摘要
诱导中枢神经系统分化的信号来源是脊椎动物胚胎学中一个长期存在的问题。 这里我们展示一下 爪蟾 神经诱导在囊胚期开始的时间比之前想象的要早,需要两个不同的信号中心的联合活动。 一个是著名的Nieuwkoop中心,位于背植物细胞中,表达Nodal-related内胚层诱导因子。 另一个是囊胚 科尔丁- 和 诺金- 表达(BCNE)中心位于包含预期神经外胚层和Spemann组织者前体细胞的背侧动物细胞中。 这两个中心都位于早期β-连环蛋白信号的下游。 分子分析表明,BCNE中心与Nieuwkoop中心不同,Nieuwkuop中心表达分泌蛋白Cerberus(Cer)。 我们发现,未接触中胚层基质的移植囊胚背侧动物帽细胞在盐水中培养时,可以表达明确的神经标记物,并在组织学上分化为中枢神经系统组织。 移植实验表明,BCNE区域是大脑形成所必需的,尽管在腹侧移植时它缺乏CNS诱导活性。 细胞测序研究表明,BCNE细胞产生大脑和视网膜的很大一部分,在胚胎的更后部产生底板和脊索。 用反义吗啉寡核苷酸(MO)进行的功能丧失实验表明,在无中胚层的情况下形成的中枢神经系统 爪蟾 胚胎(通过注射 Cerberus-短 [ CerS公司 ]mRNA)所需的Chd、Noggin及其上游调节因子β-连环蛋白。 当背部边缘区外植体阻止中胚层退化时,外胚层形成的前神经组织来源于BCNE细胞,对Chd有完全的需求。 通过注射 变更 吗啉寡核苷酸( 变更- MO)转化为预期的神经外胚层和驼鹿吗啉寡核苷酸( 证书- MO)在8细胞期进入前瞻性内胚层,我们表明这两层在中枢神经系统形成中协同作用。 研究结果提出了一个神经诱导模型 爪蟾 其中,早期囊胚β-连环蛋白信号通过Spemann组织者发出的内中胚层信号使潜在的神经外胚层易受神经诱导。
对神经诱导早期事件的新见解,这些事件使某些细胞能够对Spemann组织者发出的信号作出反应
介绍
脊椎动物的发育是一系列细胞-细胞相互作用的结果,在这些相互作用中,细胞群诱导其邻居获得新的细胞分化命运。 这一过程被称为胚胎诱导,最初是由来自大脑的视小泡在外胚层表面诱导晶状体( 斯佩曼1901 ; 刘易斯1904 ). 随后的研究表明,表面外胚层本身也起着重要作用(由 格兰杰1992 ). 从透镜感应的分析来看, 斯佩曼(1938) )提出了双重保证机制( doppelte Sicherung公司 )可以通过两层细胞之间的相互作用来解释脊椎动物发育的稳健性。 晶状体诱导是次级胚胎诱导的一个例子。 大多数实验胚胎学家集中研究神经板的诱导,这被认为是初级胚胎诱导( 斯佩曼1938 ; 萨克森和托沃宁1962 ; 哈兰德2000 ; 吉尔伯特2001 ; 斯特恩2002 ). 在经典的器官移植实验中, Spemann和Mangold(1924年 )证明背唇中胚层足以诱导外胚层中完整中枢神经系统(CNS)的分化。 斯佩曼在他的书中用了整整一章来讨论在神经板诱导的情况下是否存在双重保证机制( 斯佩曼1938 )并得出结论,证据支持潜在中胚层的作用,但不支持预期的神经外胚层。
在中胚层或外胚层受损的实验基础上,提出了原肠胚外胚层在神经板形成中的作用( 戈特勒1925 )并得到了一些后续支持( 莱曼1928 ). 然而,对外胚层在神经板形成中可能起的作用的进一步考虑受到了在axolotl胚胎中进行的一项极具影响力的外原肠形成实验的阻碍( 霍特弗雷特1933 )防止内胚层退化,整个外胚层分化为表皮。 由于在这些胚胎中没有中枢神经系统组织的痕迹,这项实验被解释为一种证据,表明潜在的内胚层在神经板诱导中起着重要作用,而预期的神经外胚层没有( 霍特弗雷特1933 ; 斯佩曼1938 ). 关于外胚层本身是否在神经板形成中起作用的争论一直持续到今天。 背缘区移植( Keller和Danilchik 1988年 ; 凯勒1991 ),中枢神经系统分化可能发生在没有潜在中胚层的情况下。 有人提出,在这些Keller外植体中,神经组织诱导是由原肠胚中胚层组织者在外胚层平面扩散的“平面”信号引起的( Ruiz i Altaba 1992年 , 1993 ; Doniach等人,1992年 ; 波兹南斯基和凯勒1997 )(请参见 图6 A) ●●●●。 然而,平面神经诱导信号的存在一直存在争议,凯勒外植体中的神经诱导被认为是由外胚层和中胚层在原肠胚早期短暂接触产生的“垂直”信号引起的( Nieuwkoop和Koster 1995 ). 因此,尽管在两栖类神经诱导方面进行了数十年的研究,但一个核心问题仍未得到解答:在缺乏中胚层基质的情况下,假定的神经板材料的分化潜能是什么? 这就是这里要解决的问题。
图6。 Keller移植体的前神经诱导需要Chd。
(A) 神经诱导中提出的垂直和平面信号(根据Ruiz i Altaba 1993)。
(B) Keller外植体制备和内中胚层会聚延伸延伸示意图( 凯勒1991 ).
