摘要
代谢途径重新编程是癌细胞生长和存活的标志,支持这些快速分裂细胞的合成代谢和能量需求。 肿瘤代谢程序的潜在调节器尚未完全了解; 然而,这些因素有可能成为癌症治疗的靶点。 在此,我们确定致癌转录协同调节类固醇受体辅活化因子2(SRC-2)的上调,也被称为NCOA2,驱动谷氨酰胺依赖的从头脂肪生成,支持肿瘤细胞存活和最终转移。 SRC-2在多种肿瘤中高度升高,尤其是在前列腺癌中,其中37%的转移性肿瘤中SRC-2扩增并过度表达。 在前列腺癌细胞中,SRC-2通过逆行TCA循环刺激α-酮戊二酸的还原羧化生成柠檬酸盐,促进脂肪生成和谷氨酰胺代谢的重编程。 谷氨酰胺介导的营养信号通过mTORC1依赖性磷酸化激活SRC-2,然后通过共同激活SREBP-1触发下游转录反应,进而增强脂肪酶的表达。 与局限性肿瘤相比,人类前列腺肿瘤的代谢谱发现转移性肿瘤中SRC-2驱动的代谢特征显著增加,这进一步表明SRC-2是癌症转移的重要代谢协调器。 此外,SRC-2在小鼠模型中的抑制严重削弱了前列腺癌的生存、生长和转移。 总之,这些结果表明SRC-2途径有潜力成为前列腺癌的治疗靶点。
介绍
肿瘤会清除合成生物分子所需的碳和氮源的各种营养物质,以支持其快速分裂细胞的生长和复制。 营养物质的可利用性在肿瘤代谢途径的重新编程中起着关键作用,以维持能量和合成代谢需求的增加。 在不同类型的肿瘤细胞中观察到的常见代谢适应之一是葡萄糖摄取增加和有氧糖酵解,同时氧化代谢降低,这一现象被广泛称为Warburg效应( 1 ). 然而,有充分的证据表明,肿瘤细胞并不依赖于单一的代谢状态,而是获得了多种策略来适应疾病进展过程中营养物质可用性和代谢应激条件的变化( 2 , 三 ). 最近的研究使用 13 碳同位素已确定肿瘤细胞谷氨酰胺代谢的互补开关,以有效支持碳利用以促进合成代谢和生长( 4 , 5 ). 谷氨酰胺代谢途径是碳原子补足的关键来源,以平衡通过TCA循环的代谢流量,并支持核苷酸和脂质等大分子的生物合成增加,以及线粒体ATP的合成( 6 , 7 ).
与其他实体瘤不同,前列腺腺癌显示出非常独特的代谢特征,因为大多数原发肿瘤没有典型的“糖酵解开关”,因此在[ 18 F] 氟脱氧葡萄糖-PET([ 18 F] FDG-PET)( 8 ). 相反,新生脂肪生成异常增加( 9 )再加上葡萄糖和谷氨酰胺代谢( 10 )在早期临床阶段的前列腺肿瘤中,与不良预后和不良疾病结局显著相关( 11 ). 脂质作为膜生物发生的基石、膜结构的磷脂、细胞信号传递的脂筏,以及更重要的能量生产和储存,对肿瘤生物学的各个方面都有贡献( 12 ). 虽然大多数正常人细胞更喜欢外源性脂肪酸,但肿瘤细胞更依赖从头合成脂肪酸( 12 )尤其是前列腺癌细胞。 因此,最重要的是确定致癌因子,这些致癌因子可以重新编程代谢途径,从而维持前列腺肿瘤中这种增加的脂肪生成程序。
我们实验室先前的研究结果确定了类固醇受体辅活化因子2(SRC-2,也称为NCOA2、TIF2和GRIP1),它是核受体(NRs)和其他转录因子的一种有效转录辅调节因子( 13 )作为能量平衡的关键协调人( 14 – 17 ). 重要的是,最近对人类前列腺肿瘤进行综合基因组分析的结果表明 SRC2公司 在大约8%的原发性肿瘤中是一个有效的癌基因,尤其是在大约37%的转移性前列腺肿瘤中( 18 ). 此外,前列腺癌患者 SRC2公司 基因扩增或过度表达有较高的生化复发率,SRC-2表达是时间-生化复发的重要预测因子( 19 ). 这些发现强调了 SRC2公司 前列腺癌病理学中的基因( 20 ). 在功能上,SRC-2作为雄激素受体(AR)的转录协同调节器( 19 )前列腺癌细胞; 然而,其在侵袭性转移性去势耐受性前列腺癌(CRPC)中的作用方式尚不清楚。 此外,没有一项研究调查SRC-2在癌症代谢中的功能作用,也没有确定SRC-2的这种最近但明确的关联是否是前列腺癌细胞生存和转移的关键要求( 18 ). 在本研究中,我们试图确定SRC-2作为肿瘤代谢转录调节剂的分子功能,预期这些SRC-2依赖性功能可以作为生存和转移能力的分子决定因素。
结果
SRC-2通过还原性谷氨酰胺代谢调节脂肪生成。
Ncoa2号机组 小鼠的基因缺失研究揭示了严重的代谢缺陷,特别是在脂肪积累和能量平衡方面( 14 – 16 , 21 , 22 ). 由于前列腺癌患者对脂肪酸的依赖性增加( 23 ),我们首先探讨了SRC-2在前列腺癌脂肪生成中的作用。 为了评估这一点,我们在3种前列腺癌细胞系中使用2种不同的shRNA克隆(sh18和sh19)稳定地削弱了SRC-2的表达:LNCaP( 补充图1、A和B ; 本文的在线补充材料; 数字对象标识: 10.1172/JCI76029DS1号文件 )雄激素依赖细胞系; C4-2型( 图1A 和 补充图1B )是一种雄激素依赖但有反应的LNCaP变体,代表去势耐受亚型( 24 , 25 ); 和PC-3( 补充图1、B和C ),一种代表侵袭性前列腺肿瘤的AR阴性高转移线。 油红O染色显示前列腺癌细胞SRC-2敲除导致脂质积聚显著减少( 图1,B 和C,和 补充图1D )目标代谢组分析发现饱和脂肪酸(棕榈酸和硬脂酸)含量显著降低( 图1、D和E )和不饱和(棕榈油酸和油酸),在总细胞代谢物池中( 图1,F和G ). 由于葡萄糖氧化和谷氨酰胺代谢是脂肪酸合成的两个主要碳源,我们比较了前列腺癌细胞中葡萄糖和谷氨酰胺的相对利用率。 与LNCaP细胞相比,C4-2和PC-3细胞的谷氨酰胺消耗量更高,SRC-2消融显著降低了这些细胞中的谷氨酰胺利用率,但LNCaP细胞中没有( 补充图2A ). SRC-2基因敲除也显示出葡萄糖消耗量的改变,尽管变化很小( 补充图2B )与谷氨酰胺利用率相比( 补充图2A ).
