摘要
维甲酸存储的肝星状细胞(HSCs)最近被描述为一种肝-间充质干细胞(MSC)群体; 然而,目前尚不清楚这些细胞是否有助于肝再生或作为具有肝胆特性的祖细胞群。 在这里,我们从表达eGFP的大鼠中分离出视网膜依赖性荧光激活细胞,纯化HSC,并移植这些GFP + 将HSC移植到野生型(WT)大鼠中,这些野生型大鼠在2-乙酰氨基芴(2AAF)或逆转录酶的存在下进行了部分肝切除,这两种损伤模型都有利于以干细胞为基础的肝脏修复。 移植的HSC通过形成间充质组织、祖细胞、肝细胞和胆管细胞,促进宿主动物的肝再生,并提高GUNN大鼠血清中的直接胆红素水平,表明这些动物的肝胆红素修复缺陷得到了恢复。 将移植的HSC植入宿主动物的骨髓(BM)中,从骨髓中分离出HSC衍生细胞,并成功地将其重新移植到肝脏受损的新宿主中。 培养的HSC在分化为胆汁酸合成和转运肝细胞的过程中瞬时采用与祖细胞相似的表达模式,这表明星状细胞是肝祖细胞的来源。 这个概念连接了看似矛盾的研究,这些研究支持祖细胞或MSC作为干细胞肝再生的重要参与者。
介绍
肝星状细胞(HSC)的特点是静止状态下的类视黄醇含量异常高。 这些主要以棕榈酸视黄酯的形式储存在膜包裹的脂质囊泡中,在紫外光激发后显示出特征性的类视黄酸荧光。 HSC主要被称为肝脏中的胶原蛋白生成细胞,负责慢性肝病中的纤维化形成( 1 ). 尽管进行了几十年的深入研究,HSC仍然是个谜( 2 ). 例如,星状细胞表达不同胚层的分子标记,这阻碍了对其起源的明确说明( 三 ). 星形细胞中胶质纤维酸性蛋白(GFAP)和许多其他神经外胚层蛋白的存在( 4 )导致了他们可能来自神经嵴的观点。 在发育中的肝脏中,显微镜和命运图分析对这一概念提出了质疑,这表明星状细胞显然起源于位于横隔内皮下间隙的间充质细胞( 5 , 6 ). 中胚层标志蛋白如结蛋白和α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA或肌动蛋白α2/ACTA2)的表达支持这一观点,特别是在活化的HSC中( 7 ).
直到最近,人们才主要研究HSC在慢性疾病中的成纤维潜能,而对其在正常肝脏中的身份和功能却很少关注。 最近的数据表明,星状细胞代表肝脏驻留的间充质干细胞(MSC),因为它们与MSC相关的表达谱,它们分化为脂肪细胞或骨细胞的潜力,以及它们对髓外造血的支持作用( 8 , 9 ). 与此相一致,星状细胞可以起源于骨髓(BM)( 10 , 11 ),MSC最初发现于此( 12 )和其他器官中的MSC一样,它们位于靠近内皮细胞的肝脏中( 13 ). 静止的星状细胞通常位于Diss空间的窦状内皮细胞和肝细胞之间,具有干细胞龛的特征( 14 , 15 ). 此外,活化的星状细胞可以在体外发育为肝细胞样细胞( 14 , 16 ),和命运映射实验使用 Gfap公司 和 学报2 启动子表明它们有助于体内肝脏再生( 17 – 19 ). 与此相反,卵磷脂视黄醇酰基转移酶(LRAT)和中胚层后1同源物(MESP1)的血统追踪实验未能证明HSC在受损小鼠肝脏再生过程中分化为上皮细胞( 20 , 21 ). 有趣的是,LRAT和MESP1被认为是HSC或其前体特异性表达的( 20 , 21 ),由小鼠和人类的胚胎和成人干细胞表达(胚胎干细胞数据库, http://biit.cs.ut.ee/escd/ ; 参考文献。 22 , 23 ). 由于这些对立的血统追踪研究,我们在本研究中对HSC进行了细胞移植实验,以确定它们对肝脏再生的贡献。 最近有报道称,胰腺移植的星状细胞通过在基于干细胞的体内肝再生模型中分化为上皮细胞系参与肝修复( 24 ). 此外,来自BM和脂肪组织的MSC被显示分化为肝实质细胞( 25 – 27 ). 组织特异性植入(归巢)、运输到器官损伤部位以及参与组织修复是干细胞的重要特性,可以通过细胞移植实验进行分析( 28 – 31 ). 干细胞可以反复移植到不同的生物体中,其再移植能力被认为是其主要特征之一( 29 ). 因此,需要进行细胞移植研究来进一步验证HSC的干细胞特性。 鉴于HSC产生肝细胞,问题是已建立的肝祖细胞(在啮齿动物中称为卵圆细胞)是否可以代表星状细胞或其他MSC肝分化的中间阶段。 肝祖细胞是严重肝损伤后短暂出现的小细胞,在肝细胞增殖受损时可恢复肝质量( 32 , 33 ). 这些前体细胞通过上皮细胞粘附分子(EPCAM)、角蛋白19(K19)和α-胎蛋白的表达进行鉴定,并通过形成导管样结构(导管反应)从门脉区突入受损肝组织。 据报道,肝祖细胞来源于具有上皮特征的干细胞( 34 ),但它们也显示了中胚层细胞的特征,例如波形蛋白的表达( 35 ). 本研究探讨了祖细胞是否可以来源于MSC群体,如具有中胚层特征的肝星状细胞。 数据表明,移植的HSC可以作为受损肝脏的宿主,并通过发育成假定的祖细胞、上皮组织和间充质组织,促进组织再生。 在这个过程中,祖细胞似乎代表了HSC和其他MSC群体分化的中间阶段。
结果
孤立HSC的特征。
来自男性eGFP的HSC + 通过肝脏酶灌注分离Wistar大鼠,然后通过Nycodenz密度梯度离心富集。 由于HSC的高脂含量,离心后在Nycodenz梯度上部形成一层透明层(未显示)。 通过该技术富集的HSC随后通过视黄醇依赖性荧光激活细胞分选(FACS)进行分选。 在FACS分析过程中,我们通过正向和侧向散射来确定HSC的形态(图 1 A) ●●●●。 具有类似形态的HSC(图 1 A、 在350 nm激发后的特征维甲酸(维生素A)荧光(图 1 B、 门)最终被收集。 我们发现HSC约为13.2±0.24μm( n个 =16)分选后立即直径,表现出典型的星状形态,含有含维甲酸的脂质小泡,并在培养2天后用蓝色和紫外线激发活细胞后表达eGFP(图 1 C) ●●●●。 在FACS获得的HSC中,通过免疫荧光检测外胚层和中胚层星状细胞标记物,如GFAP、巢蛋白、波形蛋白和结蛋白(图 1 ,D–F),而角蛋白和甲胎蛋白等肝胆标志蛋白无法检测到(未显示)。 这表明,通过密度梯度离心和维甲酸依赖性FACS的结合,典型的HSC得到了高度纯化,没有受到其他肝细胞的污染。
图1。 eGFP新分离HSC的特性 + 大鼠按维甲酸依赖性FACS分类。
通过密度梯度离心富集HSC,并使用FACS进一步纯化HSC( A类 )正向(FSC)和侧向散射(SSC)以及( B类 )维甲酸荧光。 HSC与( A类 )相似的形态学特征(门R1)为( B类 )通过UV光激发进一步分析它们的类视黄醇荧光。 ( B类 )具有强烈维甲酸荧光(门)的HSC( C类 )培养2天,通过对活细胞的蓝光和紫外光激发评估,显示出维甲酸(蓝色)和eGFP(绿色)荧光。 按FACS排序的HSC表示( D类 )GFAP、( E类 )巢穴,以及( F类 )波形蛋白(红色),以及( D类 – F类 )结蛋白(绿色),由免疫荧光测定。 细胞核用DAPI(蓝色)染色。 比例尺:100μm( C类 ); 50微米( D类 – F类 ).