(C) Keller外植体的神经和中胚层区域包含BCNE细胞的后代(蓝色),标记为64细胞期的卵裂球注射。
(D) 的表达式 Otx2型 和 克罗克斯20 在Keller外植体中( n个 = 7).
(E) 注入17 ng 变更- 生产订单完全冻结 其他2 和 克罗克斯20 神经区域的表达,而 Otx2型 在前内皮层没有受到影响( n个 = 10).
(F) 分化神经元标记 N-微管蛋白 在Keller外植体中表达( n个 = 8).
(G) 部分抑制 N-微管蛋白 通过注入 变更- 生产任务单( n个 = 7).
(H和I) 变更- MO在Keller外植体中。 缩写:SC,脊髓; CG,水泥压盖; 表皮,表皮。
(J) RT-PCR分析 变更- Keller外植体中的MO; 注入(正)或不注入(负)的样品 变更- 显示MO。 车道1,全胚胎; 2–7道,凯勒三明治。 注意神经标记的表达 NCAM公司 和 N-微管蛋白 在凯勒三明治中,通过联合注射200 pg的dnFGF受体4a而取消( dnFGF4a型 )mRNA和17 ng 变更- MO(车道5)。 注射600 pg 证书 mRNA消除中胚层,但不影响BCNE的形成,在本试验中不影响神经诱导(第6条线)。
最近的两项技术进步使我们重新研究了神经诱导 爪蟾 首先,现在可以通过微注射完全抑制中胚层的形成 Cerberus-短款 ( CerS公司 )mRNA,一种对结节相关中胚层诱导物特异的分泌性拮抗剂( Agius等人,2000年 ). 有趣的是, 爪蟾 缺乏中胚层的胚胎仍发育成中枢神经系统,包括独眼( Wessely等人,2001年 ). 这令人惊讶,因为这样的无中胚层胚胎没有表达多种Spemann组织者标记,例如 科尔丁 ( 变更 ), 诺金 ( 诺格 )、和 Goosecoid公司 原肠胚期背内胚层。 其次,随着反义吗啉寡聚物(MO)的问世,一场技术革命发生了,MO允许在 爪蟾 ( Heasman等人,2000年 ). 现在可以将两栖动物实验胚胎学的工具与单个基因的作用研究相结合,例如分泌性骨形态发生蛋白(BMP)拮抗剂Chd( Oelgeschläger等人,2003年 )或其上游调节因子β-连环蛋白( Heasman等人,2000年 )在实验操作的胚胎中。
在整个胚胎中注射 变更- MO是一种中枢神经系统,虽然体积较小,但仍在发育。 然而,当移植到宿主胚胎腹侧时,因Chd而耗尽的Spemann组织者失去了所有神经诱导活性( Oelgeschläger等人,2003年 ). 令人惊讶的是,当类似的缺乏Chd的移植物放在背侧时,外胚层细胞失去了对神经板的贡献能力( Oelgeschläger等人,2003年 ). 这表明外胚层自身可能存在Chd对神经板形成的细胞自主需求。 在囊胚期,BMP拮抗剂 变更 和 诺格 在动物背侧帽和边缘区表达,在我们最初指定为“组织前中心”的区域( Wessely等人,2001年 ). 这组细胞构成囊胚 科尔丁 -和 诺金 -表达(BCNE)区域,包含预期的神经外胚层细胞和Spemann组织者前体。 BCNE区域也表达 爪蟾 节点相关3 (Xnr3) ,一种具有神经诱导特性的分泌因子,在早期高水平表达 爪蟾 胚胎( Haramoto等人,2004年 ; Wessely等人,2004年 ). 表达的早期阶段 变更 和 诺格 在BCNE细胞中,β-连环蛋白的背侧积累对其进行调节,而随后在Spemann组织者内中胚层中同样的基因的表达需要额外的结节相关信号,这些信号可以被 证书 ( Wessely等人,2001年 ).