图1。 SRC-2主要从谷氨酰胺来源促进前列腺肿瘤细胞的脂肪生成。
( A类 )Western blot显示SRC-2和肌动蛋白在稳定表达shNT的C4-2细胞和2个不同克隆的SRC-2 shRNA(sh18和sh19)中的表达。 肌动蛋白用于使蛋白质负荷正常化。 完整的未切割凝胶如补充材料所示。 ( B类 )稳定C4-2细胞shNT、sh18和sh19的油红O染色显示细胞的中性脂质含量。 用核标记物DAPI对细胞进行复染,合并图像显示在右侧面板中。 比例尺:10μm。 ( C类 )通过测量提取染料的吸光度(490nm处的OD)定量分析油红O染色( n个 = 4). ( D类 – G公司 )基于MS的靶向代谢组学分析显示了用对照siRNA(siGFP)或2种不同SRC-2 siRNA(siSRC-2#1和siSRC-2#2)处理的C4-2细胞中棕榈酸、硬脂酸、棕榈油酸和油酸的相对含量( n个 =4/组)。 数据表示为平均值±SEM** P(P) <0.001学生 t吨 测试与shNT或siGFP。
为了了解SRC-2丢失所影响的生化步骤,我们培养了C4-2细胞 13 C-标记葡萄糖和谷氨酰胺同位素作为示踪剂,然后采用串联质谱(MS/MS)测量 13 细胞内代谢物中的C示踪物。 在均匀标记的D[U存在下培养的C4-2细胞- 13 C类 6 ]葡萄糖显示葡萄糖富集 13 丙酮酸中的C,表明糖酵解途径是活跃的( 补充图2C )但TCA代谢物如柠檬酸盐、α-酮戊二酸盐和草酸盐未能显示出明显的葡萄糖掺入 13 C类( 补充图2C ). 同样,脂肪酸对葡萄糖的富集程度很低 13 C公司( 补充图2D )表明C4-2细胞中进入TCA循环的葡萄糖碳流量减少。 相反,统一标记为[U- 13 C] 谷氨酰胺示踪剂显示 13 TCA代谢产物中的C同位素和SRC-2的损失显著降低了谷氨酰胺来源的总百分比 13 C在柠檬酸盐、异柠檬酸盐和α-酮戊二酸盐中的掺入( 补充图3,A–C ). 谷氨酰胺(5个碳)可以通过氧化代谢或还原羧基化生成柠檬酸盐,从而将碳转化为柠檬酸盐(6个碳)( 4 , 5 , 26 ). 后一个反应需要向谷氨酰胺衍生的α-酮戊二酸盐(5个碳)中添加一个未标记的碳,生成柠檬酸盐m+5(其中“m”表示标称质量;m+5表示柠檬酸盐含有从[U- 13 C] 谷氨酰胺)。 对柠檬酸盐等位异构体的分析显示,SRC-2表达的缺失显著降低了柠檬酸盐m+5水平,对柠檬酸盐m+4水平的影响最小(由氧化TCA产生)( 图2A )表明SRC-2调节还原羧基化途径。 支持这一观察,我们发现SRC-2缺失的C4-2细胞中苹果酸和富马酸m+3水平降低,这些细胞是柠檬酸m+5的衍生物,支持SRC-2在还原性谷氨酰胺代谢中的作用( 补充图3D ). 此外,[1- 13 C] 谷氨酰胺标记可以更准确地测量α-酮戊二酸盐到柠檬酸盐的还原羧基化,因为这种碳在氧化途径中被α-酮脱氢酶以二氧化碳的形式损失,但如果还原羧化是活跃的,则会被保留( 27 ). 通过培养稳定的C4-2细胞补充[1- 13 C] 谷氨酰胺作为示踪剂,我们发现柠檬酸m+1在表达非靶向shRNA(shNT)的对照细胞中富集,而SRC-2的消融显示柠檬酸m+1%显著下降( 图2B ). 此外,SRC-2基因敲除也降低了α-酮戊二酸m+1的水平( 图2C )证实SRC-2调节谷氨酰胺的碳流量,促进前列腺癌细胞中α-酮戊二酸的还原羧基化。
图2。 SRC-2通过还原性谷氨酰胺代谢促进脂肪生成。
( A类 )从2 mM L-[U存在下培养的稳定C4-2细胞shNT(非靶向)和SRC-2 shRNA克隆sh18和sh19中提取的柠檬酸的质量同位素分布- 13 C] 谷氨酰胺和11 mM未标记葡萄糖24小时( n个 = 6). * P(P) <0.05和** P(P) 通过Tukey多重比较测试的双向方差分析得出<0.001。 ( B类 和 C类 )柠檬酸和α-酮戊二酸(α-KG)标记自[1- 13 C] 谷氨酰胺([1- 13 C] gln)在稳定的C4-2细胞shNT和sh19中( n个 = 3). ( D类 )[5中硬脂酸盐标记的质量同位素分布- 13 C] 谷氨酰胺([5]- 13 C] gln)在稳定的C4-2细胞shNT和sh19中( n个 = 3). 本研究中使用的质谱法未能检测到高级脂肪酸等位异构体* P(P) <0.05(学生) t吨 使用Holm-Sidak多重比较测试。 ( 电子 )qRT-PCR分析 FASN公司 , SCD公司 、和 SRC2公司 稳定C4-2细胞shNT、sh18和sh19中的基因表达( n个 = 4). 相对mRNA表达归一化为肌动蛋白(管家基因)。 ( F类 )qRT-PCR分析 FASN公司 , SCD公司 、和 SRC2公司 表达GFP(Adv GFP)和SRC-2(Adv SRC-2)腺病毒的C4-2细胞中的基因表达( n个 = 3). 相对mRNA表达归一化为肌动蛋白(管家基因)。 ( G公司 )稳定C4-2细胞shNT、sh18和sh19以及表达GFP腺病毒或SRC-2腺病毒的C4-2细胞中FASN、SCD和SRC-2的Western blot分析( n个 = 3). 肌动蛋白用于使蛋白质负荷正常化。 完整的未切割凝胶如补充材料所示。 数据表示为平均值±SEM* P(P) <0.05和** P(P) <0.001学生 t吨 测试( B类 – F类 ).
接下来,我们研究了谷氨酰胺衍生的α-酮戊二酸的还原羧基化对脂肪生成的贡献。 为了追踪这一点,我们用[5]标记稳定的C4-2细胞- 13 C] 谷氨酰胺示踪剂,因为- 13 C] 谷氨酰胺衍生同位素标记不能通过还原羧基化并入乙酰辅酶A。 [5- 13 C] 谷氨酰胺只能转移一种 13 C原子通过还原羧基化作用转化为乙酰-CoA和脂肪酸,但失去 13 C通过氧化途径并入乙酰-CoA碳骨架。 因此,[5- 13 C] 谷氨酰胺是追踪还原羧基化到脂质通量的特异性物质( 28 ). 用[5标记C4-2细胞- 13 C] 谷氨酰胺表明,还原羧基化有助于碳从谷氨酰胺流向脂肪酸,SRC-2的损失显著降低了硬脂酸等脂肪酸的质量同位素分布( 图2D )棕榈酸酯和油酸盐( 补充图3、E和F ). 这些发现表明,谷氨酰胺通过还原羧基化作用促进前列腺癌细胞的从头开始脂肪生成,而SRC-2在调节这一过程中起着关键作用。
转录重编程支持脂肪生成。
为了了解前列腺癌细胞中SRC-2依赖性脂肪生成的机制,我们通过定量实时PCR(qRT-PCR)对参与糖脂代谢、TCA循环和谷氨酰胺代谢的酶(源自KEGG)进行了靶向基因表达分析。 SRC-2缺失对代谢基因的表达有广泛影响,其中2个基因-脂肪酸合成酶( FASN公司 )和硬脂酰辅酶A去饱和酶( SCD公司 )-在SRC-2沉默后显著降低( 补充表1 ). FASN是一种多功能酶,可以催化乙酰辅酶a和丙二酰辅酶a合成长链脂肪酸,而SCD是一种去饱和酶,通过将双键结合到长链脂肪酸中来合成不饱和脂肪酸( 11 ). FASN和SCD与包括前列腺癌在内的各种恶性肿瘤的进展有关( 11 ),但调节其在癌细胞中表达增加的确切机制尚不清楚。 我们发现前列腺癌细胞中SRC-2表达的缺失和增加改变了FASN和SCD水平( 图2,E–G 、和 补充图4,A–D )因此,我们着手进一步确定SRC-2在这2个基因转录调控中的作用。 虽然已知SRC-2是AR的辅激活子,但我们在AR阳性细胞(LNCaP和C4-2)和AR阴性细胞(PC-3)中观察到了SRC-2依赖性FASN和SCD转录调控。 为了进一步了解这一点,我们使用基因集富集分析(GSEA)方法研究了LNCaP-siSRC2基因标记中雄激素调节基因的富集。 我们比较了LNCaP细胞中LNCaP-siSRC2基因签名与雄激素诱导的(100 nM DHT)基因签名( 29 )也带有LNCaP-siAR基因签名。 siSRC2调节基因未富集雄激素诱导的基因特征(标准化富集分数[NES]=–0.87, q个 =1)或对于siAR响应签名(NES=–0.9, q个 = 0.95) ( 补充图5,A和B ). 相反,雄激素诱导的基因签名在siAR基因签名中显著丰富(NES=–2.99, q个 < 0.001) ( 补充图5C ). 这些数据支持SRC-2并非完全通过AR发挥作用的观点,其与其他转录因子的关联可能解释了为什么SRC-2在侵袭性前列腺癌中过度表达到如此高的水平。
