血管生态位平衡肝脏再生和纤维化的血管分泌信号发散

尽管肝脏具有再生能力，但慢性或过度损伤往往会导致肝纤维化，最终导致肝硬化和肝衰竭^1–7肝脏修复的综合过程包括以细胞外基质（ECM）蛋白的合成为特征的再生和伤口愈合。这两个过程都受到实质性肝细胞和非实质性细胞（NPC）之间动态相互作用的调节^7,22,24,25包括肝星状细胞^1,23、炎症细胞^6,8胆道上皮细胞和肝窦内皮细胞^9,13,15,16因此，定义平衡再生和功能失调（适应不良）愈合的多细胞串扰⁵有望为肝脏疾病设计治疗方案。

排列肝窦血管的LSEC以超出其代谢产物传递被动作用的方式诱导肝器官发生^9,12,14,15通过部署旁分泌生长调节剂（我们将其定义为血管分泌因子），LSEC触发肝细胞再生^9–11,25,26然而，在慢性损伤的情况下，LSEC的异常激活会导致纤维化^16,17LSEC在介导肝脏修复中的生态位功能的这种二分法表明，不同的血管分泌信号平衡再生和纤维化¹¹因此，我们试图破译将LSEC的促再生能力破坏为促再生状态的机制。

作为对组织损伤的反应，细胞因子和趋化因子，如基质衍生因子（SDF）-1（Cxcl12）上调，通过其受体CXCR4和CXCR7启动再生^18–21虽然造血细胞和血管细胞中的CXCR4激活都调节血管生成和造血，但另一种SDF-1受体CXCR7的表达主要局限于内皮细胞，其功能主要被认为在血管模式和肿瘤新生血管生成中起关键作用。然而，在明确的肝损伤环境中缺乏细胞类型特异性遗传模型，阻碍了SDF-1途径协调肝脏修复的机制的阐明。

为了揭示LSEC在调节肝脏修复中的不同作用，我们采用了一次性注射四氯化碳（CCl₄)以及导致急性肝损伤的对乙酰氨基酚，以及反复CCl的慢性损伤模型₄注射和胆管结扎(图1a). 值得注意的是，在单次CCl后的第2天₄损伤，CXCR7在VE-cadherin中特异性上调⁺LSEC公司(图1b-e,补充图1). 相反，CXCR4在其他细胞类型中广泛表达，CCl后其在LSEC上的表达相对稳定₄受伤。因此，我们已经确定CXCR7是一种诱导性LSEC特异性SDF-1受体，用于肝脏损伤反应。

我们的团队^9,10和其他¹³已有研究表明，肝部分切除后，LSEC通过产生血管分泌因子，如Wnt2和肝细胞生长因子（HGF），诱导肝再生。LSEC中转录因子Id1的激活对这一过程至关重要⁹SDF-1在培养的人类LSEC中诱导Id1上调，这一上调被两种基因沉默所消除抄送7或Cxcr4号机组(图1f,补充图2、3). 值得注意的是，CXCR7-选择性激动剂TC14102同样诱导Id1上调。免疫沉淀Western blot（IP-WB）表明，在SDF-1刺激后，CXCR7与LSEC中的CXCR4和β-抑制素相关(补充图4). 因此，SDF-1通过CXCR7和CXCR4之间的合作刺激Id1诱导^27,28.

为了确定CXCR7在LSEC介导的肝脏修复中的作用，我们使用他莫昔芬诱导的EC特异性Cre^ERT2系统系统拆除抄送7在成年小鼠的内皮细胞中(图1g). 窝藏老鼠LoxP公司场地两侧抄送7与VE卡芯^ERT2系统EC-特异性小鼠VE-卡德林促进剂驱动Cre公司^ERT2系统使用携带td番茄荧光蛋白的小鼠，用漂浮的终止密码子来排除VE卡芯^ERT2系统其他肝细胞类型。特异性激活的三苯氧胺注射液Cre公司^ERT2系统内皮细胞中的活性，但不表达去糖蛋白的星状细胞(图1h,补充图5)，证明诱导的EC特异性缺失抄送7(抄送7^iΔEC/iΔEC)英寸VE卡-Cre公司^ERT2系统抄送7^{液氧磷/液氧磷}老鼠。抄送7-单倍体成年小鼠(抄送7^iΔEC/+)用作Cre毒性的对照。

与对照小鼠相比抄送7^iΔEC/iΔECCCl后小鼠数量显著减少₄受伤(图1i，j). 血管分泌因子HGF和Wnt2的Id1依赖性部署抄送7^iΔEC/iΔEC两次CCl后，小鼠数量减少₄和对乙酰氨基酚引起的肝损伤(图1k). 血清丙氨酸氨基转移酶（ALT）水平测定的肝损伤程度加重(图1l,补充图6). 因此，肝损伤后，SDF-1通过CXCR7的激活⁺LSEC触发血管分泌反应以启动肝脏再生(图1m).

