摘要
谷氨酸脱氢酶(GDH)催化谷氨酸可逆转化为α-酮戊二酸,伴随NAD(P)的还原+NAD(P)H或反之亦然。GDH活性受到包括底物抑制在内的复杂变构调节。为了原位测定GDH动力学,我们评估了不同谷氨酸浓度与辅酶NAD结合的影响+或NADP+利用代谢图谱研究小鼠肝脏冷冻切片中GDH活性。北美+-依赖GDH V最大值比NADP高2.5倍+-依赖V最大值,而K米相似,当NAD为1.92 mM时为1.66 mM+或NADP+分别使用。辅酶V最大值在10 mM谷氨酸浓度下测定,在较高谷氨酸浓度和K我第12.2条和第3.95条(适用于NAD)+和NADP+分别用作辅酶。北美+-和NADP+-在各种小鼠组织中检测依赖性GDH活性。GDH活性在肝脏中最高,在其他组织中更低。在所有组织中,NAD的活性最高+用作辅酶。总之,含有NAD的小鼠肝脏中GDH活性最高+作为辅酶,在谷氨酸浓度为10 mM时测定GDH活性最高。
材料和方法
鼠标示例
雄性对照野生型C57BI/6J小鼠的各种组织来自学术医学中心动物研究所。将小脑、肝脏、肾脏、胰腺、舌头、小肠、结肠、胃、脾脏、肺、心脏和骨骼肌组织在液氮中快速冷冻,并在-80℃下储存。按照《人类护理和使用实验动物机构标准》对动物进行治疗。机构动物护理和使用委员会批准了这些实验。除肺外,所有组织的未固定冷冻切片均在-20℃下切割,标称厚度为7µm,并在-80℃下保存。肺冷冻切片的标称厚度为8µm。在代谢绘图之前,组织切片在室温下风干30分钟。
代谢图谱
我们使用四氮唑盐来绘制脱氢酶活性的代谢图谱(图2). 在这种方法中,脱氢酶,在这种情况下是GDH,减少NAD(P)+NAD(P)H还原介质中的电子载体,随后将水溶性微黄色硝基蓝四唑(NitroBT)还原为不溶于水的蓝色甲醛沉淀。因此,GDH活性部位沉淀的甲素的吸光度是GDH活性的直接测量值(Chieco等人,2013年;Van Noorden 2010年;Jonker等人,1996年;Van Noorden和Frederiks 1992年). 当使用未固定的冷冻切片时,该方法能够评估其完整细胞微环境中的GDH活性。化学固定影响(通常抑制)酶的活性。为了正确定位所生成的甲胎素的酶活性,在酶孵育期间必须将大分子保存在组织切片中(Van Noorden 2010年;Van Noorden和Vogels 1989年). 实现这一点的最佳方法之一是向培养基中添加水溶性聚合物聚乙烯醇(PVA)。在含有聚乙烯醇的介质中,小分子(如底物和辅酶)可以自由扩散,而大分子(如蛋白质)则不能。此外,PVA保持组织形态完整。这种方法确保酶的翻译后修饰及其微环境尽可能保持完整。
为了绘制GDH活性的代谢图,将三只小鼠的肝组织切片在37℃的温度下,在含有18%PVA(西格玛-阿尔德里奇,密苏里州圣路易斯)的水溶液中,在0.1 M磷酸盐缓冲液(pH 8;默克,德国达姆施塔特)中孵育30分钟,该缓冲液含有5 mM硝基BT(西格马-阿尔德里希),3 mM NAD+或NADP+(瑞士巴塞尔罗氏公司)、2 mM ADP(罗氏)、0.32 mM甲磺酸吩嗪(PMS;德国海德堡Serva)和0-50 mM我-谷氨酸(Sigma-Aldrich)。每个小鼠肝脏的三个切片用于测试每个谷氨酸浓度。对于所有进一步的实验,使用10 mM谷氨酸,每个小鼠使用一个组织切片。在没有谷氨酸、ADP或NAD(P)的情况下进行对照反应+.