SRC-2 ChIP测序(ChIP-seq)数据分析( 17 )显示SRC-2在 FASN公司 和 SCD公司 启动子,与近端启动子区的固醇调节元件结合蛋白1(SREBP-1)固醇调节元素(SREs)重叠( 30 ). 直接测试SRC-2和SREBP-1对 FASN公司 和 SCD公司 表达,我们使用 FASN公司 (-220至+25个基点)( 31 )和 SCD公司 (-1280至+174 bp)启动子结构。 与内源性FASN和SCD表达的效应相吻合,SRC-2强烈激活两个启动子的转录,更重要的是与SREBP-1转录因子结合( 图3,A和B ). 然而,AR单独或与SRC-2联合未能激活荧光素酶驱动的 FASN公司 AR阴性PC-3细胞中的启动子,再次表明SRC-2独立于AR发挥作用( 补充图5D ). 同样,SRC-2单独或与SREBP-1联合沉默( 图3C )大大削弱了 FASN公司 PC-3细胞中的启动子活性( 图3D )表明SRC-2协同激活SREBP-1在 FASN公司 和 SCD公司 发起人。 最后,ChIP分析证实了近端SRC-2和SREBP-1的强烈占据 FASN公司 启动子与未服务上游区域检测到的启动子的比较( 图3E ). 有趣的是,SRC-2消融显示SREBP-1在 FASN公司 发起人( 图3E )这表明补充SRC-2作为辅激活子可能有助于SREBP-1在染色质上的稳定。 总之,这些数据证实SRC-2转录调控脂肪酸生物合成基因主要是通过协同激活SREBP-1,而不依赖于AR。
图3。 SRC-2协同激活SREBP1以促进脂肪生成。
( A类 )在单独载体、SREBP-1、SRC-2或SRC-2和SREBP-1的组合存在下,用FASN萤光素酶构建体(-220至+25 bp)瞬时转染的HeLa细胞中的萤光素酶报告基因测定( n个 = 6). ( B类 )在仅存在载体SREBP-1、SRC-2或SRC-2和SREBP-2的组合的情况下,用SCD-荧光素酶构建物(-1280至+174 bp)瞬时转染HeLa细胞的荧光素素酶报告子分析( n个 = 6). ( C类 和 D类 )在含有对照siRNA(siNT)、SRC-2-siRNA(siSRC-2)、SREBP-1-siRNA(siSREBP-1)或SRC-2和SREBP-2的组合的情况下,对转染FASN-荧光素酶构建物的PC-3细胞进行Western blot分析,然后进行荧光素素酶报告物分析。 使用UVP Vision Works LS软件通过密度测定法分析每个波段的半定量水平,并用数字表示每个车道下归一化为肌动蛋白的相对值(与未经处理的相比)。 完整的未切割凝胶如补充材料所示。 ( 电子 )来自稳定C4-2细胞shNT和sh18的SRC-2和SREBP-1的ChIP显示这两种蛋白质在 FASN公司 发起人。 测试的扩增子要么来自近端启动子区域(-140到-40 bp),要么来自转录起始点的非上游区域(-2000 bp)。 IgG抗体用作对照,数据以输入染色质的百分比表示( n个 = 4). 示意图显示了 FASN公司 发起人。 数据表示平均值±SEM* P(P) Tukey多重比较测试的双向方差分析结果<0.05( 电子 )和** P(P) <0.001学生 t吨 测试( A类 , B类 、和 D类 ).
SRC-2抑制锌转运蛋白ZIP1(SLC39A1)激活ACO酶活性。
接下来,我们研究了同位素标记研究表明,SRC-2促进α-酮戊二酸还原羧基化生成柠檬酸盐的机制。 谷氨酰胺代谢产生柠檬酸的酶的基因表达分析表明,SRC-2耗竭后没有任何显著变化( 补充图6A ). 然而,令人惊讶的是,我们观察到ACO酶活性急剧下降( 图4A ),但不具有IDH或柠檬酸合酶(CS)活性( 图4、B和C 、和参考。 32 )与对照组C4-2细胞相比,SRC-2缺失的C4-2细胞。 ACO通过以下途径催化柠檬酸盐立体异构化为异柠檬酸盐 顺式 -这种可逆反应是由细胞内锌浓度变构调节的( 33 ). 有趣的是,在正常前列腺上皮细胞中,ACO活性因锌含量的增加而受损,而在前列腺肿瘤细胞中,由于锌转运蛋白ZIP1(SLC39A1)的丢失,这种阻滞被逆转( 34 ). 我们推测SRC-2是前列腺肿瘤中ZIP1表达降低的遗传原因,从而间接调节ACO活性。 事实上,我们发现 邮政编码1 除DU145外,正常前列腺细胞的表达明显高于大多数被检测的肿瘤细胞系( 补充图6B )SRC-2的强制表达降低了内源性 邮政编码1 表达式( 图4D )通过直接与近端启动子区结合( 图4E )和抑制基因转录( 图4F ). 支持这一观察结果,我们发现 邮编1 SRC-2–KO中的表达( Ncoa2号机组 –/– )小鼠前列腺与WT同窝小鼠前列腺水平的比较( 补充图6C ). 为了验证ZIP1是否调节从头合成脂肪酸,我们测量了体外表达ZIP1的C4-2细胞中脂肪酸的质量同位素分布。 ZIP1的过度表达显著降低了从[5]开始的硬脂酸盐质量等位异构体分布- 13 C] 谷氨酰胺,表明ZIP1介导的ACO阻遏阻碍了碳从谷氨酰胺流向脂肪酸( 图4G ). 这些发现表明,SRC-2刺激前列腺细胞中ACO酶活性,至少部分是通过抑制ZIP1的表达来产生用于脂肪生成的柠檬酸盐( 补充图6D ). 总之,这些数据表明,SRC-2通过还原羧基化途径介导的谷氨酰胺碳的使用是前列腺癌细胞(而非正常细胞)唯一获得的支持脂肪生成的代谢适应。
图4。 SRC-2抑制锌转运蛋白ZIP1的转录以刺激ACO活性。
( A类 – C类 )ACO、IDH和CS在稳定C4-2细胞shNT、sh18和sh19中的酶活性( n个 = 5). ( D类 )qRT-PCR分析 SRC2公司 和 邮政编码1 ( SLC39A1型 )稳定的C4-2细胞shNT和sh18以及表达SRC-2腺病毒的C4-2 shNT细胞中的基因表达( n个 =4/组)* P(P) Tukey多重比较测试的双向方差分析结果<0.05。 ( 电子 )来自C4-2细胞的SRC-2的ChIP显示SRC-2在 邮政编码1 近端启动子(-175-70bp)与起始位点的-5000bp上游区域相比。 ( F类 )在单独存在载体(ZIP1荧光素酶)或SRC-2构建物(ZIP1-luc+SRC-2)的情况下,瞬时转染空pGL3载体(空荧光素酶)和pGL3-ZIP1-Luciferase构建物(-246至+82 bp)的HeLa细胞中的荧光素报告酶检测( n个 = 6). ( G公司 )[5中硬脂酸盐标记的质量同位素分布- 13 C] 体外表达人ZIP1(Adv ZIP1)或控制病毒(Adv GFP)的C4-2细胞中的谷氨酰胺( n个 = 3). 本研究中使用的质谱法未能检测到较高的脂肪酸同位素。 数据表示平均值±SEM* P(P) <0.05和** P(P) <0.001学生 t吨 测试( A类 , 电子 、和 F类 ),使用Holm-Sidak多重比较测试 G公司 .