HSC移植(2AAF/部分肝切除模型)。
从男性eGFP中新分离出的HSC + 通过部分肝切除术(PHX),在肝损伤后立即通过尾静脉注射将联合密度梯度离心和维甲酸依赖性FACS获得的大鼠移植到雌性野生型(WT)大鼠体内。 用2AAF预处理宿主动物7天,以抑制成熟肝细胞的增殖并诱导以干细胞为基础的肝再生。 我们研究了移植eGFP的定位 + 肝再生7天和14天后,通过eGFP免疫荧光检测宿主肝中的HSC。 我们在WT对照肝脏中未发现明显的eGFP染色(图 2 A) 而eGFP表达细胞主要在接受eGFP的受损大鼠肝脏(2AAF/PHX模型)的门静脉区检测到 + HSC(图 2 、B和C)。 我们评估了eGFP的丰度 + 男性特异性性别决定区Y的定量PCR(qPCR)分析女性宿主肝脏中的男性HSC( 斯里 )DNA和 电子GFP mRNA(图 2 、D和E)。 大约60%的宿主动物接受了eGFP + HSC表现出可测量性 斯里 DNA或 电子GFP mRNA水平。 星形细胞移植的女性宿主肝脏显示,约10%至14%的肝细胞来源于移植的男性eGFP + 再生7天和14天后的HSC,而通过qPCR在宿主肝脏中检测不到HSC植入(图 2 移植后1天,D和E)和肺(未显示)( n个 = 5). 常规的半定量逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)揭示了eGFP的存在 + 移植后1天宿主肝脏中的HSC(未显示)。 这个 电子GFP 不同动物间WT宿主肝脏中的mRNA水平在6%至22%(7-14天)之间变化( n个 =10)当应用qPCR时。 增加 斯里 DNA和 电子GFP 第一周内的数量表明移植的HSC在宿主肝脏中增殖(图 2 、D和E),而不提高纤维组织炎相关标记物(如胶原1α2链)的表达( 第1a2列 ), 第4a1列 ,或 学报2 与在受伤对照肝脏(2AAF/PHX模型)中观察到的表达水平进行比较,如在第1天、第7天和第14天通过qPCR进行的研究(图中所示为第14天 2 F) ●●●●。 在再生过程中,2AAF/PHX模型的肝脏中纤维化相关标志物的表达瞬时增加,在第7天左右达到最大表达(未显示)。 我们还观察到移植eGFP的植入 + WT宿主大鼠胰腺中HSC的RT-PCR和qPCR研究 电子GFP mRNA。 eGFP + HSC的丰度较低,约为0.02%(±0.01%; n个 = 4; 7天)和0.3%(±0.09%; n个 = 8; 14天)。 eGFP胰腺组织 + 转基因(100%)和WT大鼠(0%)用于正常化。
图2。 移植eGFP + HSC位于受损的WT宿主肝脏并有助于肝脏再生(2AAF/PHX模型)。
eGFP免疫荧光(绿色)( A类 )WT对照肝和WT宿主肝( B类 )7和( C类 )HSC移植后14天。 的qPCR( D类 ) 斯里 DNA和( E类 ) 电子GFP 雄性eGFP移植后第1、7和14天的mRNA + 高速列车( n个 = 5). 的生平( D类 )男性( n个 =6)和雌性( n个 =4)或( E类 )转基因eGFP + (100%, n个 =3)和WT大鼠(0%, n个 =3)用于归一化。 ( F类 )的qPCR 第1a2列 链, 第4a1列 链条,以及 学报2 在2AAF/PHX模型的大鼠肝脏中( n个 =5)和无(控制, n个 =8)第14天移植HSC。 ( 克 和 H(H) )HSC移植1天后WT宿主肝脏eGFP(棕色)的DAB免疫组化。 ( 克 )电子GFP + 通过结蛋白免疫荧光(黄色;2区)鉴定HSC。 ( H(H) )胆管内(黑色箭头)或与胆管相关(白色箭头)的HSC衍生细胞(1区)。 ( 我 )WT对照肝无eGFP的DAB免疫组化。 ( J型 – M(M) )eGFP移植后14天,eGFP(棕色)的DAB染色 + HSC。 ( J型 )胆管中K19表达细胞(黄色)( J型 和 K(K) )eGFP用箭头表示(区域1)。 电子GFP + 肝细胞(棕色;箭头)通过HNF4α免疫荧光鉴定(黄色)( L(左) )在1区和( M(M) )区域3。 ( N个 )eGFP快速红染色 + 含HNF4的(红色)肝细胞 一 (黄色;箭头;区域1)。 ( O(运行) )WT对照肝eGFP快速红染色。 比例尺:200μm( A类 – C类 , 我 ,以及 O(运行) ); 50微米( 克 和 J型 – N个 ); 20微米( H(H) ).