虽然肝细胞在急性肝损伤后再生，但慢性肝损伤更频繁地导致肌成纤维细胞的明显激活并导致纤维化^2,三,5为了解决LSEC的促再生血管分泌信号如何被转移以刺激这种不适应的愈合，我们采用了重复CCl的慢性小鼠肝损伤模型₄注射²⁹(图2a、b). 值得注意的是，慢性损伤后CXCR4上调可抵消LSEC中的CXCR7-Id1通路(图2c-e,补充图7、8). 重复CCl后₄注射后，α-平滑肌肌动蛋白（SMA）和ECM蛋白胶原的蛋白水平在抄送7^iΔEC/iΔEC小鼠与对照小鼠的比较(图2f-h,补充图9-10). 值得注意的是，注射CXCR7-特异性激动剂TC14102降低了对照组SMA和I型胶原的上调，但没有抄送7^iΔEC/iΔEC老鼠(图2g-h,补充图11). 因此，慢性肝损伤会干扰LSEC中的促再生CXCR7-Id1血管分泌途径，并促进纤维化。

检测LSEC中CXCR7在解决肝纤维化方面的需求^6,23.三次CCl后₄注射后，对照组小鼠的SMA和胶原蛋白水平增强，并在最后一次注射后的第8天达到峰值，在第20天接近基础水平（车辆注射组）(图2i-j,补充图12-13). 相比之下，肝损伤的时间依赖性分辨率在抄送7^iΔEC/iΔEC老鼠。重复注射CCl抑制Id1通路₄由CXCR7激动剂TC14102诱导(图2k). 因此，在对损伤的反应中，LSEC中的CXCR7通路在刺激再生和解决纤维化方面发挥着不可或缺的作用。反复刺激后，CXCR4通路优于CXCR7-Id1通路导致纤维化(图2l).

然后我们采用胆管结扎术（BDL），一种临床相关的肝胆汁淤积模型，来确定CXCR4和CXCR7如何调节LSEC的原纤维化转变(图3a). BDL会导致胆道上皮损伤，并导致持续胆汁淤积和肝硬化。BDL后，LSEC通过窦周结蛋白进行投资⁺星状细胞(图3b). 类似于重复的CCl₄损伤后，LSEC中CXCR4暂时上调，CXCR7-Id1通路受到抑制(图3c). 值得注意的是，SMA沉积在抄送7^iΔEC/iΔEC小鼠高于对照组抄送7^iΔEC/+老鼠(图3d-f). 因此，在BDL诱导的胆汁淤积性损伤期间，LSEC中CXCR7信号的丢失导致纤维化。

然后用血管生成因子VEGF-A和FGF-2刺激人LSEC，以研究CXCR4表达增强以主导CXCR7途径的机制。FGF-2而非VEGF-A诱导CXCR4 mRNA和蛋白水平，并减弱CXCR7表达(图3g,补充图14). 值得注意的是，MAP激酶的特异性抑制（MAPK阻断了LSEC中FGF-2驱动的CXCR4诱导和CXCR7抑制¹¹(图3h). 因此，FGF-2联合SDF-1治疗人类LSEC可阻断SDF-1单独诱导Id1(图3i-j,补充图15)表明FGF-2在LSEC中诱导CXCR4上调和CXCR7抑制，从而抵消Id1促再生途径。

为了测试FGF-2信号如何调节LSEC的血管分泌反应，我们检测了BDL后LSEC上FGF-2受体FGFR1的激活。FGFR1呈时间依赖性上调和激活^16,9,30损伤VE-cadherin中MAP激酶（Erk1/2）磷酸化⁺LSEC公司(图3k，l,补充图16-17). 因此，胆汁淤积性损伤导致LSEC中FGFR1介导的MAPK激活，导致肝脏修复期间CXCR4主导的血管分泌反应的促纤维化转变(图3m).