在本研究中,我们分析了神经诱导的机制 爪蟾 通过胚胎剪贴和分子功能丧失实验。 我们发现BCNE中心包含许多假定的前中枢神经系统。 功能丧失研究表明,囊胚表达的基因产物,如Chd、Nog和β-连环蛋白,是在没有潜在内胚层的情况下进行神经诱导所必需的。 细胞测序研究表明,BCNE中心本身产生大脑、脊索和底板。 移植实验表明,BCNE中心是脑形成所必需的 爪蟾 胚胎。 8细胞阶段的微注射实验,其中 变更- 将MO注射到动物背部 证书- MO进入背植物胚裂球,证实来自预期神经外胚层和潜在内胚层的分泌信号是中枢神经系统前部发育所必需的。 研究结果支持了一种双重保证机制,即 斯佩曼(1938) )用于透镜感应。
结果
BCNE中心有别于Nieuwkoop中心
初始不对称 爪蟾 发育是由精子进入引发的皮层旋转引起的,被认为是重新分配“背侧决定因子”,进而稳定胚胎背侧的β-连环蛋白( 图1 A) (在中审查 Gerhart等人,1991年 ; Harland和Gerhart 1997年 ; De Robertis等人,2000年 ). 在囊胚期,位于背植物细胞的Nieuwkoop中心分泌中胚层诱导信号,如 Xnr1、Xnr2、Xnr 4、XnR 5、, 和 Xnr6号机组 诱导上覆中胚层细胞中原肠胚Spemann组织者的形成( Agius等人,2000年 ; Takahashi等人,2000年 ). Nieuwkoop中心在早期文献中也被称为“囊胚组织者”( Gerhart等人,1991年 ). BCNE区域在动物背侧和边缘区域发育。 囊胚期(受精后7小时)的原位杂交分析表明,神经诱导分泌因子 Chd、Nog、, 和 Xnr3号机组 在包括大约45个区域的动物帽中表达 o个 囊胚腔底部上方以及背缘区的弧度( 图1 B– 1 D) ●●●●。 在原肠胚阶段,相同的基因在更多的植物区表达,在位于边缘区背内中胚层的Spemann组织者中(例如。, 图2 E) ●●●●。
图1。 两个信号中心共存于 爪蟾 布拉斯图拉。
(A) 1细胞期和早期囊胚之间的早期事件图。
(B–D)表达 Chd、Nog、, 和 Xnr3号机组 中囊胚转变后(受精后7小时)的转录本。 胚胎作为整体进行杂交,在室温下储存在甲醇中1个月以提高对比度,并用剃须刀片进行切片。
(E) 第9期中胚泡基因标记物的RT-PCR分析。 如图所示,通过对囊胚区域的解剖,制备了六个样本。
(F) 囊胚基因表达总结。 BCNE中心表示 Chd、Nog、Siamois、, 和 Xnr3、, 而Nieuwkoop中心表示 Xnr2、Xnr6、, 和 证书。
图2。 BCNE中心对前脑和中线结构有贡献。
(A) 使用生物素-右旋糖酐(BDA)标记的移植物对BCNE中心进行谱系追踪的方法。
(B) 第9期新近移植的BCNE的矢状面切片。
(C) 变更 第9阶段的mRNA表达。
(D) BCNE 10.5期后代。
(E) 变更 10.5期mRNA表达。
(F) BCNE中心11期后代。
(G) 神经板14期BCNE后代的背视图。
(H) 移植BCNE区细胞核双重染色 lacZ公司 第14期用表皮细胞角蛋白(epi)探针检测寄主mRNA和表皮外胚层浅红色。
(一) 第16阶段主干水平的横截面。 缩写:fp,楼板; 不,恶搞。
(J–L)第40阶段的横截面。 缩写:fp,楼板; hb,后脑; 他,心; le,透镜; mb,中脑; 不,脊索; ov,耳囊; 视网膜。
(M) 用CMV-GFP转基因胚胎的BCNE移植物移植6天胚胎的背视图。 缩写:br,brain; fp,楼板; 视神经; op,嗅觉板。
(N) 第4天侧视图,显示标记的视网膜和大脑。 缩写:br,brain。
问题是两个不同的信号中心是否共存于 爪蟾 囊胚。 为了解决这个问题,具有强烈背腹极性的早期囊胚( 克莱因1987 )被切割成六块碎片,如所示 图1 E.结果表明,尽管存在一些重叠,但该区域表达 变更 和 诺格 包括动物帽,而Nieuwkoop中心区域表示 Xnr2号机组 和 Xnr6号机组 有一个更适合植物生长的地方(参见 图1 E) 。 Xnr3号机组 在片段3和片段4中观察到表达,表明重叠程度较高(参见 图1 E) ●●●●。 此外,结果显示同源盒基因 Siamois公司 在BCNE区域表达,尽管据报道其在发育后期的表达更多是植物性的( Lemaire等人,1995年 ). 我们还发现 Cerberus(Cer), 原肠胚前内胚层表达的一个基因( Bouwmeester等人,1996年 )是Nieuwkoop中心的一个组成部分。 我们得出的结论是,两个不同的信号中心存在于囊胚中(见 图1 F) ●●●●。 BCNE中心表达的动物越多 变更、编号、Xnr3、, 和 Siamois公司, 而Nieuwkoop中心表示 Xnr2、Xnr6、, 和 证书。
BCNE区域的细胞谱系