尽管移植了eGFP + 移植后1天,HSC低于qPCR的检测限(图 2 ,D和E),RT-PCR 电子GFP 使用3,3′-二氨基联苯胺(DAB)对eGFP进行免疫组织化学染色,结果显示它们在窦状体内以去蛋白表达星状细胞的形式存在,并显示它们归巢于宿主肝脏(图 2 G) ●●●●。 我们还发现了eGFP + 移植后1天,HSC整合并与宿主肝脏中的胆管相关(图 2 H) ●●●●。 WT对照肝脏(2AAF/PHX模型)未显示eGFP的DAB染色(图 2 一) ●●●●。 eGFP的DAB免疫组织化学,结合胆道标记物K19和肝细胞标记物HNF4α的免疫荧光,表明移植的HSC在肝再生14天后有助于胆管和肝细胞的形成(图 2 ,J–M)。 我们在两个门脉周围(1区;图 2 五十) 和中央周围(3区;图 2 M) 区域。 还通过eGFP的快红免疫组织化学和HNF4α的免疫荧光研究了HSC向肝细胞的分化(图 2 N) ●●●●。 我们没有在WT对照肝脏中观察到eGFP的快速红免疫组化阳性(2AAF/PHX模型)(图 2 O) ●●●●。 当HSC克隆(来源于单个eGFP)时,我们发现再生肝脏(2AAF/PHX)中存在类似的分化潜能 + HSC通过克隆扩增进行移植。 如qPCR分析所示 电子GFP mRNA,不同的HSC克隆重组约16%(±5%;范围3%-28%; n个 =4)(补充图1,A–C)。 我们通过雄性特异性Y染色体的荧光原位杂交(FISH)研究了雄性HSC克隆在雌性宿主肝脏内分化为上皮细胞。 当添加HNF4α或角蛋白(pan keratin,panK)的免疫荧光时,FISH分析显示肝细胞和胆管细胞中存在HSC衍生的Y染色体(补充图1、B和C)。 我们验证了Y染色体探针在男性(阳性对照)和女性(阴性对照)肝脏切片上的特异性(图 三 以及通过男性对照肝切片细胞核中每条染色体的不同信号结合Y和X染色体探针(图 三 C) ●●●●。 FACS分类的雄性大鼠原代HSC移植后,用FISH检测HNF4α中Y染色体 + 和panK + 雌性宿主肝内的细胞(2AAF/PHX模型),表明雌性宿主肝中HSC衍生的肝细胞和胆管细胞(图 三 、D和E)。 Y和X染色体的同步FISH显示正常的二倍体和四倍体肝细胞,这些肝细胞来源于移植的雄性HSC,没有与先前存在的雌性肝细胞融合(图 三 F) ●●●●。 移植的HSC能够恢复纯合GUNN大鼠的肝功能,由于外显子4的突变,纯合GUNN大鼠缺乏尿苷5′-二磷酸葡萄糖醛酸基转移酶1A1(UGT1A1)活性。 UGT1A1酶在肝细胞中表达,是胆红素葡萄糖醛酸化(结合)所必需的酶,能够排出胆红素。 由于 Ugt1a1型 缺乏,与正常大鼠相比,纯合子GUNN大鼠的血清胆红素水平较高。 我们核实了 Ugt1a1型 通过酶切(BstNI)移植HSC后纯合GUNN大鼠肝脏中无突变的转录物 Ugt1a1型 PCR产物,其产生类似于在杂合子GUNN或正常大鼠中获得的额外PCR产物。 相反,变异 Ugt1a1型 保持未分离状态,并以465 bp的单个PCR产物出现(图 三 G) ●●●●。 与此相一致,在移植正常大鼠的HSC后4周内,纯合子GUNN大鼠的血清结合(直接)胆红素水平增加了2倍 Ugt1a1型 与未移植HSC的GUNN大鼠的血清水平进行比较(图 三 H) ●●●●。 这表明通过将移植的HSC分化为肝细胞,GUNN大鼠的胆红素处理缺陷得到了部分纠正,尽管未结合(间接)胆红素的量尚未发生显著改变(图 三 H) ●●●●。 白蛋白血清浓度保持不变(图 三 一) ●●●●。
图3。 通过性别特异性染色体FISH和GUNN大鼠(2AAF/PHX模型)研究移植的雄性HSC形成胆管细胞和功能性肝细胞。
( A类 )男性肝脏切片上Y染色体(红色)的FISH作为阳性对照。 ( B类 )Y染色体FISH阳性的女性肝脏。 ( C类 )雄性肝脏中Y(红色)和X(绿色)染色体的FISH。 的成本( D类 )HNF4α(绿色)和( E类 )雄性HSC移植后,雌性宿主肝脏中Y染色体FISH(红色)出现panK。 箭头表示HSC衍生( D类 )肝细胞和( E类 )具有Y染色体的胆管细胞。 ( F类 )雌性宿主肝脏Y(红色)和X(绿色)染色体的检测。 箭头表示没有细胞融合的二倍体和四倍体HSC衍生的雄性肝细胞。 在受伤肝脏的门脉区(1区)拍摄显微图像。 ( 克 – 我 )将HSC移植到在2AAF存在下接受PHX的GUNN大鼠体内。 ( 克 )通过RT-PCR分析纯合GUNN大鼠移植HSC衍生的肝细胞的存在 Ugt1a1型 mRNA,然后酶切(BstNI)突变位点。 ( H(H) )4周后测定直接(红条)和间接胆红素(黄条)的血清浓度,并与GUNN大鼠(对照组)和正常大鼠的血清浓度进行比较,GUNN以类似方式处理但未移植HSC( n个 = 3–6; * P(P) < 0.05). ( 我 )测定正常大鼠以及有和无移植HSC的GUNN大鼠血清中的白蛋白浓度( n个 = 3–6). 比例尺:50μm( A类 – D类 和 F类 ); 20微米( E类 ).
