突触可塑性中蛋白质磷酸化和去磷酸化的协调^*

通过平衡磷酸化/去磷酸化控制突触强度

哺乳动物大脑的一个决定性方面是它具有丰富的经验依赖性可塑性能力，这种可塑性可以改变神经元之间特定突触连接的强度。长期增强（LTP）是兴奋性突触可塑性的两种截然不同的研究形式²和长期抑郁（LTD），分别加强和削弱突触。LTP和LTD在一个叫做海马体的大脑区域进行了最深入的研究，它们支持空间和陈述性学习和记忆。钙诱导LTP和LTD²⁺通过突触后NMDA-型离子型谷氨酸受体（NMDAR）的内流，分别通过调节兴奋性突触传递的AMPA-型离子性谷氨酸受体功能的长期增加或减少来表达(1,2).

NMDAR是异源四聚体组装体，最常见的是包含两个GluN1和两个GluN2A-2D亚基，并且对Na具有渗透性⁺，K⁺和Ca²⁺在海马突触，NMDAR由GluN1、GluN2A和GluN2B亚单位组装而成。AMPAR是GluA1–GluA4亚基的异源四聚体组装体，大多数仅对Na具有渗透性⁺和K⁺由于含有防止Ca的GluA2亚单位²⁺流入，流入(三). 然而，海马神经元也能表达少量钙²⁺-缺乏GluA2亚单位的可渗透性AMPAR(即GluA1同源体），主要位于突触外和细胞内位置，但在可塑性和神经元损伤后可被突触吸收(4). 有趣的是，LTP和LTD表面上的拮抗过程背后的分子机制有很多共同点；两者都需要相关的突触前和突触后活动，从而产生NMDAR Ca²⁺并由重叠的酶组介导。然而，这是突触检测钙的细微差异的能力²⁺和其他第二信使，并有效地将这些信号转导到离散的下游信号通路，从而允许完全相反的结果产生于极为相似的突触刺激。

最终，兴奋性突触可塑性必须增加、删除或修改AMPAR以改变突触强度。尽管本系列其他地方深入讨论了可塑性期间的AMPAR调节（参见Roche和同事(101))，这里值得一提。简短、强大的NMDAR Ca²⁺内流可以激活一系列激酶，通过磷酸化两个AMPAR来增加LTP期间的AMPAR活性(2,5–7)和其他调节蛋白(5,8,9). 特别是AMPAR-GluA1亚基在几个C末端尾部残基上被磷酸化，以改变通道的生物物理特性和突触定位。例如，Ca²⁺-钙调素依赖性蛋白激酶II（CaMKII）和PKC磷酸化Ser-831和Ser-818上的GluA1（仅PKC），以增加LTP期间的单通道电导和突触结合。GluA1在Ser-845上也被cAMP-依赖性蛋白激酶（PKA）磷酸化，这增加了通道开放概率，并刺激循环胞吐来启动AMPAR，以便在LTP期间进行突触插入（参考文献。5–7). 因此，尽管CaMKII可能是NMDAR Ca最重要的直接转换器²⁺LTP期间的信号传导，多个突触后激酶共同促进增强(图1).

相反，弱但持续的NMDAR Ca可诱发LTD²⁺流入。在这些条件下，蛋白磷酸酶1（PP1）、2A（PP2A）和钙调神经磷酸酶（CaN；也称为PP2B）被激活(10–12) (图1). 因此，在LTD期间，AMPAR和其他突触后靶点的去磷酸化通常受到青睐。特别是，GluA1 Ser-845去磷酸化通过促进内吞和防止再循环以利于受体降解，对LTD期间AMPAR的去除至关重要（参考文献。5–7). 因为它被钙直接活化²⁺CaM、CaN可能是NMDAR Ca最重要、最直接的传感器²⁺LTD期间的信号传导，但其他磷酸酶和激酶，包括CaMKII（下文讨论），也在LTD期间发挥重要作用(图1). 因此，本综述中讨论的一个首要问题是，无处不在的第二信使系统（cAMP和Ca²⁺)以及具有广泛底物特异性（PKA、CaMKII、PP1和CaN）的信号酶在突触处组织，以协调LTP和LTD期间非常特定的局部信号事件？

AKAP79/150对突触后PKA、PKC和钙调神经磷酸酶信号的协调调节

上述问题的重要答案可以在突触后密度（PSD）中的支架相互作用网络中找到，PSD是一种位于突触前末端对面树突棘尖端的结构（另见Spence和Soderling(102)本期更多关于树突棘结构）。PSD网络中的支架蛋白定位信号酶，对第二信使作出反应，并对突触底物产生快速影响。由A激酶锚定蛋白（AKAP）79/150（人类79/150；也称为AKAP5）组装的PKA-PKC-CaN复合体是突触后支架组织信号复合体的典型例子(图2) (13).