绘制囊胚的命运 变更- 和 诺格- 在正常发育过程中表达细胞,我们将血统标记的BCNE区域同位素移植到9月初的宿主囊胚中( 图2 A) ●●●●。 这些含有谱系示踪剂生物素-右旋糖酐胺(BDA)的移植物标记了 变更- 囊胚表达区(比较 图2 B和 2 C) ●●●●。 几个小时后,在原肠胚早期(10.5期),在组织内膜和前瞻性神经外胚层中都发现了背侧动物帽的后代( 图2 D) ●●●●。 我们注意到在原肠胚早期 变更 mRNA在组织者内胚层中表达,但在预期的神经外胚层中不再检测到( 图2 E) ●●●●。 在原肠中段11期,移植组织在组织者内胚层和预期神经外胚层中拉长,两层保持紧密并列( 图2 F) ●●●●。 在神经板阶段,即第14阶段,BCNE中心后代出现在前神经板的一个较宽区域,更后面的是在中线的一条狭窄条纹中( 图2 G) ●●●●。 使用细胞核双重染色 lacZ公司 mRNA作为谱系示踪剂结合表皮细胞角蛋白标记物证实BCNE细胞产生前神经板( 图2 H) ●●●●。 在组织切片中,躯干区中线染色与底板和脊索相对应( 图2 一) ●●●●。 在蝌蚪期(40期),BCNE后代对大脑和视网膜的大部分(但不是晶状体和耳囊)以及躯干尾部的背中线结构有贡献( 图2 J– 2 五十) ●●●●。 这个谱系可以追溯到喂养蝌蚪的阶段( 图2 M和 2 N) 巨细胞病毒-绿色荧光蛋白转基因胚胎背盖移植的研究( Marsh-Armstrong等人,1999年 ). 这些结果表明囊胚 变更- 表达细胞产生大脑的大部分,并在树干区域产生底板和脊索 爪蟾 胚胎。
背侧动物帽被指定形成中枢神经系统
在胚胎学中,对细胞是否被指定形成特定组织的测试是将其与胚胎的其余部分分离培养。 从注射了 证书 mRNA在第26期表达多种神经分子标记,而动物或腹壁移植体没有表达( 图3 A和 三 B) ●●●●。 证书 需要抑制中胚层形成; 当制备相同的外植体时 证书 mRNA注射,检测到边缘区中胚层污染(数据未显示)。 神经分化也可以在缺乏 证书 mRNA,以避免中胚层污染。 如所示 图3 C、 切下BCNE区域上半部分的小外植体,将其夹在一起,并在盐水中培养3天。夹心程序允许这些小外植物在培养中长时间存活。 背侧BCNE外植体分化为组织型CNS,包括灰质和白质( 图3 D) 而类似的腹外胚层外植体分化为表皮( 图3 E) ●●●●。 这些结果表明,背侧动物帽细胞已被指定在囊胚期形成中枢神经系统。
图3。 Blastula Dorsal动物帽被指定为形成中枢神经系统。
(A) 显示胚胎注射 证书 在囊胚处解剖动物帽的三个区域的mRNA,培养至26期,并进行RT-PCR处理。 在这些样品中,外植体的尺寸为0.3 mm×0.3 mm。 缩写:A,动物极; D、 背区; 五、 腹部动物帽。
(B) 动物帽片段的RT-PCR分析; 注意,在没有中胚层的情况下,前脑标记物在背部碎片中表达( α-肌动蛋白 )和内胚层( 内皮素,Edd )差异化。 缩写:A,动物极; D、 背区; 五、 腹部动物帽。
(C) 小动物帽三明治实验示意图; 这些胚胎没有注射 证书。 在这种情况下,外植体的尺寸为0.15毫米×0.15毫米,与胚泡腔底部留有0.15毫米的间隙,以避免受到中胚层形成细胞的污染。 将两个外植体的碎片夹在一起(外植体太小,无法通过卷曲愈合),并在1×Steinberg溶液中培养至第40阶段。 缩写:VSW,腹面三明治; DSW,背三明治。
(D) 背侧动物顶盖外植体的组织学切片(背侧三明治)。 这些三明治分化为组织型前脑组织,包括白质和灰质(4/17)。 缩写:DSW,背三明治; gm,灰质; wm,白质。
(E) 腹部动物帽三明治的组织切片。 所有三明治都分化成非典型表皮( n个 = 20). 缩写:ae,非典型表皮; VSW,腹面三明治。
脑形成需要BCNE组织
为了测试大脑形成是否需要BCNE中心,我们首先删除了动物帽的腹侧或背侧区域。 背侧区域的缺失,但腹侧动物帽的缺失,导致无头胚胎( 图4 A和 4 B) ●●●●。 自 爪蟾 是研究得最好的脊椎动物胚胎之一,令人惊讶的是,此前从未报道过需要囊胚的一个区域来形成中枢神经系统。 为了进一步研究,我们用不同的外胚层移植物替换了删除的片段。 大脑缺损可以通过移植背侧而非腹侧的动物顶盖来挽救( 图4 C和 4 D) ●●●●。 动物极点上的外胚乳无法救出烧毁的动物背帽( 图4 F) ●●●●。 然而,来自氯化锂(LiCl)处理过的胚胎的类似动物极,其中β-连环蛋白稳定,BCNE基因转录激活,能够挽救头部形成( 图4 E) ●●●●。
图4。 大脑形成需要背部动物帽。
(A) 腹侧动物帽缺失(ΔV)产生正常胚胎。
(B–F)背侧动物帽缺失(ΔD)导致大脑前部结构丢失。 背侧动物帽移植(C)和从氯化锂处理的胚胎中获得的动物杆移植(E)挽救了背侧动物冠缺失的无头表型,但腹侧动物帽植入(D)或动物杆植入(F)没有挽救。 平均背前指数(DAI)为4.89([A] n个 =28),3.52([B] n个 =25),4.90([C] n个 =10),3.63([D] n个 =19),4.90([E] n个 =12)和3.50([F] n个 = 10).
(G) 将背侧动物帽移植到寄主胚胎的腹侧动物帽区域,可诱导弱次级轴(65.4%, n个 = 26). 此处显示的胚胎是获得的最强轴之一。
(H) 腹部移植的BCNE活性被阻断 变更- 生产任务单( n个 = 15).