移植HSC和导管反应(2AAF/PHX模型)。
导管反应被认为是干/祖细胞对严重肝损伤的反应,由K19形成 + 祖细胞和周围的间充质细胞。 这些导管在2AAF/PHX模型中短暂出现,并在PHX后第7天到第14天在再生肝脏中发现(图 4 ). 间充质标记蛋白,如波形蛋白和结蛋白在伴有导管反应的肝组织中高度表达(图 4 、A和B)。 表达中胚层蛋白波形蛋白和上皮标记物K19的前体细胞构成了导管的核心(图 4 ,C–F)被表达星形细胞标记结蛋白的细胞包围(图 4 G) 和巢蛋白(未示出)。 我们验证了K19中存在波形蛋白 + 通过免疫荧光和ELYRA超分辨显微镜(Zeiss)观察这些导管样结构中的细胞(图 4 、E和F)。 尽管结蛋白和K19表达细胞在这些结构中似乎有明显区别(图 4 G) ,超分辨显微镜显示K19中存在结蛋白残基 + 单元格(图 4 ,H和I),表明肝的假定祖细胞中存在间充质细胞和上皮细胞的中间状态。 我们发现移植的eGFP + 如eGFP的DAB免疫组织化学所示,肝再生第7天时,宿主肝脏中导管反应区域的HSC(2AAF/PHX模型)。 eGFP与祖细胞标记物K19和α-甲胎蛋白同时免疫组化染色表明移植的eGFP + HSC促进了推测的上皮祖细胞形成导管样结构(图 4 ,J–L)。 虽然我们发现HSC-衍生eGFP + 和K19 + 导管细胞间的细胞,eGFP的大多数 + 导管周围的细胞似乎是间充质组织(图 4 、J和K)。
图4。 移植eGFP + HSC参与导管反应(2AAF/PHX模型)。
( A类 – 我 )2AAF存在下PHX后肝脏导管反应期间间充质(波形蛋白和结蛋白)和上皮(K19)标记蛋白的免疫荧光。 同时检测门脉野导管结构中的波形蛋白(绿色)和结蛋白(红色)( A类 )低和( B类 )高倍放大。 K19(红色)和波形蛋白(绿色)的联合免疫荧光( C类 )低和( D类 )高倍放大。 超分辨显微镜( E类 )波形蛋白(绿色),显示波形蛋白残留物( F类 )在K19中 + 导管样结构中心的细胞(红色)。 ( 克 )门区内导管结构K19(红色)和结蛋白(绿色)的免疫荧光。 ( H(H) 和 我 )导管反应的结蛋白免疫荧光(绿色)通过超分辨显微镜和( H(H) )显示结蛋白残留( 我 )在K19中 + 导管样结构中心的细胞(红色)。 ( J型 – L(左) )移植eGFP的WT宿主肝eGFP(棕色)的DAB免疫组化研究 + HSC。 ( J型 )导管反应的上皮细胞由( J型 )K19和( L(左) )甲胎蛋白免疫荧光(黄色)。 HSC衍生eGFP + 包含的单元格( K(K) )K19(未显示免疫荧光) J型 )或( L(左) )α-甲胎蛋白用箭头表示。 所有显微图像均在受伤肝脏的门静脉区(1区)拍摄。 比例尺:200μm( A类 和 C类 ); 50微米( B类 , D类 , 克 ,以及 J型 – L(左) ); 10微米( E类 , F类 , H(H) ,以及 我 ).
HSC的再移植(2AAF/PHX模型)。
除了在肝脏中存在外,我们还发现移植的HSC植入(1%–2%; n个 = 5; 图 5 ,A和B)和HSC克隆(1%; n个 = 5; (未显示)在通过qPCR研究的宿主大鼠BM中 斯里 DNA和 电子GFP 尾静脉注射后7-14天,mRNA表达。 由于BM细胞可以在没有酶的情况下从长骨中轻轻分离出来,所以我们将此来源用于星状细胞的再移植实验。 FACS分类eGFP + HSC首先用CellTracker Red染色,然后在PHX后立即在2AAF存在下移植到WT大鼠体内。 移植后第1天,采集并培养宿主骨髓细胞。 新分离的HSC显示出强烈的CellTracker荧光(图 5 C) ,用于寻找移植的HSC衍生的eGFP + WT-BM电池之间的电池(图 5 ,D–F),在培养过程中最终转化为肌纤维母细胞样细胞(未显示)。 培养期间HSC衍生细胞中eGFP的表达保持不变(图 5 G) 并用于分析移植到新宿主大鼠(2AAF/PHX模型)14天后它们在肝脏和骨髓中的植入情况(图 5 、H和I)。 重新移植的eGFP + HSC衍生细胞能够重建约17%(±5%; n个 =3),如通过qPCR研究的 电子GFP mRNA。 eGFP的百分比 + 宿主肝脏不同区域的细胞不同(补充表1)。
图5。 移植eGFP的雕刻 + WT宿主动物BM中的HSC及其再移植(2AAF/PHX模型)。
的qPCR( A类 ) 斯里 DNA和( B类 ) 电子GFP HSC移植后14天内的mRNA( n个 = 5). 亲属 斯里 男性或eGFP BM样本的DNA或mRNA数量 + 大鼠(100%, n个 =4)和雌性或WT大鼠(0%, n个 =4)用于归一化。 ( C类 )分离HSC的荧光CellTracker(红色)染色。 通过维生素A荧光(蓝色)验证HSC身份。 ( D类 – F类 )电子GFP + 将CellTracker染色的HSC注射到WT大鼠(2AAF/PHX模型)中,并在移植后1天从BM中分离。 ( D类 )透射光显微镜和融合荧光( E类 )eGFP和( F类 )BM培养物的CellTracker(红色)染色。 箭头表示eGFP + 和CellTracker + HSC衍生细胞。 ( 克 )含eGFP的骨髓细胞 + HSC衍生细胞在培养中扩增,并且存在 电子GFP 14天后通过RT-PCR验证mRNA( n个 = 3). eGFP的BM + WT大鼠作为eGFP表达的阳性和阴性对照。 ( H(H) )电子GFP + 骨髓细胞培养中的HSC衍生细胞(如 克 )再次植入3只不同的WT大鼠(2AAF/PHX模型),并在( H(H) )肝脏和( 我 )14天后通过RT-PCR检测所有宿主动物的BM 电子GFP mRNA。 Hprt1(小时) mRNA用于证明所有样本中的mRNA数量相等。 比例尺:100μm( C类 – F类 ).
