计学意义(第页= 0.0027). 目标基因中假定的Sp1位点的富集程度较低，但未达到统计显著性（10个最重要的目标基因富集12.5%；第页= 0.085). 这是预期的，因为Sp1位点在人类基因组中非常常见，并且在一般转录调控中具有额外功能。我们没有观察到AP-1位点的任何富集(第页=0.66）或阴性对照GATA1位点(第页= 0.51). 这些发现表明，ERE是在全基因组范围内调节ER靶基因特异性调节的主要反应元件。我们还推测，虽然已知Sp1和AP-1结合位点可促进某些靶基因中的内质网功能，但它们并不是一种常见的内质网膜靶基因顺式-人类基因组中的调节元件，至少不足以区分目标基因和非响应基因。

为了确定预测的ERE的保守性和潜在功能，我们还检测了89个假定的人类ER靶基因的小鼠直系同源基因5'上游区域中的相同3.5 kb窗口。从小鼠基因组数据库中提取了72对人-鼠同源基因对[43]以及为潜在ERE划定和分析的调节区域，如人类序列所述（见材料和方法）。然后，我们比较了这两种生物体的ERE预测，以了解以下特征：当两种生物体中预测出多个ERE时，核心ERE半位点（GGTCANNTGACC）在两个最相似的序列之间的保存，不包括侧翼嘌呤碱；预测ERE的5'和3'端侧翼的20个碱基（总共40个碱基）的保守性；以及结合位点序列和TSS之间的距离。

我们的分析统计总结如图所示第6页在鼠-人同源对中，81%（58/72）至少有一个ERE预测，22（31%；22/72）个基因对在两种生物体中都有ERE预测。然而，在人类直接靶基因中，29%（21/72）的小鼠同源基因上游没有ERE。相反，21%（15/72）患有ERE的小鼠基因在其人类同源基因上游没有ERE。在这两种生物体中具有ERE预测的22个基因对中（见图中的维恩图6b条)，只有四个具有核心ERE序列的完美保守性（表2). 这四个完全保守的ERE对在其侧翼序列中也具有最高的保守性（平均同一性=74%），而在结合位点的相对位置上差异最小（平均差异Δd日=469个碱基）。事实上，如果预测的ERE为绿色1（人类，NM_014668号; 鼠标，NM_015764号)其相对位置相差1.7kb，被排除在分析之外。对于核心序列中有一个或多个碱基偏差的ERE鼠-人对，侧翼序列和预测ERE的相对位置几乎没有守恒性（见表2). 这些发现表明，尽管ERE基序在进化过程中是保守的，但在靶基因的5'调控区发现的特定ERE很少保守。他们还表明，人类和啮齿动物在内质网功能的分子机制和靶基因库方面存在潜在差异。有鉴于此，我们根据动物研究结果对人类ER功能的推断可能需要重新评估和额外验证。

染色质免疫沉淀法验证直接内质网靶基因

基因组学和信息学方法使我们能够识别符合ER靶基因传统定义的基因（例如，对E2敏感、对ICI敏感和对CHX不敏感），这些基因在ER中是保守的⁺乳腺癌细胞系和肿瘤样本，并在启动子区域编码推测的ER结合位点。在这些分析之后，两个基因出现在直接靶基因列表的顶部。一个是核受体相互作用蛋白1（NRIP1），也称为受体相互作用蛋白质140（RIP140），最初被鉴定为ER-结合蛋白和受体活性的共同调节蛋白[44,45]. 随后发现它能结合和调节其他核受体的转录活性[46,47]. 先前在MCF-7和ZR75-1细胞中的微阵列实验表明自然保护区1雌激素治疗后转录水平升高，其在抗雌激素和CHX存在下的表达动力学与其他主要反应基因一致[23,24,26]. 在本研究中，我们还确定了自然保护区1作为一个被E2上调的ER靶基因，对ICI治疗敏感，对T-47D细胞中的CHX不敏感。此外，我们在TSS上游约700个碱基处检测到一个保守的完美ERE，这表明存在一个潜在的ER-结合位点，并由激活的受体直接调控。乳腺癌中雌激素调节的另一个直接靶基因1(绿色1)-在MCF-7细胞中雌激素反应基因的消减杂交筛选中鉴定。它没有已知的功能，似乎与序列数据库中的任何其他基因没有显著同源性[48]. 在TSS上游约1.6 kb处发现了完美的ERE绿色1并且预测的ERE在小鼠中也很保守。考虑到这两者自然保护区1和绿色1我们比较了人类、黑猩猩、小鼠和大鼠基因组序列的5'上游区域，以了解预测的调控元件是否在其他鼠和灵长类物种中得到了保护。对于所有被调查的地区，我们发现核心ERE已经被完全保存（图第7页). 此外，预测ERE两侧的序列也高度保守，表明这些区域具有功能性。