尽管大脑发育有此要求,但移植到宿主囊胚腹侧的囊胚背侧动物帽只能形成微弱的次级轴( 图4 G) ●●●●。 变更- MO,阻断Spemann移植物的活性( Oelgeschläger等人,2003年 ),也包括灭活BCNE移植物( 图4 H) ●●●●。 然而,与成熟的Spemann组织者的一个重要区别是,BCNE细胞移植到脊髓和肌肉的这些弱轴中进行自我分化,并且不能像Spemann组织者那样在邻近细胞中诱导中枢神经系统(数据未显示)。 我们得出结论,背侧动物帽BCNE中心是大脑形成所必需的。 然而,当移植到异位部位时,BCNE组织只有微弱的作用,不会诱导神经组织。
无中胚层的前中枢神经系统形成需要Chd和Nog
接下来我们研究了在缺乏中胚层和Spemann组织者的胚胎中形成的前中枢神经系统是否需要BCNE中枢信号。 证书 mRNA在4细胞期注射,BCNE区在64细胞期标记BDA( 图5 A; 另请参见 图S1 ). 这些无中胚层的胚胎发育出前脑组织和显著的睫状体眼,这些都是由血统标记的BCNE细胞衍生而来的( 图5 B和 5 C) ●●●●。 为了测试这些胚胎中是否需要Chd,我们注射了 变更- 2细胞期的MO。 当Chd被击倒时,BCNE细胞发育成表皮而不是CNS( 图5 D和 5 E) ●●●●。 大脑和眼睛的形成可以通过过度表达 变更 mRNA缺乏靶向区域 变更- 生产任务单( 图5 F和 5 G) ●●●●。
图5。 无中胚层胚胎的中枢神经系统来源于BCNE细胞,需要Chd、Nog和β-连环蛋白。
(A) 实验设计。 中胚层诱导受到抑制的胚胎(通过注射600 pg 证书 mRNA进入植物极),并用苏木精-伊红染色或微量注射BDA谱系示踪剂标记BCNE区域。
(B和C)胚胎注射 证书 仅mRNA( n个 = 40). 缩写:br,brain。
(D和E)胚胎注射17 ng 变更- 除外的生产任务单 证书 ( n个 = 21). 缩写:epi,表皮。
(F和G)17 ng 变更- MO和 认证证书, 然后是100 pg的 变更 mRNA与谱系示踪剂( n个 = 19). 缩写:br,brain。
(H) 无中胚层胚胎中前部中枢神经系统标志物的表达需要Chd和Nog。 RT-PCR分析 证书 mRNA注射胚胎于尾芽期26。 前脑标志物( 其他2 ),眼睛( Rx2a(卢比) ),中脑边界( 英语2 ),后脑( 克罗克斯20 )和水泥压盖( XAG公司 )被注射 变更- 瞬间, 诺格- MO或两者兼而有之。 泛神经标记物(NCAM)和神经元标记物(N-微管蛋白)被部分抑制,后部神经标记物 霍克斯B9 没有受到影响。 α-肌动蛋白 作为中胚层标志物来表明 证书 这些胚胎中胚层受阻 ODC公司 作为mRNA负载控制。 The effects of the诺格- 此处描述的MO可以通过全长进行救援 诺格 mRNA缺乏反义吗啉靶向的5′先导序列(数据未显示)。
(I和J) β-猫- MO(13.6 ng)与 证书 信使核糖核酸( n个 = 15). 缩写:epi,表皮。
(K和L)救援 β-猫- MO乘以800 pg β-连环蛋白 mRNA。 缩写:br,brain。
(M和N)救援 β-猫- 100 pg的MO表型 变更 信使核糖核酸( n个 = 8).
(O) β-连环蛋白引起的前神经诱导需要Chd。 通过注射600pg激活β-儿茶素信号,在动物顶盖外植体中诱导神经和水泥腺标志物 β-连环蛋白 mRNA, dnGSK3号机组 mRNA或LiCl处理(3-5道)。 前脑标志物( Six3,Otx2 ),眼睛( Rx2a(卢比) ),中后脑边界( 英语2 ),后脑( 克罗克斯20 )和水泥压盖( XAG公司 )被抑制 变更- MO(6-8车道)。 尽管未检测到后部神经标记物的抑制作用 霍克斯B9 和泛神经标记 NCAM公司 ,神经元标记物 N-微管蛋白 被抑制。 α-肌动蛋白 和 α-珠蛋白 分别是背侧和腹侧中胚层标记,用于显示中胚层形成的缺失,以及 ODC公司 用作加载控制。
分子分析证实,无中胚层胚胎注射 变更- MO不表达前部神经组织标志物,如 Otx2、Rx2a、En2、, 和 克罗克斯20 ( 图5 H、 比较车道3和4)。 然而,脊髓( 霍克斯B9 )或泛神经标记物(N微管蛋白、神经细胞粘附分子[NCAM])仍在表达,表明只有前神经分化被 变更- MO和后部神经诱导继续发生。 我们还生成了Noggin反义吗啉寡核苷酸( 诺格- MO)试剂 变更- MO,抑制脑标记物( 图5 H、 泳道5)。 诺格- MO略弱于 变更- MO,但即使两种吗啉结合也不能消除后部神经标记物( 图5 H、 车道6)。 这些结果表明,缺乏中胚层和Spemann组织者的胚胎中形成的脑组织来源于BCNE细胞。 在无中胚层胚胎中,前中枢神经系统的形成需要表达 变更 和 诺格 在前瞻性神经外胚层中。
β-儿茶素的神经诱导需要Chd