HSC移植(逆转录酶/PHX模型)。
来自eGFP的FACS分类HSC + 雄性大鼠也被注射到在逆转录酶存在下接受PHX治疗的WT雌性大鼠体内,逆转录酶可以阻止成熟肝细胞的增殖,从而促进移植细胞在受损肝脏中的植入。 在这个模型中,移植了eGFP + HSC形成约6%(±2%;范围1%-14%; n个 =7)宿主肝脏的qPCR研究 电子GFP mRNA(图 6 A) ●●●●。 移植eGFP的雕刻 + 当应用逆转录酶/PHX模型时,qPCR可在所有宿主大鼠中检测到HSC。 eGFP + 移植后14天,HSC在宿主肝的肝窦内保持为星状细胞(逆转录酶/PHX模型),如eGFP的DAB免疫组化和结蛋白的免疫荧光联合显示(图 6 B) ●●●●。 eGFP(快红)免疫组化和肝细胞标记物HNF4α免疫荧光显示移植eGFP + HSC也分化为肝细胞(图 6 C) ●●●●。 Y染色体FISH结合HNF4α免疫荧光(图 6 D) ●●●●。 当Y染色体探针与panK免疫荧光结合时,我们也在胆管细胞中发现了Y染色体(图 6 E) ●●●●。 我们发现,移植的雄性HSC能够在雌性宿主肝脏中生成肝细胞,而无需细胞融合,正如Y和X染色体的FISH所确定的那样(图 6 F) ●●●●。
图6。 移植eGFP + HSC有助于在逆转录酶存在下进行PHX的WT宿主大鼠的肝脏再生。
( A类 )移植eGFP衍生的细胞百分比 + 通过qPCR评估肝再生14天内雌性宿主肝脏中的雄性HSC 电子GFP 信使核糖核酸( n个 = 7). 转基因eGFP的寿命 + (100%, n个 =3)和WT大鼠(0%, n个 =3)用于归一化。 ( B类 )WT宿主肝脏(2区)eGFP(棕色)和结蛋白免疫荧光(黄色)的DAB免疫组化。 ( C类 )用eGFP的快速红色免疫组织化学(红色)结合HNF4α免疫荧光(黄色)鉴定移植eGFP衍生的肝细胞 + HSC。 Y染色体(红色)和( D类 )HNF4α免疫荧光或( E类 )雌性宿主肝脏(1区)中的panK(绿色)。 ( D类 )肝细胞和( E类 )箭头所示为移植的雄性HSC衍生的胆管细胞。 ( D类 )当HNF4α(绿色)和DAPI(蓝色)同时染色时,Y染色体(红色)呈白色。 ( F类 )用FISH同时检测雌性宿主肝脏中的Y(红色)和X(绿色)染色体。 箭头表示二倍体和四倍体肝细胞来源于未经细胞融合的移植雄性HSC(1区)。 比例尺:50μm( B类 , C类 ,以及 D类 ); 20微米( E类 和 F类 ).
MSC人群的体外肝分化。
移植HSC参与导管反应和HSC发育为肝细胞的潜力(图 2 、M和N以及图 三 D) 和胆管细胞(图 2 、K和L以及图 三 E) 增加了星状细胞在肝脏分化过程中可以瞬时获得肝祖细胞表达模式的可能性。 星状细胞最近被描述为肝旁MSCs( 8 )并显示出与克隆扩增HSC、大鼠骨髓间充质干细胞和脐血干细胞(UCBSC)类似的表达谱(补充图2)。 我们用肝细胞生长因子(HGF)和人成纤维细胞生长因子4(FGF4)处理这些MSC群体21天,以监测肝分化。 星状细胞或间充质标记物(波形蛋白、结蛋白、, 拉特 )、祖细胞和推测的肝干/祖细胞指标( K19号公路 , 电子凸轮 ,富含亮氨酸的重复性G蛋白偶联受体5[ Lgr5级 ],α-甲胎蛋白)和成熟肝细胞标记物(细胞色素P450 7A1[ Cyp7a1细胞 ], Hnf4a型 ,白蛋白)通过qPCR进行分析(图 7 和补充图3,A–C)。 波形蛋白、结蛋白和 拉特 在肝分化过程中稳定下降20%至30%(图 7 A和B,以及补充图3,A和B),表明只有一部分MSCs在体外分化。 相反 K19号公路 , 电子凸轮 , Lgr5级 在培养的HSC和其他MSC群体的肝分化过程中,α-甲胎蛋白在第14天短暂增加并达到峰值(图 7 ,C–F)。 肝细胞标志物的mRNA值 Cyp7a1细胞 , Hnf4a型 在所有MSC分化的第21天,白蛋白持续增加(图 7 ,G–I),表明最终分化为肝细胞谱系。 性别决定区Y框9的mRNA值( Sox9指数 )两种生长因子处理的原代培养HSC均减少(图 7 J) 和对照组(补充图3C),而 Sox9指数 HSC克隆和其他MSC群体的水平在所有实验介质中保持不变(图 7 J) ●●●●。 这可能表明 Sox9指数 明显不参与肝分化。 都不是祖细胞( K19号公路 , 电子凸轮 ,或α-甲胎蛋白)或肝细胞标记物( Cyp7a1细胞 , Hnf4a型 如补充图3D中的白蛋白表达所示,在21天的培养过程中,通过qPCR在没有生长因子的对照组中检测到。 我们通过使用大鼠特异性白蛋白酶联免疫吸附试验(ELISA)对MSCs培养上清液中的白蛋白进行定量,确认了肝细胞样细胞的出现(图 7 K) ●●●●。 与HSC相比,肌肉成纤维细胞在生长因子治疗21天后无法通过白蛋白mRNA表达或蛋白质合成作出反应(补充图3、D和E)。 此外,胆汁酸(如胆酸、鹅去氧胆酸、熊去氧胆汁酸和α/ω-鼠胆酸)释放到培养上清液中,表明所有MSC群体在生长因子治疗期间获得了肝细胞特异性功能(图 7 ,L–O)。 在经HGF和FGF4处理的MSCs培养基中,29个被调查胆汁酸中的19个通过超高效液相色谱-串联质谱(UHPLC-MS/MS)检测(补充图4-7), 而在无细胞因子的对照条件下,在21天内未发现胆汁酸合成(补充图3F和补充表2-5)。 除了 Sox9指数 HSC克隆中的表达-BM-MSCs和UCBSCs保持不变(图 7 J) -基因表达、白蛋白合成和胆汁酸合成的所有趋势均显著,如ANOVA所示(图中未显示 7 ; 参见补充图3)。
图7。 间充质干细胞在分化为肝细胞的过程中瞬时获得肝祖细胞的基因表达。