第一个特征是通过其C端两亲性α-螺旋结构域结合PKA(14)，AKAP79/150随后被证明能结合CaN(15)通过P的变体X（X）我X（X）其他CaN结合蛋白中发现的IT基序(16–18)和PKC通过其N-末端膜靶向结构域(19). AKAP79/150也作为一个结构脚手架枢纽，因为它结合F-actin(20)、质膜脂质磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸(21)，突触粘附分子(22)和连接NMDAR和AMPAR的PSD-95家族支架蛋白(23). 鉴于AKAP79/150收集锚定酶并与谷氨酸受体相连，因此它在突触可塑性中起着不可或缺的作用也就不足为奇了。事实上，使用AKAP150基因敲除小鼠的实验证明了这种支架在海马LTD和空间学习中的作用(24). 对缺乏PKA锚定位点的AKAP150 C末端截断敲除小鼠的进一步分析表明，AKAP-PKA信号传导促进GluA1 Ser-845磷酸化并支持LTP，LTD和逆转学习(25–27). 此外，利用RNAi进行突变替换的研究(28,29)和一只缺乏P的AKAP150敲入小鼠X（X）我X（X）IT-like CaN对接图案(30)揭示锚定CaN介导GluA1 Ser-845去磷酸化和AMPAR内吞促进LTD和抑制LTP。此外，AKAP-CaN或-PKA锚定的基因破坏改变了空间和情境恐惧学习和记忆。^三最后，尽管AKAP79/150锚定的PKC可以磷酸化异种细胞和培养神经元中的GluA1 Ser-831，但AKAP-PKC锚定在突触可塑性和认知中的作用尚未得到解决(31). 总之，这些研究说明了支架在局部平衡磷酸化和去磷酸化以控制突触可塑性方面发挥的关键作用。

除了定位激酶和磷酸酶外，AKAP还可以结合cAMP信号通路的其他关键成分，包括G蛋白偶联受体、腺苷酸环化酶（AC）和磷酸二酯酶。AKAP79/150与β结合₂-肾上腺素能受体（β₂AR）(32)和多种AC亚型(33,34). β₂AR与AC-cAMP-PKA信号耦合，通过GluA1磷酸化增强LTP和学习记忆(35,36). 在一系列优雅的实验中，比较AKAP150敲除小鼠和AKAP150-PKA结合缺陷小鼠，AKAP敲除小鼠在β₂AR增强GluA1 Ser-845磷酸化和LTP(37). PKA结合缺陷小鼠较不严重的表型归因于与AC保持相互作用，导致β₂AR-刺激的cAMP生产可能通过其他PKA池发出信号，尽管效果较差。值得注意的是，AKAP250/Gravin（也称为AKAP12）也可以与β₂AR促进LTP监管(38). 因此，这两种AKAP-PKA复合物在突触后LTP调节中可能存在相互作用。有趣的是，在上述许多研究中，发现AKAP79/150锚定的PKA和CaN通过优先控制GluA1 Ca影响LTP/LTD²⁺-可能是因为这些GluA1同源单体可以在四个Ser-845位点磷酸化，而GluA1/2异构体中只有两个位点磷酸化(26,30,37).