谷氨酰胺摄取刺激SRC-2功能。
接下来,我们研究了引导SRC-2促进谷氨酰胺依赖性脂肪生成的上游信号事件。 最近的研究表明谷氨酰胺是一种有效的信号分子( 35 )尤其是在营养紧张的环境中,因为这种分子刺激营养吸收和能量代谢( 36 ). 当我们增加谷氨酰胺浓度时,我们观察到2个SRC-2靶基因的表达增加, FASN公司 和 SCD公司 随后在SRC-2缺失细胞中受阻( 图5A 和 补充图7A ). 出乎意料的是,我们观察到SRC-2蛋白水平大幅增加( 图5A ),但不包括mRNA水平( 补充图7A )在富含谷氨酰胺的培养条件下,表明SRC-2在谷氨酰胺刺激的前列腺癌细胞中的翻译后调节。
图5。 谷氨酰胺刺激诱导SRC-2的mTORC1依赖性磷酸化。
( A类 )在含有或不含有谷氨酰胺(2mM)生长的稳定C4-2细胞shNT、sh18和sh19中FASN、SCD、SRC-2和肌动蛋白的蛋白质印迹分析。 ( B类 )HA–SRC-2免疫沉淀,然后进行Western免疫印迹,以使用磷酸化丝氨酸/苏氨酸(p-Ser/Thr)抗体检测SRC-2的磷酸化状态。 从表达GFP腺病毒或SRC-2腺病毒的C4-2细胞获得输入裂解物,随后用增加浓度的谷氨酰胺(0.2 mM、2 mM和4 mM)刺激,然后用DMSO或mTORC1抑制剂torin(250 nM)处理。 Actin用于规范化输入加载控制。 用密度计分析磷酸化SRC-2的半定量水平,并用数字表示每个车道下归一化为肌动蛋白的相对值(与车道2中的值相比)。 ( C类 )Western blot分析显示3种不同的siRNA对mTOR表达的影响。 ( D类 )用非靶向siRNA或3种不同的mTOR siRNA转染表达SRC-2腺病毒的C4-2细胞,然后用或不用谷氨酰胺(2 mM)处理。 免疫沉淀HA–SRC-2,然后进行Western免疫印迹检测SRC-2的磷酸化状态。 GFP腺病毒作为阴性对照。 ( 电子 )用或不用谷氨酰胺(2 mM)刺激表达HA标记的WT SRC-2或磷酸化缺陷突变体S499A、S699A和S493A的C4-2细胞。 HA用于免疫沉淀WT SRC-2或突变体,然后进行Western免疫印迹以检测SRC-2的磷酸化状态。 肌动蛋白用于规范化输入负荷控制(HA–SRC-2)。 用肌动蛋白作为对照,使蛋白负荷控制正常化,用GFP腺病毒作为对照病毒。 完整的未切割凝胶如补充材料所示。
翻译后修饰,如磷酸化,有可能激活并增加辅活化子SRC家族的蛋白质周转( 37 ),最近的报告已经确定PI3K-AKT和mTORC1是可能被营养吸收激活的激酶( 11 , 38 ). 因此,我们检测了用以PI3K-AKT和mTORC1为靶点的不同激酶抑制剂处理的谷氨酰胺刺激C4-2细胞中SRC-2蛋白的表达,并与葡萄糖刺激细胞中的效果进行了比较。 在谷氨酰胺刺激的条件下,与DMSO处理的细胞中检测到的水平相比,mTORC1抑制剂torin下调了SRC-2蛋白水平( 补充图7B ),SRC-2信使表达无明显变化( 补充图7C ). 然而,我们并没有在高糖/低谷氨酰胺条件下观察到这种效果,相反,用PI3K抑制剂沃特曼(WORT)治疗显示SRC-2蛋白水平有所降低( 补充图7B ). 令人惊讶的是,众所周知的mTORC1抑制剂雷帕霉素未能模拟都灵的作用,这表明SRC-2可能是其他人推测的mTORC的雷帕霉素不敏感底物之一( 39 ). 同样,PI3K/mTORC1的双重抑制剂BEZ-235在两种培养条件下均未对SRC-2蛋白的稳定性产生任何影响。
增加谷氨酰胺治疗浓度可刺激mTORC1激酶活性( 35 )如我们的研究中mTORC1底物S6K1和4E-BP1的磷酸化所示( 补充图7D )谷氨酰胺处理的C4-2细胞中HA-SRC-2的免疫沉淀显示SRC-2丝氨酸/苏氨酸磷酸化呈剂量依赖性增加,随后被都灵处理逆转( 图5B ). 为了验证mTORC1在谷氨酰胺刺激下负责磷酸化SRC-2,我们使用3种特异的siRNA诱导了mTORC的遗传抑制( 图5C )并观察到C4-2细胞中磷酸化SRC-2水平降低( 图5D ). 先前用于确定mTOR底物的蛋白质组学筛选已确定SRC-2上的3个潜在位点:S499、S699和S493( 40 , 41 ). 因此,我们进行了定点突变以产生丝氨酸-丙氨酸磷酸化缺陷突变体,发现SRC-2上的S699位点在谷氨酰胺刺激下主要被mTORC1磷酸化,而S499表现出部分效应( 图5E ). 这些数据表明,谷氨酰胺刺激翻译后通过mTORC1依赖性磷酸化修饰SRC-2。 接下来,我们研究了SRC-2上mTORC1依赖性磷酸化增强SRC-2蛋白水平的机制。 为此,我们在低谷氨酰胺(0.2 mM)或高谷氨酰胺(2.0 mM)浓度培养的C4-2细胞中进行了环己酰亚胺蛋白降解实验。 谷氨酰胺刺激显著增加了SRC-2蛋白的稳定性和半衰期,这由环己酰亚胺时间依赖性处理决定( 补充图8A ),但这种增加的SRC-2蛋白稳定性被mTORC1抑制剂托林完全抑制( 补充图8B ). 这些发现表明,SRC-2上的谷氨酰胺-mTORC1依赖性磷酸化通过增加SRC-2蛋白质的半衰期,从而提高SRC-2蛋白表达水平,从而使SRC-2稳定。
最后,我们研究了mTORC1抑制是否影响SRC-2的转录活性。 谷氨酰胺信号诱导的SRC-2驱动 FASN公司 启动子活性( 图6A )以及加强对SRC-2的招聘 FASN公司 和 SCD公司 发起人( 图6、B和C )并且这种依赖谷氨酰胺的SRC-2活性被都灵显著阻断( 图6,A–C ). 据报道,谷氨酰胺通过α-酮戊二酸以依赖RAG的方式促进mTORC1活化( 35 ),我们使用细胞可渗透的α-酮戊二酸类似物辛基-α-酮戊二酸来逆转SRC-2磷酸化中的低谷氨酰胺条件。 如所示 图6D 谷氨酰胺刺激增加SRC-2磷酸化,而都灵治疗降低SRC-2的磷酸化。 相反,α-酮戊二酸类似物辛基-α-酮戊二酸部分逆转了SRC-2磷酸化过程中的低谷氨酰胺水平,表明谷氨酰胺依赖性mTORC1激活以RAG依赖性方式刺激其下游靶点SRC-2的磷酸化。 此外,mTORC1抑制剂torin也能重现在SRC-2消融条件下观察到的降低的血脂水平( 补充图9,A–E ). 综上所述,这些数据表明肿瘤细胞摄取谷氨酰胺以mTORC1依赖的方式激活SRC-2( 图6E )反过来,转录调节FASN和SCD的表达,从而促进脂肪生成。
图6。 谷氨酰胺刺激增强SRC-2的转录活性。
( A类 )用FASN-荧光素酶构建物转染表达GFP腺病毒或SRC-2腺病毒的PC-3细胞,并用高糖(11 mM)/低谷氨酰胺(0.2 mM)或高谷氨酰胺(2 mM)-低葡萄糖(5 mM)浓度刺激,然后用DMSO或torin(250 nM)处理。 然后进行荧光素酶分析以测量 FASN公司 启动子活性,数据归一化为总蛋白( n个 = 4). ( B类 和 C类 )来自C4-2细胞的SRC-2的ChIP显示SRC-2在 FASN公司 和 SCD公司 在存在或不存在托林(250nM)的情况下谷氨酰胺刺激(2mM)时的启动子。 图中显示了测试的扩增子。IgG抗体用作对照,数据以输入染色质的百分比表示( n个 = 3). ( D类 )HA–SRC-2免疫沉淀,然后进行Western免疫印迹,以使用磷酸化丝氨酸/苏氨酸抗体检测SRC-2的磷酸化状态。 从表达GFP腺病毒或SRC-2腺病毒的C4-2细胞获得输入裂解物,随后用增加浓度的谷氨酰胺(0.2 mM和2 mM)刺激,然后用DMSO或mTORC1抑制剂torin(250 nM)处理。 使用细胞可渗透辛基-α-酮戊二酸来缓解低谷氨酰胺水平对SRC-2磷酸化的影响。 Actin被用来规范化加载输入。 完整的未切割凝胶如补充材料所示。 ( 电子 )示意图描述了拟议的谷氨酰胺/mTORC1信号通路,其中SRC-2是调节协同激活SREBP-1的转录功能的关键下游介体。 数据表示平均值±SEM* P(P) <0.05和** P(P) <0.001学生 t吨 使用Holm-Sidak多重比较测试。
SRC-2定义了前列腺癌细胞的生物能量学。
为了研究SRC-2的表达是否定义了肿瘤细胞的代谢状态,我们分析了SRC-2扰动后前列腺癌细胞的生物能量参数。 与对照shNT细胞相比,SRC-2消融的C4-2和PC-3细胞显示出显著降低的基础代谢率(参考图中的0至20分钟时间范围)( 图7A 和 补充图10A ). 虽然寡霉素治疗降低了耗氧量(参考25至40分钟的时间范围),但添加解偶联剂羰基氰化物4-(三氟甲氧基)苯腙(FCCP)显著提高了耗氧率(OCR),表明最大呼吸容量(参考45至65分钟的时间框架) 前列腺癌细胞中( 图7A 和 补充图10A ). 然而,与对照(shNT)细胞相比,SRC-2缺失细胞的最大代谢率显著降低,表明其在调节前列腺癌细胞生物能量学方面的重要性( 图7A 和 补充图10A ).