( A类 – O(运行) )用含有HGF和FGF4的肝细胞分化培养基处理大鼠新鲜分离的HSC、克隆扩增的HSC(克隆1E7、4E7和3F8)、BM-MSC和UCBSC(克隆1 G11)21天。 的表达式( A类 )波形蛋白( B类 )结蛋白( C类 ) K19号公路 , ( D类 ) 电子凸轮 , ( E类 ) Lgr5级 , ( F类 )甲胎蛋白( 克 ) Cyp7a1细胞 , ( H(H) ) Hnf4a型 , ( 我 )白蛋白,以及( J型 ) Sox9指数 用qPCR分析。 每隔一周采集mRNA样本。 分化实验开始时细胞的基因表达表示为第1天。 ( K(K) )为了验证肝分化,还通过大鼠特异性白蛋白ELISA法在HSC、HSC克隆、BM-MSCs和UCBSC的培养上清液中测量肝细胞标记白蛋白。 通过胆汁酸定量测定MSC衍生肝细胞样细胞的肝功能( L(左) )胆酸( M(M) )鹅去氧胆酸( N个 )熊去氧胆酸,以及( O(运行) )通过UHPLC-MS/MS在培养上清液中的ω/α-木里酸。在分析之前,允许胆汁酸在培养基中积累2天。 条形值表示算术平均值,并进行插值以指示每个单元格组的趋势(彩色线)。 表达谱、白蛋白合成和胆汁酸释放在3个独立实验中测定( n个 = 3).
我们还利用结蛋白与K19、α-胎蛋白或LGR5的联合免疫荧光,研究了原代培养HSC分化实验中假定祖细胞的瞬时出现。 HGF和FGF4处理后14天,含有K19丝、α-胎蛋白或LGR5的小细胞显示结蛋白丝(图 8 ,A–C)。 在对照条件下,肌纤维母细胞样细胞(通常由培养激活的星状细胞发育而来)中仅检测到LGR5,而K19和α-胎蛋白仍然无法检测到(图 8 ,D–F)。 在我们开始生长因子治疗后21天,通过胆汁盐输出泵(BSEP)、牛磺胆酸钠共转运多肽(NTCP)和K18的免疫荧光鉴定HSC原代培养物中残留结蛋白丝的肝细胞样细胞(图 8 ,G–L)。 在没有HGF和FGF4的对照实验中,HSC衍生的肌成纤维细胞表达结蛋白,但在培养21天内BSEP、NTCP和K18仍为阴性(图 8 ,M–O)。 总之,我们发现星状细胞和其他间充质干细胞在分化为肝细胞(内胚层)的过程中降低了其中胚层特征,并伴有祖细胞标志物的短暂出现(补充图8)。
图8。 分离的HSC在分化为肝细胞样细胞的过程中形成间充质细胞和上皮细胞的中间状态。
联合免疫荧光( A类 )K19和( B类 )甲胎蛋白以及( C类 )用HGF和FGF4处理原代HSC培养物14天后,LGR5(红色)和中胚层纤维蛋白结蛋白(绿色)。 带有共同表达结蛋白的K19、α-胎蛋白或LGR5的小细胞用箭头表示。 不含生长因子的HSC(对照组)也通过免疫荧光分析( D类 )K19( E类 )甲胎蛋白,或( F类 )培养14天后,LGR5(红色)与结蛋白(绿色)结合。 HSC的肝分化通过免疫荧光分析( 克 )BSEP、( H(H) )NTCP,以及( 我 )K18(红色),生长因子处理21天后。 ( 克 – L(左) )为了研究新形成的肝细胞样细胞与HSC的关系,用免疫荧光(绿色)染色结蛋白残基。 ( J型 )透射光显微镜和单免疫荧光通道( K(K) )K18(红色)和( L(左) )肝细胞样细胞的结蛋白(绿色) 我 .联合免疫荧光分析( M(M) )BSEP、( N个 )NTCP,以及( O(运行) )K18(红色)和结蛋白(绿色)也在培养21天的HSC中进行,无需生长因子处理(对照)。
讨论
这项研究首次证明,据我们所知,HSC是可移植的,是宿主动物肝脏的家园,通过分化为实质细胞和胆管细胞而参与肝脏再生,而无需细胞融合。 移植的HSC能够改善GUNN大鼠的葡萄糖醛酸化缺陷,如血清结合胆红素水平增加和这些动物肝脏中出现非突变UGT1A1酶所示。 这证实了星状细胞对功能性肝细胞形成的贡献,尽管宿主GUNN大鼠的血清总胆红素浓度没有显著降低。 胆红素处理缺陷的完全解决可能需要更多的HSC移植和额外的胆红素清除时间。 除了从新分离的HSC获得的这些结果外,还建立了HSC的单细胞克隆,该克隆保留了星状细胞的特征和分化能力,表明HSC具有自我更新的潜力。 这些重要的干细胞特征进一步支持星状细胞作为肝旁MSCs的特征( 8 , 16 ). 正如本研究所证明的那样,根据其作为MSCs的特征,移植的HSC在宿主动物的BM中也被发现植入。 据报道,骨髓或脂肪组织中的间充质干细胞有助于肝脏修复( 25 – 27 )表明肝分化能力是MSCs的一般特征。 尽管波形蛋白等中胚层蛋白是由祖细胞和上皮标记物表达的,但目前对于具有中胚层特征的干细胞对肝脏上皮组织再生的直接作用尚无共识( 35 ). 假设具有上皮特性的干细胞是肝祖细胞的来源( 34 )确保肝细胞增殖受损时的组织修复( 32 , 33 ). 与此一致,上皮标记物如K19和EPCAM在导管反应中表达( 35 )被描述为干/祖细胞反应( 36 ). 然而,迄今为止,在肝祖细胞中同时出现上皮和中胚层蛋白的现象仍不清楚。 如本研究所示,移植eGFP + HSC有助于K19的形成 + 和α-甲胎蛋白 + 导管反应期间的细胞,表明MSCs可以在体内生成祖细胞。 此外,如前所述,在胶原上培养的分离HSC可以形成管状结构( 16 ). 我们通过时间分辨肝分化实验解释了前体细胞中间充质和上皮蛋白的同时表达。 在HSC、HSC克隆、BM-MSCs和UCBSC的体外分化过程中,所有MSC群体在分化为肝细胞的过程中从中胚层向内胚层表达模式转变。 在这一中间阶段,它们暂时共存于间充质和上皮标记物,这在祖细胞中是常见的。 此外,我们发现最近描述的肝干细胞标记物LGR5( 37 )在MSCs肝分化过程中短暂上调。 