为了确定预测ERE作为ER-结合位点的作用，我们使用抗ER抗体进行染色质免疫沉淀（ChIPs）。除了两个保守的ERE外，我们还包括来自TFF1/pS2（阳性对照）和ATP结合盒，亚家族A，成员3(澳大利亚广播公司3)，一个与其他ABC转运体相关的基因，被认为参与细胞脂质转运，是本研究和先前研究确定的推测ER直接靶基因[26]. 正向和反向引物（图7亿)ERE侧翼设计用于在实时PCR实验中特异检测和量化与ER共沉淀的基因组DNA片段。在激素治疗后，与抗GST抗体对照或所有测试引物对的核裂解物的输入基因组DNA相比，我们没有观察到抗ER沉淀物中阴性对照肌动蛋白外显子3区域的显著富集（图第7页c). 相反，使用预测ERE两侧的引物对ChIP产物进行半定量PCR分析（参见材料和方法），结果显示，在没有雌激素和激素治疗后，ER与这些位点结合（参见图第7页c). 此外，雌激素治疗后，这种结合似乎增强了，这表明激活的受体在介导观察到的这些基因的转录调控中发挥了作用。保守ERE的功能自然保护区1和绿色1最近在一项关于人类和小鼠基因组中近一致ERE的研究中也有报道[49].

细胞培养、处理和RNA提取

T-47D和MCF-7细胞保存在37°C添加10%胎牛血清（FCS）（Hyclone）的DMEM/F12（1:1）培养基（Invitrogen）中，并用5%CO缓冲₂对于雌激素治疗，用PBS清洗细胞，并在无酚DMEM/F12培养基中预先培养24小时，培养基中添加0.5%碳过滤FCS（Hyclone）。对于时间过程实验，用1 nM 17β-雌二醇（E2；Sigma-Aldrich）或1 nM E2+10 nM ICI 182，780（Tocris Cookson）处理T-47D细胞在指定的时间内。为了确定主要反应，在开始雌激素治疗之前，用5μg/ml环己酰亚胺（CHX；Sigma-Aldrich）处理细胞30分钟。在规定的时间和相同的浓度下，也使用ICI（2、8、12和24小时）和CHX（2和8小时）单独进行对照处理。为了提取RNA，用PBS清洗细胞，在Trizol（Invitrogen）中溶解，并按照制造商的规定通过额外的酚-氯仿提取步骤收集样品。

基因表达谱的微阵列分析

通过在聚赖氨酸涂层的玻璃载玻片上发现由Sigma-Genosys制造的Compugen 19K人类寡核苷酸库，生成微阵列。每个样本总RNA和人类通用参考RNA（Stratagene）的25微克分别用Cy5-共轭dUTP和Cy3-共轭dUTP-（PerkinElmer）标记，并使用Patrick O.Brown实验室制定的协议与阵列杂交[59]. 使用GenePix4000B扫描仪和GenePix Pro软件（Axon Instruments）获取并处理阵列图像和数据。用两两法测定差异表达基因t吨-在每个时间点对匹配的处理过的样本和模拟处理过的对照进行测试，并在多个时间点进行折叠差截止，如所述，使用艾森聚类和TreeView程序进行聚类和可视化[30]. 推定目标基因的基因本体论来源于Compugen的注释。