图7。 SRC-2定义了人类前列腺癌细胞的代谢和能量程序。
( A类 )实时测量稳定C4-2细胞shNT、sh18和sh19的基本OCR和最大OCR( n个 =3/组)* P(P) <0.05和** P(P) 通过Tukey多重比较测试的双向方差分析,<0.001与shNT。 ( B类 和 C类 )在DMSO对照组中测量稳定C4-2细胞shNT、sh18和sh19的基本OCR和最大OCR( B类 )或FCCP处理( C类 )在高葡萄糖(11 mM)/低谷氨酰胺(0.2 mM)或低葡萄糖(5 mM)和高谷氨酰胺(2 mM)浓度下培养的细胞( n个 =3/组)。 方框图和胡须图显示了最小到最大值(胡须)、25%和75%四分位数(方框)以及中间值(水平线)** P(P) <0.001,双尾学生 t吨 测试。 ( D类 )在完整培养基中培养的稳定C4-2细胞shNT、sh18和sh19的细胞内ATP水平( n个 =3/组)。 方框和胡须图显示了最小到最大值(胡须)、25%和75%四分位数(方框)以及中间值(水平线)* P(P) <0.05和** P(P) 通过单因素方差分析得出<0.001。 ( 电子 )克隆原性存活测定显示了在2周的营养应激中存活的稳定表达shNT、sh18和sh19克隆的C4-2细胞的数量。 ( F类 )克隆存活试验中观察到的菌落总数 电子 数据表示平均值±SEM* P(P) <0.05和** P(P) <0.001学生 t吨 测试。
接下来,我们测量了在不同营养条件下培养的肿瘤细胞的代谢率。 前列腺癌细胞(shNT)暴露于高谷氨酰胺/低葡萄糖水平时,其基础细胞数均较高( 图7B 和 补充图10B )和最大代谢率( 图7C 和 补充图10C )与暴露于高糖/低谷氨酰胺水平的细胞相比,表明谷氨酰胺代谢在维持强大的能量学程序中的重要性。 相比之下,SRC-2消融细胞的基底细胞显著降低( 图7B 和 补充图10B )和最大代谢率( 图7C 和 补充图10C )与对照细胞相比,增殖率降低( 补充图10,D–F ). 我们还观察到最大代谢率( 图7C )和增殖能力( 补充图10,E和F )暴露于高谷氨酰胺/低谷氨酰胺浓度的SRC-2缺失细胞与在高葡萄糖/低谷氨酰胺浓度下培养的对照细胞中观察到的相似,这表明SRC-2的缺失模拟了谷氨酰胺缺失的代谢状态。 正如预期的那样,前列腺癌细胞中SRC-2的基因抑制导致细胞内ATP池显著减少,这表明细胞处于代谢缺陷状态( 图7D ). 集落形成分析反映了这些影响,因为SRC-2缺失的C4-2和PC-3细胞存活率低( 图7,E和F 、和 补充图10、G和H ). 综上所述,这些发现证实了SRC-2能够协调肿瘤细胞的代谢功能,并促进前列腺癌细胞的存活,即使在营养应激条件下也是如此。
SRC-2是前列腺癌转移的生存因素。
肿瘤细胞的存活和增殖是癌细胞向远处转移的主要标志( 42 ). 考虑到SRC-2作为能量代谢的主要协调人的重要性,它可以平衡生长和生存( 43 )及其在转移性前列腺癌患者中的表达增加( 18 ),我们研究了SRC-2在促进前列腺癌转移中的作用。 肿瘤细胞的锚定非依赖性生长是获得恶性肿瘤的关键步骤,SRC-2的沉默显著降低了软琼脂中C4-2和PC-3细胞的克隆生长( 图8,A和B 、和 补充图11,A和B ). 为了确定SRC-2的表达是否在转移扩散过程中促进前列腺癌细胞的体内生长和存活,我们利用了实验性肺转移的小鼠模型。 与在对照PC3细胞(shNT)中观察到的情况相比,经尾静脉注射到裸鼠体内的SRC-2消融的PC3细胞,即sh18和sh19,在注射5周后,其在肺部的定植和生长明显减少。 H&E染色图像清楚显示SRC-2消融的转移性前列腺癌细胞在肺实质中的生长减少( 图8C )Ki67染色显示增殖指数降低( 图8D 和 补充图11C ).