由于其微米大小，树突棘本身是用于分隔信号的微域，但很明显，AKAP79/150和其他PSD支架蛋白形成了在分子/纳米尺度上起作用的突触后信号复合物。这种脊髓内纳米域信号可能发生在PSD的受体附近、脊椎质膜的突触外区域或脊椎放大的内体中。AKAP79/150也是突触后纳米靶向的一个很好的例子，因为其自身的定位是通过棕榈酰酰基转移酶DHHC2对其N-末端靶向结构域的可逆棕榈酰化来微调的(39,40). AKAP79/150棕榈酰化对于一般靶向质膜来说不是必需的，但对于质膜脂筏（与PSD相关）的特异定位和再循环内体来说是必需的(40,41). 重要的是，在化学LTP诱导期间，内体中的AKAP79/150棕榈酰化是刺激循环胞吐和AKAP和GluA1传递到突触所必需的(39,40). 然而，总的来说，我们对AKAP79/150和其他突触后支架的贩运的理解落后于我们对它们控制的AMPAR贩运的理解。我们确实知道，在化学LTD诱导过程中，AKAP79/150可以与PSD-95支架解偶联，并通过去棕榈酰化的组合抑制其N-末端靶向相互作用，从突触后膜和内体中去除(39)磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸的磷脂酶C裂解，以及依赖CaN的F-actin重组。重要的是，在LTD过程中对AKAP79/150膜靶向的这种抑制可能会阻止PKA介导的GluA1的再磷酸化，这将促进循环并逆转LTD（参考文献。13). 有趣的是，AKAP79/150突触定位、PKA和CaN信号以及GluA1 Ser-845磷酸化的变化最近也被牵涉到调节GluA1突触定位，动态平衡形式的突触可塑性，可在所有输入中上调或下调突触强度，以响应整体神经元活动的慢性增加或减少(42,43).

突触后CaMKII信号的调节

CaMKII是由α、β、γ和δ亚型组装而成的十二元全酶。在大多数神经元中，CaMKII含有α>βγ/δ亚型。由于其在突触处的富集和钙的机制²⁺调节，CaMKII（尤其是α）在突触可塑性领域引起了广泛关注(44–46). 对钙的反应²⁺海拔，Ca²⁺-与CaMKII结合的CaM取代了自身抑制域，以允许外源底物和相邻Ca自身抑制域中Thr-286（β，γ，δ上的Thr-287）的活性位点进入²⁺-CaM-结合亚单位。Thr-286的自磷酸化以两种方式修饰CaMKII功能：它增强Ca²⁺-CaM结合亲和力（即所谓的CaM陷阱）并阻止自身抑制结构域完全占据活性位点，产生所谓的CaMKII“自主性”，其中激酶在CaM解离后保持部分活性。重要的是，CaMKII自主性作为过去Ca的“分子记忆”的一种形式发挥作用²⁺在LTP诱导和学习记忆中起着至关重要的作用(47,48). CaMKII Thr-286可以被PP1或PP2A去磷酸化，但PP1似乎在PSD中CaMKIL的去磷酸化中起着更显著的作用(49). 在强烈的突触刺激后，更多的CaMKII也迅速被招募到PSD(50–53)，其中不仅磷酸化AMPAR及其辅助亚单位(8,9)也包括小型GTPase调节器(54,55)和粘附分子(56). 有这么多重要的靶点，CaMKII突触后信号是如何控制的？因为有很多关于这个主题的综合评论(44–46)，这里我们将主要关注控制CaMKII信号的特定突触后支架相互作用(图2).

CaMKII全酶结构允许CaMKIα和β亚基通过共同和不同的相互作用蛋白相互作为支架。F-actin结合是一种明显受β控制的相互作用与α亚单位。CaMKII可以通过适配器蛋白α-肌动蛋白间接与F-肌动蛋白结合(57)但也可以通过其β亚型直接结合F-actin(58–61). 钙激活后²⁺-CaM，CaMKIIβ从F-actin中解离，使激酶重新分布并建立新的相互作用。特别是，CaMKII活化促进与PSD支架密度-180的结合；然而，由于致密蛋白-180也与α-肌动蛋白结合，因此产生了一种三元复合物，它仍然可以与F-肌动蛋白连接，但也可以通过CaMKII与Glu22B亚基的结合进一步与NMDARs结合(57,62,63). 然而，更为复杂的是，CaMKII与GluN1亚单位之间存在二次相互作用，而α-肌动蛋白结合GluN1反而抑制了这种相互作用(64). 重要的是，CaMKII和F-actin相互作用；CaMKII是通过与F-肌动蛋白的相互作用来定位的，但反过来可以通过其β亚型在Ca中直接捆绑和稳定肌动蛋白纤维²⁺-CaM调节方式(59–61). 的确，CaMKIIβ对肌动蛋白细胞骨架的完整性很重要，其丢失会破坏脊椎的稳定性(61). 有趣的是，CaMKIIβ缺失对脊柱的这种影响可以用激酶失活突变体来挽救，这突出了CaMKII作为结构支架的功能。通过比较CaMKIIβ基因敲除小鼠和表达激酶敏感性CaMKIβ基因的小鼠的表型，进一步证实了这种激酶依赖性作用的重要性(65). 尽管CaMKIIβ基因敲除会损害CaMKI突触定位、LTP和学习，但这些功能都不会被激酶活性突变所破坏。