最近发现,微量注射 β-连环蛋白 mRNA能够诱导神经组织 爪蟾 动物帽( 贝克等人,1999年 ). β-连环蛋白的稳定具有双重作用,抑制BMPs的转录( 贝克等人,1999年 ; Leung等人,2003年 )增加BMP拮抗剂的表达 更改 和 诺格 在囊胚动物帽中( Wessely等人,2001年 ). 接下来,我们测试了β-连环蛋白敲除对中枢神经系统分化的影响。 如所示 图5 我和 5 J、, β-猫- MO寡核苷酸( Heasman等人,2000年 )阻塞组织学前脑和眼结构的形成 证书 无中胚层的胚胎。 重要的是,前中枢神经系统的形成可以通过以下两种蛋白的过度表达来恢复 β-连环蛋白 或 变更 这些胚胎中的mRNA( 图5 K– 5 N) 。 我们得出的结论是,在没有中胚层的情况下,大脑的形成需要早期的β-儿茶素信号。
为了研究动物帽外植体中β-连环蛋白的神经诱导是否需要Chd β-连环蛋白 mRNA,显性负性糖原合成酶激酶-3( dnGSK3号机组 )mRNA或氯化锂。 这些处理在动物帽中诱导了多种神经标记物( 图5 O、 车道3–5)。 微量注射 变更- MO抑制前部神经标记物的表达( Six3、Otx2、Rx2a、En2 )但不是后部或全神经的( 霍克斯B9, NCAM)( 图5 O、 车道6–8)。 结果表明,β-连环蛋白信号的神经诱导需要其下游靶基因的表达 科尔丁。
Keller移植体的前神经诱导需要Chd
是的表达式 变更 囊胚处负责“平面”神经诱导信号的前瞻性神经外胚层( 图6 A) 早期工人描述的? 为了研究这一点,我们使用了凯勒三明治(Keller and Danilchick 1988; Doniach等人1992 ; Ruiz i Altaba 1992),神经组织在发育过程中不接触下胚层( 图6 B) ●●●●。 用谱系示踪剂标记BCNE区域表明凯勒三明治中含有表达 变更 囊胚处的前瞻性神经外胚层( 图6 C) ●●●●。 Keller三明治表达前中枢神经系统基因标记( 图6 D和 6 F) ●●●●。 然而,从注射了 变更- 任务单无法表达 其他2 或 克罗克斯20 在前神经外胚层,同时保留 其他2 内胚层的表达(比较 图6 D和 6 E) ●●●●。 标记分化神经元的N-微管蛋白表达被 更改- MO位于CNS前部,但持续存在于预期脊髓中( 图6 F和 6 G; 结果总结于 图6 H和 6 一) ●●●●。 这些结果表明,在缺少中胚层的Keller外植体中观察到的前中枢神经系统形成需要Chd。
Keller外植体的分子分析证实脑标记物被 变更- MO,而神经和脊髓标志物受影响较小( 图6 J、 比较车道2和3)。 和以前一样,后部神经诱导不需要Chd。 这种后部神经分化的起源是由于成纤维细胞生长因子(FGF)信号( 洪戈等人,1999年 ; Pera等人,2003年 ),因为它可以在注射显性阴性FGF受体4a(dnFGFR4a)mRNA的外植体中被阻断( 图6 J、 车道4和5)。 重要的是,当中胚层诱导被 证书 信使核糖核酸( 图6 J、 车道6),并可能被 变更- 生产任务单( 图6 J、 车道7)。 由于中胚层较少 证书 Keller外植体缺乏内胚层Spemann组织者,其Chd的唯一来源是BCNE中心。 综上所述,这些实验表明,在Keller外植体中观察到的前神经诱导,即所谓的“平面”诱导,是由 变更- 在囊胚期位于推测的神经外胚层的表达细胞。
Chordin和Cerberus在脑诱导中的协同作用
来自内胚层的垂直信号与BCNE中心在脑分化中合作吗? 内中胚层分泌具有头部模式活性的生长因子拮抗剂,如Cer、Frzb-1、Crescent、Dickkopf-1、Chd和Nog( 哈兰德2000 ; De Robertis等人,2000年 ). 其中一些分泌性拮抗剂在前内胚层表达,与小鼠前内脏内胚层同源( 贝丁顿和罗伯逊2000 ). 我们选择研究这些拮抗剂中的一种,头部诱导剂Cer,因为它在Spemann组织者的前内胚层中表达( Bouwmeester等人,1996年 )和在Nieuwkoop中心,但不在BCNE中心(见 图1 E) ●●●●。
最近的两项研究描述了吗啉反义寡核苷酸靶向性 证书 。在两者中, 证书 头部发育似乎不需要单独进行,但与其他因素共同作用时会进行配合( Hino等人,2003年 ; Silva等人,2003年 ). 非洲爪蟾 基因经常有假等位基因,被认为是由两个不同基因之间的杂交产生的 爪蟾 进化过程中的物种( Kobel和Du Pasquier 1986年 ). 对EST数据库的检查表明 欧洲委员会 等位基因存在,并且已发表的吗啉酸与之分别有三个和四个错配( 图7 A)( Silva等人,2003年 ; Hino等人,2003年 ). 因此,我们设计了一种新型吗啉寡核苷酸, 证书- MO,针对两者 X·莱维斯 假等位基因( 图7 A) ●●●●。 证书- MO抑制了中的头部形成 爪蟾 胚胎,可以通过 证书 mRNA缺乏靶向5′-先导序列(数据未显示)。
图7。 中的一种双保险机制 爪蟾 需要Chordin和Cerberus的神经诱导。
(A) 一个新的 证书- MO是对两者的补充 证书 假等位基因,而其他作者报道了两个MO( Hino等人,2003年 ; Silva等人,2003年 )只匹配一个等位基因,分别与其他等位基因有三个或四个不匹配。 这个 证书- 本研究中使用的MO抑制完整胚胎的头部形成(数据未显示),而其他两种则没有( Hino等人,2003年 ; Silva等人,2003年 ).