图8。 SRC-2对前列腺癌细胞存活至关重要。
( A类 )电镀后2周软琼脂试验中描绘稳定C4-2细胞shNT、sh18和sh19生长的代表性图像。 ( B类 )量化2周后存活的稳定C4-2细胞集落总数* P(P) 通过单因素方差分析,<0.05。 ( C类 )实验性肺转移试验的小鼠肺H&E染色切片。 通过尾静脉向裸鼠注射稳定表达shNT、sh18和sh19的PC-3细胞( n个 =7),5周后分析小鼠肺部细胞的生长和存活情况。 T、 肿瘤。 比例尺:100μm。 ( D类 )从shNT-、sh18-和sh19-注射动物的小鼠肺切片中定量Ki67染色细胞(抗体表位与人Ki67蛋白反应)* P(P) <0.05和** P(P) <0.001,双尾学生 t吨 测试。 另请参阅 补充图11C . ( 电子 )Western blot分析显示SRC-2、FASN、SCD和肌动蛋白在稳定的C4-2细胞shNT和sh19中的表达水平,以及SRC-2在感染SRC-2腺病毒的sh19细胞中的重新表达。 肌动蛋白被归一化为蛋白质负荷控制。 完整的未切割凝胶如补充材料所示。 ( F类 )在表达GFP腺病毒、SRC-2腺病毒或FASN腺病毒的稳定PC-3细胞shNT、sh18和sh19中进行克隆存活试验,以挽救SRC-2缺失细胞中有缺陷的存活表型。 ( G公司 )稳定表达shNT的C4-2和PC-3细胞的相对生长,这些细胞未经处理或用DMSO或BPTES(1μM)处理4天。 sh19细胞用于监测SRC-2敲除的效果( n个 =6/组)。 数据表示平均值±SEM* P(P) 与DMSO和** P(P) 通过Tukey多重比较测试的双向方差分析得出<0.001。
由于SRC-2的缺失模拟了生长减慢和生存不良的谷氨酰胺代谢状态,因此我们研究了SRC-2是否重建( 图8E 和 补充图11D )或在SRC-2敲除细胞中表达FASN可以挽救表型。 而SRC-2的强制过表达增强了PC-3( 图8F 和 补充图11E )和C4-2的生长和生存( 补充图11F 和 补充图12,A和B )、SRC-2或其靶基因的再表达 FASN公司 在SRC-2中,耗尽的PC-3细胞挽救了存活缺陷( 图8F 和 补充图11E )而C4-2细胞部分恢复( 补充图11F 和 补充图12,A和B ). SRC-2的重组也恢复了其转录靶点的表达 FASN公司 和 SCD公司 ( 图8E )以及细胞棕榈酸酯总量( 补充图12C ),证实SRC-2是前列腺肿瘤发生中脂肪生成程序的主要介质。 此外,SRC-2靶基因的敲除 SCD公司 ( 补充图12D )或者ZIP1的过度表达也模仿了缺陷表型的生长( 补充图12,E和F )在SRC-2沉默的肿瘤细胞中观察到。
接下来,我们利用BPTES(谷氨酰胺酶GLS1的特异性抑制剂)的机会,靶向前列腺癌细胞中的谷氨酰胺代谢途径( 44 ). 使用BPTES(1μM)快速阻断细胞中谷氨酰胺的利用( 44 , 45 )我们观察到,与DMSO治疗相比,前列腺癌细胞的生长显著下降( 图8G ). SRC-2耗竭也以类似于BPTES处理细胞(1μM)的方式减弱C4-2和PC-3细胞的生长; 然而,在较高剂量下,BPTES对细胞生长的影响比SRC-2消融术更强(数据未显示)。 这些发现表明,以SRC-2或谷氨酰胺代谢途径为靶点可能有助于前列腺癌的治疗。
最后,为了证实SRC-2抑制剂阻断前列腺肿瘤的生长和转移,我们将SRC-2缺失的PC-3细胞(sh19)原位植入小鼠前列腺,并在手术后8周将原发性肿瘤生长和转移与对照细胞(shNT)的生长和迁移进行比较。 而移植shNT PC-3细胞的小鼠显示原发性前列腺肿瘤生长旺盛( 图9,A和B 、和 补充图13,A–C )以及大量转移性病灶( 图9,A和C 、和 补充图13A ),SRC-2缺失的PC-3细胞产生较小的原发性肿瘤( 图9,A和B )并且转移病灶的数量大大减少( 图9,A和C ). 基因表达谱分析证实 FASN公司 和 SCD公司 SRC-2缺失的原位肿瘤与shNT PC-3肿瘤的比较( 补充图13B ). 接下来,我们使用MS分析了小鼠原位前列腺肿瘤中关键代谢物的水平,结果显示谷氨酸的含量显著降低( 图9D )和脂肪酸,如油酸( 图9E )和棕榈酸,以及SRC-2消融肿瘤中低水平的棕榈油酸( 补充图13D ). 这些发现表明,SRC-2驱动的代谢重编程是前列腺癌细胞存活的关键决定因素,这种机制可能会选择变异克隆进行侵袭性转移。 我们的研究结果证实了SRC-2在前列腺癌生长和转移中的主导作用,并表明抑制SRC-2可能有利于治疗转移性前列腺癌。
图9。 SRC-2促进前列腺癌转移。
( A类 )稳定表达shNT和sh19的PC-3细胞( n个 =5)原位植入SCID小鼠的左前列腺腹叶,并在手术后8周使用UVP生物光谱成像仪进行成像。 箭头表示原发肿瘤,箭头表示转移扩散的位置。 ( B类 和 C类 )使用卡尺测量每个原发肿瘤的体积,以及相对肿瘤体积( B类 )和转移( C类 )为每只小鼠绘制(水平线代表平均值)。 ( D类 和 电子 )PC-3 shNT和sh19细胞异种移植瘤提取物的靶向MS分析 A类 显示谷氨酸和油酸的相对水平。 ( F类 – H(H) )每千碱基外显子每百万片段的片段映射(FPKM)值 SRC2公司 , FASN公司 、和 SCD公司 来自一组良性邻区( n个 =16),器官相关前列腺癌( n个 68岁)和转移性前列腺癌( n个 = 48). ( 我 和 J型 )日志 2 -描述良性邻近前列腺谷氨酸和油酸水平的转换数据( n个 =16),临床局限性前列腺癌( n个 =12,PCA)和转移性前列腺癌( n个 =14)组织( 46 ). 该队列是RNA-seq队列的子集,如 F类 – H(H) . * P(P) <0.05和** P(P) <0.001学生 t吨 测试。 对于代谢组分析,我们计算了基于排列的 P(P) 值(10000个样本标签排列),以定义不同类别代谢物的重要性( 45 ). 数据用R语言绘制为方框图,显示5%和95%的分位数(胡须)、25%和75%的四分位数(方框)以及中间值(水平线)* q个 <0.05和** q个 <0.001,由双面学生 t吨 测试,FDR修正 P(P) 小于0.05的值视为显著。
为了获得临床见解 SRC2公司 , FASN公司 、和 SCD公司 在包含组织样本的患者衍生RNA-seq数据集中进行检测( n个 =132)从良性邻近组织收集( n个 =16),器官相关前列腺癌( n个 68岁)和转移性前列腺癌( n个 =48)组织。 重要的是,我们观察到 SRC2公司 前列腺癌患者,尤其是转移患者( 图9F ),伴随着其转录目标表达的增加 FASN公司 和 SCD公司 ( 图9、G和H ). 在这些发现的背景下,我们重新分析了我们之前发布的代谢组学分析数据集( 46 )这是上述较大RNA-seq队列的一个子集。 代谢组数据集包含来自良性邻近前列腺的组织( n个 =16),器官相关前列腺癌( n个 =12)和转移性前列腺癌( n个 = 14). 我们发现,随着疾病从良性到前列腺癌再到转移性前列腺癌的进展,谷氨酸水平显著增加( 图9I )血糖水平呈下降趋势( 补充图13E ). 脂肪酸,如油酸( 图9J )和棕榈油酸( 补充图13F )另一方面,转移性前列腺癌发病率增加。 这些数据支持我们的研究结果,即谷氨酰胺依赖性脂肪生成程序在转移性前列腺肿瘤中增强,并且过表达的SRC-2是这种代谢重编程的主要调节因子之一。 这些临床观察证实了我们的发现,SRC-2水平升高通过向肿瘤细胞传递代谢优势,从而促进前列腺癌转移,从而使其生长和转移失控。