为了阐明LSEC生态位原纤维化漂移的机制，我们有条件地消融Fgfr1级和Cxcr4号机组成年小鼠的内皮细胞(Fgfr1级^iΔEC/iΔEC和Cxcr4号机组^iΔEC/iΔEC) (图4a). BDL后，结蛋白的正弦周膨胀⁺细胞、胶原和SMA沉积、MAPK激活和CXCR7抑制Fgfr1级^iΔEC/iΔEC与对照组小鼠相比，所有小鼠均减毒(图4b-g,补充图18). 值得注意的是，CXCR7依赖的Wnt2和HGF的血管分泌表达在Fgfr1级^iΔEC/iΔEC老鼠(图4e). 因此，EC特异性删除Fgfr1级在成年小鼠中，BDL阻止了LSEC向促纤维化状态的异常转变。

为了揭示慢性损伤的LSEC中血管分泌反应的改变，我们从BDL和假手术小鼠中分离并分析了LSEC(补充图19). 在受损的LSEC中，促纤维化因子（包括TGF-β、BMP2和PDGF-C）显著上调，同时抗纤维化基因（如卵泡抑素和apelin）受到抑制。BDL后LSEC中血管分泌因子产生的这种差异性漂移在Fgfr1级^iΔEC/iΔEC小鼠，如抗纤维化基因的恢复和纤维化因子表达的减少(图4h).

BDL后的纤维化程度在Cxcr4号机组^iΔEC/iΔEC老鼠。与对照组相比Cxcr4号机组^iΔEC/+小鼠、SMA和胶原的肝脏沉积以及结蛋白的窦周堆积⁺星形细胞减少Cxcr4号机组^iΔEC/iΔECBDL后的小鼠(图4i-m,补充图20). 减少肝纤维化Cxcr4号机组^iΔEC/iΔEC小鼠暗示，慢性损伤导致的LSEC中组成性CXCR4激活建立了原纤维血管龛，激活了邻近的肌成纤维细胞并引发纤维生成(图4n).

虽然肝部分切除术后的肝脏再生进行得无可挑剔，没有纤维化，但慢性损伤后的肝脏修复与纤维化有关，纤维化会损害肝功能的恢复。因此，识别调控肝再生和异常愈合的分子途径将为肝硬化和肝衰竭的治疗开辟新的途径。我们已经证明，70%的肝部分切除术后，LSEC中VEGFR2-Id1通路的激活可导致肝再生⁹在这里，我们证明了FGFR1介导的LSEC中CXCR4上调和CXCR7抑制抵消了LSEC的促再生功能并导致纤维化。

我们采用互补的急性和慢性损伤模型来解读LSEC在肝脏修复中的作用(图1a). 在小鼠肝脏中，我们已经确定了对急性损伤作出反应的LSEC中促再生CXCR7依赖性信号的优先诱导(图1). 在慢性肝损伤期间，LSEC中CXCR7的缺失和CXCR4的上调会导致纤维化的进展。事实上，CXCR7激活在促进再生和对抗纤维化方面的关键功能可以通过选择性激活LSEC中的CXCR7减轻纤维化以及受损的再生来证明(图1)和增强纤维生成(图2–三)英寸抄送7^iΔEC/iΔEC老鼠。

LSEC中SDF-1信号从CXCR7依赖的促再生反应向CXCR4主导的促纤维化功能的转变是由于持续的FGFR1驱动慢性MAPK激活^11,16,29,30(图3). 我们利用一个可诱导的EC特异性小鼠基因缺失系统来证明FGFR1-CXCR4通路在LSEC的原发性漂移中的作用。值得注意的是，慢性肝损伤后，LSEC中CXCR4相对于CXCR7的表达增强在Fgfr1级^iΔEC/iΔEC老鼠，以及两者Fgfr1级^iΔEC/iΔEC和Cxcr4号机组^iΔEC/iΔEC小鼠对纤维化有抵抗力(图4). 因此，损伤后LSEC中CXCR7-Id1的激活触发并保护肝源性血管分泌因子的产生，而慢性刺激引起的显性FGFR1-CXCR4激活将LSEC转化为促纤维化生态位。通过FGFR1-CXCR4途径，LSEC的异常血管分泌功能导致结蛋白的激活和扩张⁺星状细胞。阐明肝星状细胞如何相互调节LSEC在肝脏修复中的表型和功能贡献仍有待研究^1,23此外，LSEC上CXCR7和CXCR4的激活是否调节炎症反应，例如巨噬细胞的募集，这些巨噬细胞可能调节肝再生和纤维化^6,8，需要研究。

总之，我们发现差异激活的LSEC为肝脏修复提供不同的血管分泌信号。LSEC中CXCR7的选择性激活有助于引导血管分泌介导的再生。通过组成性FGFR1激活对CXCR7通路的干扰将LSEC中的SDF-1信号转移到不适应（促纤维化）的血管分泌反应。识别在肝血管生态位中协调不同血管分泌反应的分子途径将为确保肝脏修复而不导致纤维化的治疗策略奠定基础。