如上所述，另一个关键的CaMKII突触后相互作用是与NMDAR GluN2B亚单位的相互作用，该亚单位在CaMKIII磷酸化位点Ser-1303附近的C末端尾部包含一个结合位点(66–69). 激活的CaMKII在Ca后迅速向GluN2B募集²⁺刺激，但像Thr-286磷酸化一样，持续Ca²⁺信号，从而允许突触后CaMKII参与另一种形式的“分子记忆”。事实上，CaMKI与GluN2B的结合与LTP维持和记忆巩固有关。在一项研究中，发现高剂量的抑制肽（tatCN21）与GluN2B竞争CaMKII结合，会严重破坏GluN2B-CaMKIII结合和LTP维持(70). 在第二项研究中，CaMKII结合缺陷的GluN2B敲除小鼠表现出GluA1 Ser-831磷酸化、LTP和记忆巩固的降低(71). 总之，这些发现支持了一个模型，在该模型中，CaMKII的酶和非酶功能可以协同工作，在兴奋性突触处处理和存储信息。

大量证据表明CaMKII在LTP中的作用，但越来越多的证据表明它也参与LTD(72). 有趣的是，GluA1中一个新表征的Ser-567磷酸化位点导致AMPAR突触排斥(73)，最近被证明在NMDAR LTD条件下被自主CaMKII磷酸化(72). 此外，与LTP中涉及的典型CaMKII底物相比，GluA1 Ser-567表现出明显的特征(即Ser-831）在该Ca中²⁺-CaM刺激不会使Ser-567磷酸化水平高于自主CaMKII获得的水平。因此，一个有趣的新假设是，有两类CaMKII底物受刺激物的差异调节与自主激酶活性分别有利于LTP或LTD。这些最近的发现也为过于简化的规则提供了一个明显的例外，即激酶介导突触增强，磷脂酶介导突触素抑制。

突触后PP1信号的调节

理解可塑性的另一个挑战是，突触的变化往往是通过多种平行和重叠的信号通路来控制的，如CaN、PP1和PP2A磷酸酶，它们都参与LTD(10–12). 与AKAP79/150对CaN信号的控制一样，PP1和PP2A信号也严重依赖于结合伙伴来调节活性和亚细胞靶向性，但由于对LTD期间PP2A的信号调节知之甚少，因此我们将仅讨论PP1。在突触后PP1调节蛋白中最突出的是相关的F-肌动蛋白结合蛋白neurabin-1(图2)和嗜棘蛋白（也称为神经纤维蛋白-2），通过具有松散一致序列（K/R）（V/I）的模块化结合基序来锚定PP1X（X）（F/W），通常缩写为RVX（X）F类(74). 重要的是，使用竞争性RV破坏PP1和神经氨酸酶/嗜酸性粒细胞蛋白之间的相互作用X（X）F结合基序肽能阻断LTD(75). 此外，通过突变对neurabin-PP1关联的特异性干扰抑制LTD，而野生型neurabin-1的过度表达增强LTD并促进GluA1 Ser-845和Ser-831的去磷酸化(76,77). 总的来说，这些发现支持了一个模型，即neurabin-1在LTD期间招募PP1到突触以促进AMPAR去磷酸化。