讨论
在过去十年中,癌症代谢研究的进展拓宽了我们对肿瘤细胞中普遍存在的各种代谢改变的理解,这些代谢改变可以支持增殖细胞的合成代谢需求。 尽管有这方面的知识,但控制这些受干扰的代谢途径的高阶调控网络和遗传因素尚不完全清楚。 在这里,我们揭示了致癌转录协同调节剂SRC-2作为潜在代谢调节剂促进前列腺癌细胞的生长、存活和最终转移的作用。 我们提供证据表明,SRC-2表达通过重新编程细胞代谢来利用谷氨酰胺合成脂肪酸,从而定义了代谢活跃的细胞状态。 这个过程为肿瘤细胞补充了额外的生物能量和生物量增殖优势,因此合成代谢过程不会受到影响。 肿瘤细胞在转移过程中会遇到各种环境挑战,为了在宿主组织外成功生存和生长,需要一种自主高效的代谢策略,提供持续的能量供应和生物合成大分子。 我们认为SRC-2在前列腺肿瘤中的表达增加加强了这些代谢优势,并且这些优势促进了转移扩散过程中的细胞存活和归巢。
我们的研究结果表明,SRC-2通过调节底物利用率和速率限制酶两个不同但相互关联的过程促进前列腺癌细胞中从头合成脂肪酸。 我们提供证据表明,SRC-2通过还原羧基化逆转典型TCA循环反应,促进谷氨酰胺合成脂质前体分子柠檬酸盐。 尽管这种还原羧化途径在哺乳动物细胞中被认为效率较低,但最近的报道表明,癌细胞可以有效地利用这种途径合成脂质( 5 , 47 ). 从机制上讲,SRC-2通过锌转运蛋白ZIP1的转录抑制激活ACO酶来促进还原羧基化,发现ZIP1在前列腺癌患者中的表达显著降低( 34 ). 由于锌是ACO酶活性的变构抑制剂( 33 )前列腺癌细胞通过SRC-2介导的锌转运蛋白的下调,获得了阻止锌进入的独特能力。 此外,SRC-2协同激活SREBP-1转录因子,以增强新生脂肪生成关键酶、FASN和SCD的表达,而不依赖AR,这清楚地证明SRC-2并非完全通过AR发挥作用。因此,前列腺癌细胞中过表达SRC-2的动态调节,无论是作为协同激活剂还是作为协同抑制剂, 微调新陈代谢重组以支持脂肪生成程序。
最近的研究结果表明,mTORC1是谷氨酰胺信号通路的一个组成部分,调节谷氨酰胺的无补作用以维持肿瘤细胞的生长和增殖( 48 ). 我们的研究结果现在拓宽了这一认识,提供了谷氨酰胺/mTORC1信号传导刺激并招募SRC-2来协调转录变化以激活代谢基因的证据。 因此,我们的研究现在确定SRC-2是谷氨酰胺/mTORC1信号通路的关键下游介导物,促进前列腺癌细胞的从头开始脂肪生成。
传统上,癌细胞新陈代谢的改变被视为继发于生长信号的间接现象( 42 )但最近的证据支持另一种观点,即激活的致癌基因和抑癌基因的主要功能可能是重新编程肿瘤代谢( 三 ). 根据这一新概念,我们的研究结果表明,SRC-2的致癌功能主要归因于其维持增加的脂肪酸生物合成和能量稳态的能力,从而通过逃避细胞死亡和生长抑制检查点来增强细胞生长和存活的增殖信号。 支持这一观点的是,以前的研究已经确定了 FASN公司 和 SCD公司 ,本研究确定的SRC-2下游靶基因中的2个( 8 , 49 ). 因此,有理由假设辅激活物依赖的转录重编程在重设肿瘤代谢途径以支持不受控制的生长和生存方面发挥着重要作用。 此外,我们的研究发现,前列腺癌细胞在营养应激条件下以及疾病从局部癌变为转移癌的过程中对谷氨酰胺代谢有依赖性,抑制SRC-2或谷氨酰胺代谢途径都可以显著降低肿瘤细胞的生长和转移。 总之,我们相信,我们的结果提供了新的见解,可能会导致针对前列腺癌细胞代谢的抗癌治疗策略的发展。
方法
细胞培养
LNCaP、C4-2和PC-3细胞在添加10%FBS(Invitrogen)和青霉素-链霉素(PS)(Invitorgen)的RPMI(Invit罗gen)中培养。 C4-2细胞系是Nancy Weigel(美国德克萨斯州休斯顿贝勒医学院)的礼物。 HeLa细胞在含有10%FBS和1%PS的DMEM(Invitrogen)中培养。对于营养应激实验,使用了以下培养基成分:高糖/低谷氨酰胺浓度,由RPMI[-]谷氨酰胺(21870;Invitrogin)和0.2 mM L-谷氨酰胺(Invit罗gen)组成,最后浓度为D-葡萄糖(11 mM), 10%的透析FBS和1%的PS。低葡萄糖/高谷氨酰胺浓度由RPMI[-]葡萄糖(11879;Invitrogen)组成,最终的L-谷氨酰胺浓度为2.0 mM,补充5 mM D-葡萄糖、10%的透析BFS和1%PS。
试剂和质粒
激酶抑制剂从以下来源获得:雷帕霉素(钙生物化学); 都灵1号(托克里斯); BEZ235(Selleck Chemicals); WORT(Sigma-Aldrich); α-酮戊二酸辛酯(Cayman Chemical); 和BPTES抑制剂(美国马里兰州巴尔的摩约翰霍普金斯大学Takashi Tsukamoto赠送)。 使用了以下抗体:SRC-2(BD Biosciences and Bethyl Laboratories); SCD(Abcam); FASN、mTORC1采样器套件和HA-Tag(细胞信号技术); 和磷酸-氨基酸/苏氨酸(BD Biosciences)。 使用以下质粒:pCR3.1-SRC-2和pcDNA3.1-FLAG-SREBP-1a(Addgene); pGL3-ZIP1和FASN荧光素酶(Addgene); 和SCD荧光素酶(SwitchGear Genomics)。 pGL3-hZIP1(–246/+82)结构是Peter Makhov(美国宾夕法尼亚州费城Fox Chase癌症中心)赠送的礼物( 50 ).
动物
所有动物实验均按照贝勒医学院动物护理研究委员会的要求进行。 SRC-2–KO的生成( Ncoa2号机组 –/– )老鼠已经被描述过了( 51 )和年龄匹配的雄性同窝小鼠。 对于肿瘤研究,6至7周龄雄性无胸腺裸鼠(Harlan Laboratories)用于实验性肺转移测定,6至7周龄雄性Fox-Chase SCID小鼠(Charles River Laboratories)用于前列腺原位异种移植物实验。
慢病毒介导的SRC-2敲除细胞生成
慢病毒介导的shRNA表达可产生SRC-2表达降低的稳定细胞。 表达靶向SRC-2(2个克隆:186064和199063)或非靶向对照(对照:shNT)的shRNA序列的pGIPZ载体是从OpenBiosystems获得的,病毒是在贝勒医学院(CBASS-BCM)核心设施的细胞检测筛查服务处生成的。 在开始任何功能或示踪实验之前,在嘌呤霉素(1μg/ml)存在的情况下,选择稳定细胞的多克隆集合群体超过3代。
荧光素酶检测
使用荧光素酶报告试验(Promega)和Berthold 96-well平板阅读器进行荧光素酶分析。 荧光素酶值归一化为总蛋白水平。
炸薯条
使用EZ ChIP试剂盒(EMD Millipore)进行ChIP分析,并进行了一些修改。 简单地说,在15厘米的培养皿中培养稳定的C4-2细胞,直到80%的细胞融合,并用谷氨酰胺刺激或不刺激都灵(250 nM),然后进行染色质剪切和qPCR。
代谢组学分析
试剂和内部标准。
HPLC级乙腈(ACN)、甲醇和水购自Burdick&Jackson。 MS级甲酸和内部标准,即[15N] 2 色氨酸和[15N]邻氨基苯甲酸购自Sigma-Aldrich。 在ACN/三氟乙酸/水中含有多种校准剂的校准溶液从安捷伦科技公司购买。 所有样本的代谢组学分析均采用上述方案进行。 使用内部标准对原始数据(液相色谱-MS[LC-MS]输出)进行标准化( 52 ).