PMS原液在黑暗中保持在4C。NAD的所有其他储备溶液+、NADP+,ADP、NitroBT和谷氨酸盐在孵育前新鲜制备。通过加热NitroBT,将其溶解在等量的100%乙醇和二甲基甲酰胺中,最终浓度为2%v/v(0.34 M乙醇和0.26 M二甲基甲胺)。
培养后,使用0.1mM磷酸盐缓冲液(pH 5.3)在60℃下冲洗组织切片30分钟,以立即停止酶反应并直接从切片中去除粘性培养基。然后,用自来水和蒸馏水冲洗切片,并在热板上干燥。干燥后,将组织切片包埋在甘油果冻中作为固定介质(丹麦格罗斯特拉普达科)。
图像分析
根据Chieco等人(2013)使用ImageJ(NIH,Bethesda,MD)获得所有组织的图像(Abrámoff等人,2004年;Schneider等人,2012年)在装有20倍物镜(日本东京奥林巴斯)和Scion cfw-1312灰度相机(亚利桑那州图森市Scion)的Vanox-T显微镜上。记录组织中的以下区域:肝、门脉周围和小叶中央周围区域;胰腺、外分泌组织;肾、皮质;大脑皮层;小脑、分子层、颗粒细胞层、浦肯野细胞层和白质;胃、胃腺;小肠,绒毛;结肠、隐窝;骨骼肌、肌肉组织;脾、红、白髓;肺,肺泡;心脏、肌肉组织;舌头、骨骼肌。每个组织切片测量一个面积(对于小肠,测量两个面积)。以1360×1024像素的分辨率记录图像。用白光照射样品,并通过红外阻挡滤光片进行过滤(Chieco等人,2013年;Jonker等人,1997年). 为了专门记录甲霜的吸光度,使用了585-nm单色滤光片(屠夫1978). 在记录吸光度测量值之前,使用10步校准玻片进行校准(Chieco等人,2013年). 在可能的情况下,对连续切片中的相同区域进行分析。当这不可行时,对可比区域进行了分析。使用ImageJ插件ObjectJ选择图像中感兴趣的区域,并确定平均吸光度作为原位GDH活性的测量值。
统计分析
使用ImageJ获得的所有样品的平均吸光度值在对照反应中进行非特异性染色校正,并使用Excel 2013(Microsoft Corporation,Redmond,WA)根据Lambert-Beer定律转换为μmol/mL/min(Van Noorden和Frederiks 1992年). 该定律规定,A=¦Β·c·d,其中A为吸光度,¦Β为消光系数(585nm时为16000),c为甲酰胺浓度,d为光传播距离(截面的标称厚度为7或8μm,标准偏差为0.7µm)(De Witt Hamer等人,2006年;屠夫1978). 使用Graphpad Prism 6(Graphpad软件,加利福尼亚州拉霍亚)进行统计分析。在Graphpad Prism 6中使用霍尔丹方程进行底物抑制曲线拟合。
结果
小鼠肝脏GDH动力学
为了确定GDH动力学,用八种不同的谷氨酸浓度(0、0.4、1.4、2、5、10、30和50 mM)和NAD对小鼠肝组织切片进行GDH活性的代谢绘图+(图3)或NADP+(图4)作为辅酶。K系列米当NAD时,谷氨酸的GDH值相似+或NADP+用作辅酶(图5;表1),而V最大值GDH与NAD+比NADP高2.5倍+.V型最大值和K米在3 mM NAD时最理想+或NADP+(未显示数据)。GDH在NAD存在下均表现出底物抑制+和NADP+作为辅酶。离解常数(K我)NAD对谷氨酸的抑制作用分别为12.2 mM和4.0 mM+或NADP+分别用作辅酶。这些K我数值表明,当NAD作用于GDH时,其底物谷氨酸对GDH的抑制作用较小+与NADP相比用作辅酶+虽然这种效果并不显著(学生t吨-测试,第页=0.29). 此外,当NADP作用于谷氨酸浓度较高时,GDH活性被完全抑制+用作辅酶,但当NAD+用作辅酶(图5). 谷氨酸不会影响培养基的pH值。因此,高谷氨酸水平下GDH活性降低并不是由pH值降低引起的。图5显示GDH V最大值在培养基中以10 mM的谷氨酸浓度测定。
表1。
|
GDH+NAD+
|
GDH+NADP+
|
V(V)最大值
|
1.26 |
0.51 |
K(K)米
|
1.92 |
1.66 |
K(K)我
|
12.2 |
3.95 |
GDH活性在肝脏中的分布
特异性GDH活性均匀分布于肝小叶的门脉周围和中央周围区域。试验和对照反应都表明,在中心周围区域有更多的甲赞形成(图3和4)而减去对照反应的特异性试验表明,门脉周围和中央周围区域的GDH活性没有差异。此外,当NAD激活时,在GDH活性的门脉周围和中央周围区域中formazan形成的定位模式没有发现差异+或NADP+用作辅酶(图3和4).
小鼠不同组织中GDH的活性
用NAD测定不同小鼠组织中的GDH活性+或NADP+作为辅酶(图6). 肝脏具有最高的GDH活性(NAD时,肝脏的活性至少是其他组织的4.5倍+用作辅酶,与NADP的比例至少为3.5倍+作为辅酶)。NADP公司+-依赖性GDH活性仅见于肝脏和胰腺。带有NAD+作为辅助因子,小脑、小肠和心脏也有活性。
致谢
我们感谢M.Arendse准备了手稿,感谢A.Jonker博士在图像分析方面的帮助。我们还感谢R.J.Molenaar、M.M.J.Laan和D.Huiskens对手稿的批判性阅读。
脚注
利益冲突声明:作者声明,与本文的研究、作者身份和/或出版没有潜在的利益冲突。
基金:作者没有获得对这篇文章的研究、作者身份和/或出版的资金支持。
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