乳腺癌和细胞系微阵列数据的Meta分析

对包含已发表和未发表乳腺癌表达数据的数据库进行查询，以获取其表达谱区分ER的基因⁺和ER^-肿瘤。通过计算每个基因的错误发现率，独立分析每个数据集的差异表达基因[60]并设置第页-值过滤器小于或等于0.01。然后将ER状态相关基因与在体外通过UniGene簇ID（构建166）的雌激素反应基因。使用每个具有统计学意义的研究的对数转换平均以平均值为中心的表达值进行可视化。原始在体外MCF-7雌激素反应数据[31]从斯坦福微阵列数据库下载[32]. 这些数据直接与T-47D结果进行比较，或根据以下选择标准选择用于ER调节：首先，在三个时间点中的两个时间点，在同一方向上至少有1.15倍的变化，并且在任何时间点都没有冲突（相反方向）的数据；第二，在两种治疗条件中的其中一种条件下，与三苯氧胺（Tam）联合治疗48小时后，变化方向相反，两种治疗中没有相互矛盾的数据。1.15倍的截止值不同于T-47D数据的1.2倍变化，用于捕获该数据集中已知的E2应答基因。

启动子序列提取与ER结合位点检测

LocusLink和RefSeq[61]美国国家生物技术信息中心（NCBI）的数据库用于识别人类和小鼠基因，并精确定位其在基因组中的位置。选择这些注释是因为它们的全面性、注释基因的数量以及它们与NCBI contig数据库当前状态的一致性。使用TSS（定义为参考转录物中最多的5'核苷酸）和转录物的3'末端作为参考点，我们提取起始位点上游3kb和下游500个碱基用于结合位点分析。NCBI人类基因组序列构建33和小鼠基因组序列构建30用于转录比对和基因组序列提取。由于某些参考序列5'端的信息不完整，在LocusLink和RefSeq中注释的TSS位置可能仅近似于真实起始点，但我们认为用于我们分析的相对较大（3.5 kb）区域允许TSS位置的波动。人类-小鼠同源基因测定基于小鼠基因组数据库中的注释[43]. 所用的四个结合位点位置权重矩阵（PWM）模型要么是在早期研究中推导出来的[41]或从TRANSFAC（6.0版）转录因子结合位点数据库下载[42]. 检测参数是根据Dragon ERE Finder的优化设置设置的[41]以83%的灵敏度检测训练数据，并对其他PWM进行相应设置，使其具有类似的灵敏度。通过蒙特卡罗模拟，在定义的基因集和随机生成的基因集的预测之间，确定假定目标基因和非响应基因之间结合位点富集的统计意义。进行了一组蒙特卡罗模拟，以评估一组雌激素直接靶基因和非响应基因之间假定ERE明显富集的重要性。在每次模拟中，我们随机生成两组基因（大小相当于直接靶基因和非响应基因），绘制相应的曲线，并计算两条曲线下面积的差异。模拟执行了100000000次，模拟中随机区域差异至少与观察到的区域差异一样大的时间分数报告为经验值第页-值。分析中使用的最重要的直接靶基因排名最低第页-E2处理样品和对照样品、E2和E2+ICI样品以及E2和E_2+CHX样品的分析值。无反应基因排名最高第页-来自相同分析的值。

染色质免疫沉淀分析

MCF7细胞被剥夺雌激素24小时，并用100nM E2处理45分钟，然后1%甲醛处理以交联转录机制和染色质。使用ERα（HC-20）或GST抗体（Santa-Cruz Biotechnology）和蛋白A-sepharose珠（Zymed）隔夜进行免疫沉淀。清洗和提取方案根据之前描述的方法进行了修改[62]PCR反应在LightCycler（Roche Diagnostics）实时系统中进行。使用以下引物对沉淀DNA和对照输入DNA进行40个PCR周期：TFF1/pS2ERE：远期CCATGTGGCACGCTAGTC；背面为ACAACAGTGGCTCACGGGT。自然保护区1ERE：转发，TGCTCCTGGGTCCACGTCT；反转TCCCCTTCACCCACAACACACA。绿色1ERE：正向AGCAGTGAAAAAAGTGGCAACTGGG；背面为CGACCCACAGAAAATGAAAAGGCAGACAACT。澳大利亚广播公司3ERE：转发，CACCTTCCATCTGTCCAAAG；背面为CAACCCTGGGTTGGGAAC。肌动蛋白外显子3控制：正向，AGACCTTCAACCCCACACCC；背面为GTCACGCACGGATTCCCGCT。在每次运行结束时，还通过熔化曲线分析来分析扩增产物的特异性。通过建立每个引物集的标准曲线，并使用与输入相似的基因组DNA作为模板，进行相对定量。通过比较抗ER和对照抗GST产物的相对数量来确定ER结合的富集。