液质联用
代谢物的色谱分离使用QQQ质谱仪(安捷伦科技公司)在线反相分离或正相分离进行。
TCA代谢物的分离。
正相色谱分离也用于代谢产物的靶向鉴定( 52 ). 该程序涉及使用含水溶剂(溶剂A),溶剂A通过添加5 mM醋酸铵(pH 9.9)和100%ACN(溶剂B)进行改性。 二元泵的流速为0.2 ml/min,梯度范围为80%B至2%B,持续20分钟,然后是2%B至80%B,持续5分钟,随后是80%B持续13分钟。 在分离过程中,流速逐渐增加,从0.2 ml/min(0–20分钟)增加到0.3 ml/min,从20.1–25分钟增加到0.35 ml/min。 代谢物在Luna Amino(NH2)柱(4μm,100A 2.1×150 mm;Phenominex)上分离,该柱保持在温度控制室(37°C)中。 每50次注射后,对本研究中使用的所有色谱柱进行清洗和修复。
脂肪酸(棕榈油酸和油酸)的分离。
针对代谢物,进行反相色谱分离以鉴定代谢物。 使用含水溶剂(溶剂A)进行分离,溶剂A通过添加10 mM醋酸铵(pH 8)和100%甲醇(溶剂B)进行改性。 二元泵流量为0.2 ml/min,梯度范围为40%B至50%B,持续8分钟,然后是50%B至67%B,保持5分钟,67%B保持9分钟,67%B至80%B保持1分钟,80%B至100%B保持4分钟,100%B维持5分钟。 代谢物在苯基己基柱(3μm,100A 2.1×150 mm;酚胺)上分离,该柱保持在温度控制室(37°C)中。 每50次注射后,对本研究中使用的所有色谱柱进行清洗和修复。
基于MS检测小鼠原位肿瘤代谢组的样品制备
将原位小鼠组织储存在–140°C的液氮中,直至分析。 对于代谢组提取,将10 mg组织在含有[15N]的1:4冰水/甲醇混合物中均质化 2 色氨酸。 随后按3:1的比例依次加入冰冷的氯仿和水,并分离有机溶剂(甲醇和氯仿)和水性溶剂(水/甲醇/氯仿/水,比例为1:4:3:1)。 使用3kDa分子过滤器(Amicon Ultracel 3-kDa膜;EMD Millipore)对水提取物进行脱蛋白,并在真空下干燥含有代谢物的滤液(EZ-2 Plus;Genevac)。 在MS之前,将干燥的提取物重悬在由适当的流动相组成的相同体积的注射溶剂中,并进行LC-MS。
代谢物的分离。
采用反相色谱分离法对代谢物进行靶向鉴定。 为此,我们使用了一种含有水的溶剂(溶剂a); 通过添加10mM乙酸铵和100%甲醇(MeOH)来改性溶剂A以形成溶剂B。梯度:40%B至100%B,持续23分钟。 流速:0.2 ml/分钟。 代谢物在Luna Phenyl Hexyl柱(3μm,2×150 mm)上分离,该柱保持在温度控制室(40°C)中。
靶向质谱同位素标记和分析
营养素标签 13 C从剑桥同位素实验室购买。 C4-2细胞在常规培养基中的6孔板中生长,直至80%融合,然后隔夜饥饿,然后添加2.0 mM L[U- 13 C类 5 ]谷氨酰胺,[1- 13 C] 谷氨酰胺,或[5- 13 C] 谷氨酰胺补充有含有10%透析FBS和1%PS的RPMI[-]谷氨酰胺,或添加11 mM D[U- 13 C类 6 ]葡萄糖补充RPMI[-]葡萄糖、10%透析FBS和1%PS。收集培养液,用PBS冲洗细胞,用液氮快速冷冻每个处理中等量的细胞。 将细胞刮入0.5 ml的1:1水/甲醇混合物中,超声1分钟(两个30秒脉冲),然后与450μl冰镇氯仿混合。 然后将所得匀浆与150μl冰水混合,并再次旋转2分钟。 将匀浆在-20°C下培养20分钟,并在4°C下离心10分钟,以分离水层和有机层。 在自动环境速度真空系统(Thermo Fisher Scientific)中,将水层和有机层结合并在37°C下干燥45分钟。 在500μl冰镇甲醇/水(1:1)溶液中重新配制提取物,并在4°C下通过3-kDa分子过滤器(Amicon Ultracel 3-kDa-膜)过滤90分钟,以去除蛋白质。 滤液在37°C下在快速真空中干燥45分钟,并在-80°C下保存,直至MS分析。 在MS分析之前,将干燥提取物重新悬浮在含有0.1%甲酸的50μl甲醇/水(1:1)溶液中,然后使用多重反应监测(MRM)进行分析。 使用6490 QQQ三重四极杆质谱仪(安捷伦科技公司)和1290系列高效液相色谱系统,通过选择性反应监测(SRM),注入10微升并进行分析。 代谢物在正离子和负离子模式下都是靶向的:电喷雾源电离(ESI)电压在正离子模式下为+4000 V,在负离子模式中为-3500 V。 每个检测到的代谢物大约有9到12个数据点。 为了靶向TCA通量,使用Luna Amino色谱柱(4μm,100A 2.1×150 mm)通过正相色谱将样品输送至质谱仪。 为了确定脂肪酸流量,使用苯基己基柱(3μm,100A 2.1×150mm)通过反相色谱将样品输送至质谱仪。 对于 13 C标记实验,SRM按预期执行 13 靶向LC-MS/MS中不同形式的C掺入。使用以下公式计算质量同位素分布(MID):[分数掺入=( 13 C类/ 13 C类+ 12 C) ×100],并根据自然丰度进行校正。 通过比较[1]中TCA代谢物的MID计算还原羧基化通量的变化- 13 C] 谷氨酰胺–或[5- 13 C] 谷氨酰胺标记细胞。 通过对[5- 13 C] 谷氨酰胺标记细胞。
酶活性
根据制造商的协议,使用试剂盒测量IDH(MAK062;Sigma-Aldrich)、CS(CS0720;Sigma-Aldrich。 简单地说,将细胞接种在15厘米的培养皿中,直到80%汇合。 使用添加蛋白酶和磷酸酶抑制剂鸡尾酒(EMD Millipore)的试剂盒中提供的裂解缓冲液在冰凉条件下裂解细胞。 酶活性测定使用等量的蛋白质。
代谢组数据分析
标准化数据来自Sreekumar A等人( 46 ). 我们执行了基于排列的 P(P) 值(10000个样本标签排列)来定义不同类别中代谢物的重要性。 使用R语言的方框图进一步绘制数据。
GSEA公司
GSEA是使用GSEA软件包执行的( 53 ). NES和调整 q个 根据1000个排列基因的随机排列,使用GSEA方法计算值。 数据保存在NCBI的基因表达综合数据库(GEO GSE63539标准 ).
统计
除非另有说明,否则所有结果均表示平均值±SEM,并使用双尾学生模型进行不同组之间的统计比较 t吨 使用Tukey的多重比较修正进行测试或双向方差分析。 对于所有统计分析 P(P) ≤0.05被认为具有统计学意义,实验重复至少3次。 数据分析使用GraphPad Prism软件版本4.0/6.0(GraphPad-software)。
研究批准
所有动物实验均由贝勒医学院(BCM)比较医学动物中心批准。 先前报告了用于代谢组学和RNA-seq分析的前列腺组织样本,数据分析是在BCM IRB的批准下进行的。
致谢
我们感谢BCM的以下同事和核心机构对本研究的帮助:Nancy Weigel(有益的讨论); 朱伯凯、何斌(ChIP-seq分析); Bian Ka和Vasanta Putluri(技术援助); Pradip Saha(海马实验); 组织培养核心设施(CBASS)以及病理学和组织核心设施。 BCM的小鼠代谢核心(MMC)和糖尿病研究中心由国家糖尿病、消化和肾脏疾病研究所(NIDDK)资助,NIH拨款P30 DK079638。 这项工作得到前列腺癌基金会挑战奖的支持(给B.W.O'Malley); NIDDK,NIH(5P01DK059820,发给B.W.O'Malley); 德克萨斯州癌症预防研究所(CPRIT)(RP100348,致B.W.O'Malley); 空间科学促进中心(CASIS)综合Omics奖(授予B.W.O'Malley); CPRIT多投资者研究奖(CPRIT-MIRA)(RP101251-P02,授予B.W.O'Malley,RPN20092和1R01CA133458,授予A.Sreekumar); 以及美国国立卫生院国家癌症研究所(NCI)(1U01CA167234至A.Sreekumar)。
脚注
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关联数据
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