因此，另一个关键问题是，当PP1酶活性与神经氨酸等支架复合时，突触活性是如何调节的？历史上，海马LTD期间PP1的NMDAR激活模型暗示了CaN介导的PP1抑制性PKA底物抑制剂-1（I-1）的去磷酸化(10). 此外，神经氨酸酶1的PKA磷酸化可以抑制其PP1结合，这是一种可能有利于LTP的机制(76,78). 然而，最近NMDAR信号中的几个其他PP1调节机制受到了关注，包括PP1与抑制剂-2（I-2）的结合，可能在与神经大麻素-1的三元复合物中，以及Thr-320上的PP1抑制性磷酸化。特别是，最近的工作确定了细胞周期素依赖性激酶5（CDK5）是PP1 Thr-320的激酶，并证明当CDK5通过其p35亚单位的蛋白酶体降解被突触NMDAR激活所抑制时，PP1自身磷酸化物变得活跃(79). 这项研究还揭示了PP1与I-2结合的需求，I-2 Thr-72去磷酸化增加了PP1的结合，以促进NMDAR LTD期间的PP1信号传导；该机制与PP1通过Thr-35去磷酸化与I-1结合的逆转形成对比。总之，这些研究表明一个激酶（CDK5）和多个PP1结合蛋白共同调节突触后PP1的活性(图2). 有趣的是，最近的另一项研究发现，PP1也是稳态突触降尺度所必需的，但在这种情况下，PP1通过肌球蛋白轻链激酶的Ser-43磷酸化从I-2抑制中释放出来而被激活(80).

协同激酶和磷酸酶信号在突触后兴奋-转录偶联中的作用

持续数小时、数天、数月甚至数年的持久可塑性形式，如LTP晚期，不仅需要LTP早期AMPAR突触定位的初始变化，还需要随后的基因转录(81)和蛋白质合成（由Alvarez-Castelao和Schuman报道(103)本期）。将神经元活性的急性变化与基因转录的持续变化联系起来的几种途径依赖于局部钙²⁺通过电压门控L型钙通道（LTCC）流入，触发转录因子的磷酸化或去磷酸化，如钙²⁺/cAMP反应元件结合蛋白（CREB）、CREB调节的转录辅活化因子（CRTC1）和活化T细胞核因子（NFAT）(82–84). 特别是LTCC Ca的特权角色²⁺在与LTP/LTD和长期记忆相关的神经元兴奋-转录（E-T）耦合中向CREB发出信号已经被认识了近25年(85–88).

CREB自身的转录激活功能可以通过多种激酶（包括PKA、CaMKs和ERK）对Ser-133进行磷酸化来控制(81). 然而，E-T偶联的研究揭示了激酶和磷酸酶在激活CREB依赖性转录中的重要作用。在多种类型的神经元中，LTCC激活CaN和CaMKII，它们在调节CREB介导的转录中可能起到相反或合作的作用(83,89,90). 然而，最近对交感和皮层神经元的研究发现，LTCC Ca²⁺内流将CaMKIIβ招募到CaMKIγ自身抑制区的反磷酸化Thr-287通道中，并促进Ca²⁺-CaM捕获，而CaN的伴随激活在CaMKIIγ的核定位序列中使Ser-334去磷酸化。随后的CaMKIIγ易位和CaM穿梭到细胞核，然后激活CaMK激酶（CaMKK）和CaMKIV磷酸化CREB(91). 有趣的是，CaMKIIγ的一个激酶活性突变体能够向CREB发出信号，从而为CaM穿梭提供额外的支持，而不是CaMKIIIγ的酶作用。因此，CaMKIIγ在两个关键位点的磷酸化调节使其能够将CaM穿梭到细胞核并诱导基因转录。然而，CaMKIIγ磷酸化状态和CaM结合的变化是如何被精确调节到仅在通道处加载CaM，然后在细胞核中释放CaM的分子细节有待进一步研究。此外，根据这种机制，只有完全由γ亚型组成的CaMKII全酶才能进入细胞核(图3); 否则，很难排除与CaMKIIγ联合进入细胞核的酶活性CaMKIβ产生的额外信号。