一方面,这些发现与观察到的移植HSC对导管反应的贡献以及K19中胚层蛋白残基(波形蛋白和结蛋白)的出现相一致 + 另一方面,体内的祖细胞表明MSC群体参与了祖细胞形成和肝脏修复。 Desmin公司 + 和巢蛋白 + 围绕导管结构的细胞中心有肝祖细胞( 38 )显示MSC的存在。 本研究表明,肝祖细胞可以来源于肝旁星状细胞和其他MSC群体,这些细胞可能在严重损伤后从远处器官迁移到肝脏,以支持再生。 因此,如最近所述,围绕导管反应的间充质细胞可能不仅影响祖细胞的分化( 36 ),但也可能对其人口有所贡献。 有证据表明肝细胞和胆管前体细胞来源于Hering管内的干细胞( 39 )门脉区出现导管反应。 MSC群体是否总是有助于祖细胞的形成,还是仅在极端条件下,这仍是一个尚未解决的问题。 通过酶分离将HSC从Diss空间的小生境中移除,并通过循环将其移植到再生肝脏中,这会造成一种极端的情况,从而促进其分化。 此外,如本研究所示,损伤模型会影响实验的结果。 我们发现2AAF/PHX模型中移植HSC的植入率高于逆转录酶/PHX模式。 环境明显控制移植HSC的行为,其反应至少有三种方式:(a)HSC保持激活并产生细胞外基质和影响邻近细胞的因素; (b) 激活的HSC可以再次静止; 和(c)HSC分化为上皮细胞。 后两种可能性可以解释 第1a2列 , 第4a1列 ,以及 学报2 尽管移植的HSC增殖,但在宿主肝脏中的表达。 尽管最近的血统追踪研究中出现了争议( 17 – 19 )或反对( 20 , 21 )本研究获得了HSC对肝再生的贡献、HSC作为肝旁干细胞的特性及其对组织修复的贡献的证据。 这些发现与之前的研究结果并不矛盾,因为慢性肝病肯定会影响它们的行为,MSC也应该如此( 40 ). 关于前体细胞中的间充质和上皮特征,最近的一项研究表明,促精蛋白-1的作用 + /K19号公路 + 具有中胚层纤维化标志物的肝祖细胞在胆道闭锁中的作用( 41 ). 未来的研究应探讨MSC群体是否与Hering管内的干细胞生态位有关,并有助于祖细胞的形成。 如本研究所示,在导管反应中监测MSC群体的肝分化和上皮细胞中的中胚层蛋白,以及最近的血统追踪实验 学报2 发起人( 18 , 19 ),支持这种可能性。
方法
细胞分离和培养。
补充方法中提供了细胞分离和培养以及FACS协议的详细说明。
肝损伤与HSC移植。
在进行上述PHX前7天,将含有2-乙酰氨基芴(70 mg,2AAF 14天释放;美国创新研究)的颗粒植入WT Wistar大鼠(250 g)(海因里希·海因大学动物设施)的颈部皮肤下( 42 , 43 ). 电子GFP + 来自Wistar-TgN(CAG-GFP)184岁大鼠(美国密苏里州哥伦比亚密苏里大学鼠资源与研究中心)的HSC通过密度梯度离心法富集( 44 )经维甲酸依赖性FACS纯化,最后在PHX后立即通过尾静脉注射移植到WT雌性Wistar大鼠体内。 约700000±100000个HSC或来自男性eGFP的克隆性扩张HSC + 将大鼠注射到每只肝损伤大鼠体内。 将HSC移植到正常和突变的Wistar大鼠品系(GUNN-UGT1A1 j/BluHsdRrrc ; 老鼠资源与研究中心)( 45 ). 纯合子突变体缺乏UGT1A1酶活性,血清胆红素水平升高。 Heinrich Heine大学中央医院实验室在HSC移植4周后测定大鼠血清中的直接(结合)和间接(非结合)胆红素以及白蛋白浓度。 对于再移植实验,FACS分类eGFP + HSC用10μM CellTracker Red染色( C34552号 ; Invitrogen)在37°C无血清条件下悬浮45分钟。 通过反复离心去除多余的染料后,将约10万个双标记HSC移植到PHX后立即接受2AAF治疗的WT大鼠体内。 移植后1天收获宿主动物的BM细胞,培养14天,然后移植到用2AAF和PHX预处理的其他WT大鼠(约1000万个细胞)中。 在另一个损伤模型中,雌性WT Wistar大鼠(250 g)每隔14天接受2次静脉注射逆转录酶(R0382-100MG;Sigma-Aldrich)(30 mg/kg)。 额外4周后,进行PHX( 46 )和FACS排序的eGFP + 如上所述,移植雄性Wistar大鼠的HSC。
细胞分化。
50 ng/ml FGF4(100-31;PreproTech)和40 ng/ml人HGF(100-39;PreproTech)溶解在补充1%胰岛素-转铁蛋白-亚硒酸钠(ITS)(I1884;Sigma-Aldrich)的Iscove改良Dulbecco培养基(12440-046;Invitrogen)中,诱导分离的HSC、HSC克隆、BM-MSCs和UCBSC分化, 来自牛血清的1%亚油酸白蛋白(L9530;Sigma-Aldrich)和1%抗生素抗真菌溶液(Invitrogen)。 分化培养基每隔第二天至第三天更换一次。 对照实验中的细胞在相同的培养基中培养,但没有FGF4和HGF。 每周监测细胞分化的进展。
分析细胞和组织切片。