(B) 在8细胞期微注射背动物(FDA,绿色)和背植物(TRDA,红色)胚泡的32细胞和早期原肠胚(10.5期)的实验程序和细胞系。
(C和D)未注射胚胎。
(E和F)Dorsal-animal注射液,含8.5 ng 变更- MO单独部分抑制头部形成; CNS前部可见绿色荧光。
(G和H)Dorsal-vegetal注射液,含17 ng 证书- MO也部分抑制脑形成; 前中胚层可见红色荧光。
(I和J)注射8.5 ng 变更- MO背-动物和17 ng 证书- MO背植物性阻断了大脑的形成,但没有脊髓和体节(组织切片未显示)。
为了测试Cer和Chd是否合作,我们瞄准了 证书- MO至背内胚层和 变更- MO至8细胞期背神经外胚层( 图7 B) ●●●●。 在使用的剂量下,微量注射 变更- MO或 证书- 单用MO导致前中枢神经系统的部分减退( 图7 C– 7 H) ●●●●。 然而,当神经外胚层和内胚层祖细胞被注射 变更- MO和 证书- MO分别表示未发生脑分化( 图7 我和 7 J) 。 在组织切片中,这些胚胎缺乏大脑结构,但仍发育有脊髓、体节和脊索(数据未显示)。 结果表明,大脑的形成需要不同细胞层中不同因子的部分重叠。 预期神经外胚层需要Chd使细胞易形成前中枢神经系统,并与包括Cer在内的潜在内胚层的垂直信号协同作用( 图8 ).
图8。 BCNE和Nieuwkoop中心大脑形成的双重保证模型。
布拉斯图拉 变更- 和 诺格- 表达细胞位于动物背部区域,而Nieuwkoop中心位于植物背部区域。 在原肠胚,来自Nieuwkoop中心的前内胚层与预期的前中枢神经系统紧密并列。 参见文本进行讨论。
讨论
此处的结果与以下CNS发展过程中的事件顺序一致 爪蟾 .卵子早期皮层旋转触发的背侧β-连环蛋白信号( Gerhart等人,1991年 ; De Robertis等人,2000年 )在囊胚期诱导位于动物背部区域的一组细胞中表达抗BMP分子,如Chd和Nog(参见 图8 ). 背侧前瞻性神经外胚层已经被指定在囊胚处形成中枢神经系统(参见 图3 ). 值得注意的是,移植研究表明,这个BCNE中心是体内大脑形成所必需的(见 图4 ). 这些背侧动物帽细胞在发育过程中的正常命运是产生前中枢神经系统、底板和脊索(参见 图2 ). 我们注意到,我们以前的术语“预组织者”( Wessely等人,2001年 )有些不足。 由于BCNE移植物在移植后不能在邻近细胞中诱导中枢神经系统,因此缺乏组织者活性。
Nieuwkoop中心与BCNE中心在同一阶段出现,但在更多的植物细胞中(参见 图8 ). Nieuwkoop中心表达分泌因子,如中胚层诱导 Xnrs公司 和 证书 在以后的发育过程中,形成了位于前中枢神经系统下方的内胚层(参见 图8 ). 通过抑制假定神经外胚层中的Chd和内胚层基质中的Cer(见 图7 ),我们能够提供证据证明,不同胚层分泌的不同生长因子拮抗剂的部分重叠功能在中枢神经系统形成中起协同作用。
神经诱导始于Blastula
在囊胚期,BCNE区域的基因表达会导致预期脑组织本身的神经倾向。 当预期的神经外胚层移植到囊胚上并在没有中胚层的情况下培养时,它可以发育成组织型神经组织(参见 图3 D) ●●●●。 一旦Nieuwkoop中心在背部中胚层诱导Spemann组织者,内胚层分泌生长因子拮抗剂混合物。 这些Spemann组织者分子需要Nodal-related信号才能在原肠胚产生( Agius等人,2000年 ; Wessely等人,2001年 ). 这些内胚层因子包括Cer(结节、Wnt和BMP信号的抑制剂); 抗Wnts如Frzb-1、Crescent和Dickkopf,抗BMP如Follistatin、Chd和Nog( De Robertis等人,2000年 ). 一些分子,如Chd和Nog,在囊胚的背侧动物帽和原肠胚的Spemann组织者中均表达,而其他分子,如Cer,仅在Nieuwkoop中心及其内中胚层后代中表达。 在两栖动物中,原肠胚背唇在移植到宿主原肠胚时能够诱导完整的中枢神经系统,这被认为是原肠胚发生神经诱导的迹象。 我们现在发现,在囊胚期由母亲β-连环蛋白信号触发的Chd和Nog的短暂表达是大脑形成所必需的。 当来自潜在子宫内膜的额外信号通过抑制结节信号传导或通过防止凯勒背侧外植体的退化而被阻断时,这一要求变得明显。 我们的结论是 爪蟾 神经诱导开始于中胚层之后不久的假定神经外胚层。 这与最近的其他工作一致 爪蟾 ( 贝克等人,1999年 ; 游戏和筛选2001 ; Wessely等人,2001年 ).