上述CaMKII-CaMKIV信号机制也可能仅对兴奋后CREB激活的初始快速阶段（秒至分钟）起作用，其中Ca²⁺不仅在LTCC附近增加，而且在全球范围内增加，以保持Ca²⁺-将CaM一直结合到细胞核。相比之下，局部LTP诱导和钙限制导致CREB激活时间延长（分钟到小时）²⁺树突内流被认为是由ERK通路的局部突触后CaMKII激活介导的，随后是ERK信号从树突到细胞核的较慢、较长距离的易位，以磷酸化CREB(87,92,93). 此外，CREB共激活物CRTC1被CaN去磷酸化，以响应LTCC Ca²⁺突触输入到树突触发的内流，然后缓慢地向远端转移到细胞核，在那里CREB依赖的基因表达是恐惧记忆的基础(83,94). 因此，尽管CREB E-T耦合中的许多关键因素已经确定，但未来的工作必须进一步探索细胞和突触组织的机制，以允许在这些不同的距离和时间尺度上向CREB发送信号。

在一个平行的E-T耦合系统中，关于突触后组织对核信号传递的贡献已经有了更多的研究，该系统是NFAT在短暂的局部LTCC Ca后转位到细胞核（超过几分钟到一小时）²⁺神经元大量涌入。过去十年的研究揭示了AKAP79/150有组织信号复合物在PKA/CaN双向调节神经元LTCC活性和NFAT介导的E-T偶联中的复杂性和重要性(图3) (18,95,96). AKAP79/150直接结合LTCC Ca_V（V）1.2通过C端亮氨酸拉链并通过P锚定CaNX（X）我X（X）与NFAT转录因子自身中发现的CaN对接序列非常相似的IT-like基序(17). 然而，尽管在本质上与NFAT竞争CaN结合并抑制PKA介导的LTCC活性增强，AKAP79/150-CaN锚定对LTCC Ca激活NFAT至关重要²⁺流入，流入(18,95). AKAP究竟是如何促进LTCC-CaN-NFAT信号传导的？在AKAP-CaN复合物晶体结构的指导下，PX（X）我X（X）令人惊讶的是，设计用于增加或减少CaN锚定亲和力的IT-like基序均被发现抑制NFAT激活。特别是，增加锚定亲和力将CaN固定在脊椎中，并阻止NFAT移位到细胞核(97). 因此，AKAP-CaN锚定必然是动态的，并通过平衡其上游激活物LTCC附近CaN的强烈补充与其有效释放以与其下游效应器NFAT通信来促进NFAT信号传递。

基于局部信号复合物的动态和平衡这一主题，其他研究发现，AKAP79/150-PKA锚定的破坏，通过急性过度表达和PKA锚定缺陷突变体的敲除，也可以阻止NFAT信号传导，这是一种可归因于基础LTCC磷酸化深度降低的缺陷，电流密度和去极化诱发Ca²⁺流入，流入(98,99). 因此，神经元LTCC-NFAT转录信号需要精确组织和平衡通道纳米环境中CaN的磷酸酶活性（NFAT激活所需）与PKA的相反激酶活性（防止CaN抑制通道功能所需）。重要的是，这些对AKAP79/150的研究提供了一些迄今为止最完整和详细的分子机制，解释了局部Ca²⁺LTCC信号在神经元E-T偶联中起着特殊的作用。

结论和未来方向

显然，突触后激酶/磷酸酶信号平衡是在多个时间尺度上调节突触可塑性的关键，通过控制局限于突触的局部信号转导以及与细胞核的远端通讯。在所有情况下，所需的高度信号特异性和效率都是由调节性结合伙伴/支架赋予的，在确定对突触功能的影响时，它们与激酶和磷酸酶本身的活动一样重要。事实上，不同甚至相反类型的可塑性可能涉及相同的激酶和磷酸酶参与者，但这些参与者的行动似乎是通过支架相互作用指向一种或另一种途径，以实现不同的结果。未来的研究应进一步阐明支架蛋白如何通过使用新的超分辨率显微镜方法在纳米尺度上询问信号复合物，在这种局部、突触后决策中发挥关键作用(100). 此外，进一步探索支架定向磷酸化如何通过其他可逆的翻译后修饰（如棕榈酰化和泛素化）与信号传导相互交叉也很重要(6)（另见阿尔瓦雷兹·卡斯特劳和舒曼(103)本期）。最后，鉴于许多神经精神和神经疾病的特点是突触可塑性的改变，更好地了解突触处激酶/磷酸酶信号通路的组织方式，有望找到治疗脑疾病的新药物靶点和疗法。与使用现有药理学全局抑制激酶和磷酸酶催化活性相比，精确靶向突触支架相互作用在提高疗效和特异性方面可能具有许多优势。