用冰镇甲醇或4%福尔马林将肝脏的分离细胞和冰冻切片固定5分钟或10至20分钟,并与GFAP(MAB3402;Millipore)、K18(BM2275P;Acris)、K19(NB100-687;Novus Biologicals或65129;ProGen Biotechtick)、panK(CM162;Biocare Medical)、desmin(ab8592;Abcam)、, 用于免疫荧光染色的vimentin(M0725;Dako)、nestin(sc-33677;Santa Cruz Biotechnology Inc.)、LGR5(GTX62071;GeneTex)和HNF4α(3113;细胞信号技术)。 抗NTCP和BSEP的主要抗体由B.Stieger和P.Meier(瑞士苏黎世苏黎世大学医院)提供。 适当的二次菁染料3(Cy3)或FITC-标记抗体(AP182C、AP162C、AP192F和AP182F;密理博)和DAPI( 第36935页 ,加长黄金; Invitrogen)分别用于标记初级抗体和细胞核。 移植eGFP + 使用单克隆(2956,D5.1 XP;细胞信号技术)和多克隆抗体(210-PS-1GFP;ImmunoKontact)在福尔马林固定和Triton X-100处理(PBS中0.1%,3051.3,Carl Roth GmbH)的肝脏冷冻切片上通过免疫组化检测HSC 抗eGFP,然后用与碱性磷酸酶或HRP偶联的二级抗体标记(K5361,EnVision G|2双染色系统兔/鼠;Dako)。 多克隆eGFP抗体和用于检测eGFP的二级抗体与WT大鼠的肝匀浆预先孵育至少30分钟,以防止非特异性结合。 使用含有左旋咪唑的用于阻断内源性碱性磷酸酶的快速红色片(11496549001;罗氏)制备碱性磷酸酶底物溶液。 用稀释苏木精溶液(蒸馏水中1:4)(1.05175;默克)在快速红色染色的肝脏切片上对细胞核进行复染。 用蒸馏水和自来水清洗苏木精溶液。 电子GFP + 细胞类型通过抗HNF4α、K19或结蛋白的抗体进行鉴定,随后通过与荧光染料偶联的适当二级抗体进行标记。 对于逆转录酶PCR(RT-PCR),从至少4个不同的肝叶采集组织样本,并使用RevertAid H Minus第一链cDNA合成试剂盒(K1632;Thermo Scientific)从每20μl反应体积1μg总RNA中制备第一链cDNA。 根据标准方案,使用2xPCR Master Mix(K0171;Thermo Scientific)、0.8μmol/l引物(补充表6)和每25μl反应体积1或5μl模板cDNA进行PCR。 使用最多20或35个循环来扩增PCR产物。 根据制造商的说明,使用SensiMix SYBR No-ROX试剂盒(QT650-05;Bioline)进行实时qPCR。 为了评估男性HSC移植后的植入情况,使用DNeasy Blood&Tissue Kit(69581;QIAGEN)纯化总DNA。 为了扩增PCR产物,每个反应取12.5 ng cDNA或500 ng DNA和0.6μmol/l引物(补充表7)。 在95°C初始变性后,在58°C下进行退火,并在72°C下使用40个循环和TOptical Cycler(Analytik Jena AG)进行伸长率。 所有样品均测量了三份,次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶1( Hprt1(小时) 分离细胞的mRNA)或β-肌动蛋白(肝组织的DNA)被用作2 –ΔΔCt 方法。 根据制造商的建议,通过大鼠特异性白蛋白ELISA(E110-125;Bethyl Laboratories)对培养上清液中的大鼠白蛋白进行定量。 为了检测正常和GUNN大鼠肝脏中的UGT1A1酶 Ugt1a1 根据制造商的说明,用BstNI限制酶(新英格兰生物实验室)切割mRNA,并用琼脂糖凝胶(3%)分离。 如前所述,用Carnoy固色剂固定肝脏切片15分钟,用胃蛋白酶(10108057001;罗氏)消化组织5分钟后,使用大鼠Y(IDRR1070;IDLabs)和X(IDRF1067;IDLab)染色体的DNA探针进行FISH分析( 24 ).
胆汁酸及其结合物的分析。
采用UHPLC-MS/MS分析HGF和FGF4处理细胞培养上清液中的胆汁酸。 UHPLC-MS/MS系统由UPLC-H级与Xevo TQ-S三四重质谱仪(Waters)耦合组成。 在负电离模式下进行电喷雾电离。 在UPLC HSS C18柱(Waters)(2.1×100 mm,1.8μm)上进行色谱分离。 流动相由含有0.1%甲酸和5mM乙酸铵的水(洗脱液A)和乙腈(洗脱液B)组成。 通过梯度洗脱分离分析物。 注射体积为5μl,柱保持在40°C。 在选定的反应监测(SRM)模式下检测胆汁酸及其甘氨酸和牛磺酸结合物。 所有标准品以及氘化内标物(IS)物质(d4-CA、d4-GCA和d4-GCDCA)均购自Sigma-Aldrich和Steraloids。
统计。
通过ANOVA或Mann-Whitney确定大鼠白蛋白ELISA和qPCR获得的数据的重要性 U型 测试,数据在 P(P) 值小于0.05。 至少3个独立实验的结果以百分比表示为平均值。 方差指定为平均值±SEM。
研究批准。
所有动物程序均已获得相关联邦动物保护局(德国雷克林豪森州北莱茵-威斯特法伦,Umwelt und Verbraucherschutz Nordrhein-Westfalen,Landesamt für Natur;参考号9.93.2.10.34.07.163和84-02.04.2012.A344)的批准,动物根据德国动物福利法得到照顾。
致谢
作者感谢海因里希·海因大学的Claudia Rupprecht(胃肠病、肝病和传染病临床)和Katharina Raba(移植诊断和细胞治疗研究所)提供的专家技术援助。 我们感谢大鼠资源与研究中心(P40OD011062)提供GUNN大鼠和eGFP表达大鼠。 转基因eGFP + 大鼠由Eiji Kobayashi(日本东京医科大学先进医疗技术开发中心)制造。 这项工作得到了德国研究基金会(DFG)通过合作研究中心SFB 974(“肝脏损伤和再生期间的通信和系统相关性”,德国杜塞尔多夫)的支持。
脚注
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