材料和方法
胚胎操作
爪蟾 通过体外受精获得的胚胎在0.1×改良Barth培养基中培养( Sive等人,2000年 ). 对于BCNE移植和缺失实验,在1×Steinberg溶液中进行解剖( Sive等人,2000年 ). BCNE移植物是从囊胚腔底部正上方的动物背盖上分离出的0.3 mm方形。 在第9早期(室温下受精后6.75–7.25小时),在广泛的外胚层运动开始之前,即大细胞囊胚期(第8期)之后仅一次分裂时,将其切除,并且可以通过动物帽的厚度和细胞大小进行监测。 胚胎在1×Steinberg’s溶液中培养,直到愈合(0.5–1 h),然后变为0.1×Barth’s溶液。 胚胎期根据 Nieuwkoop和Faber(1994年 ).
凯勒三明治是在第10阶段早期准备的。 用不锈钢镊子从背中线以30°的角度切除原肠胚的背侧部分,从背唇到动物极。 将两个外植体夹在1 x Steinberg溶液中培养12 h,用于原位杂交,1 d用于RT-PCR分析,2 d用于形态学分析。 对于RT-PCR分析,从五个Keller外植体、五个动物帽或单个胚胎中收集RNA。 RT-PCR条件和引物以及全山原位杂交的方案在 http://www.hhmi.ucla.edu/derobertis/index.html .
世系追踪
为了绘制BCNE后代的命运图,开发了一种改进的谱系追踪方法。 在H中向胚胎注射1-4 nl的1%BDA(美国俄勒冈州尤金市分子探针公司) 2 O和培养的外植体或胚胎在MEMFA中固定至少1小时( Sive等人,2000年 ). 随后,胚胎在70%乙醇中放置24小时,在100%乙醇中放置1小时,在100%异丙醇中放置1 h,在100%二甲苯中放置12–16小时,在65°C的石蜡中放置1个小时,然后进行包埋。 我们发现在二甲苯中隔夜孵化可以改善早期胚胎的切片,因为早期胚胎富含蛋黄。 切片在8–10μm处切割,并在100%二甲苯、100%乙醇和70%乙醇中脱蜡2分钟。 接下来,将切片在结合缓冲液(100 mM Tris–HCl,150 mM NaCl[pH 7.5])中洗涤两次,持续5分钟,并在含有链霉亲和素偶联的碱性磷酸酶的结合缓冲液(Roche,Basel,Switzerland)中以1:5000的稀释度在室温下孵育过夜。 然后,用结合缓冲液清洗载玻片两次,用反应缓冲液清洗一次(100 mM Tris–HCl,100 mM NaCl,50 mM MgCl 2 pH9.5)培养5分钟,并在4°C的黑暗中与含有10%BM紫色溶液(罗氏)的反应缓冲液在Coplin罐中培养过夜。 通过在Stop溶液(100 mM Tris-HCl,1 mM EDTA,pH 7.4)中培养,停止染色,切片在100%甲醇中脱水并完全风干,然后安装在Vectashield培养基中(Vector Laboratories Inc.,美国加利福尼亚州伯灵盖姆)。 在一些核实验中 lacZ公司 mRNA(R.Harland的亲缘礼物)、荧光素葡聚糖胺或德克萨斯红葡聚糖胺被用作谱系示踪剂。
RNA注射
为了产生合成mRNA,质粒pCS2- 认证证书, pCS2型- 变更, pCS2型- β-连环蛋白, 和pCS2- dnGSK3号机组 如前所述,用NotI线性化并用SP6 RNA聚合酶转录( Piccolo等人,1999年 ). 以下数量的mRNA用于微量注射:600 pg(150 pg在4细胞期四次进入植物区) 认证证书, 100pg(50pg两次进入4细胞期动物背区) 变更, 800pg(400pg在8细胞期两次进入动物背区) β-连环蛋白, 600pg(在8细胞期,300pg两次进入动物背区) dnGSK3号机组 mRNA。
吗啉寡核苷酸
吗啉寡聚物如下: 更改- MO1(5′-ACG TTC TGT CTC GTA TAG TGA GCG T-3′)和 变更- MO2(5′-ACA GCA TTT TTG TGG TTG TCC CGA A-3′)( Oelgeschläger等人,2003年 ); 诺格- MO(5′-TCA CAA GGC ACT GGG AAT GAT CCA T-3′)(本工作); β-猫- MO(5′-TTT CAA CCG TTT CCA AAG CAG G-3′)( Heasman等人,2000年 ); 证书- MO(5′-ACT TGC TGT TCC TGC ACT GTG C-3′)(本作品); 和控制-MO(5′-CCT CTT ACC TCA GTT ACA ATT TAT a-3′)( Oelgeschläger等人,2003年 ). 重新悬浮吗啉寡聚物以制备1 mM储备溶液(SS),然后在无菌水中进一步稀释,得到工作溶液: 变更- MO解决方案( 变更- MO1-SS: 变更- MO2-SS:H型 2 O=1:1:6), β-猫- MO解决方案( β-猫- MO-SS:H型 2 O=1:4), 诺格- MO解决方案( 诺格- MO-SS:H型 2 O=1:1), 证书- MO解决方案( 证书- MO-SS:H型 2 O=1:1),对照-MO溶液(对照-MO-SS:H 2 O=1:1),以及 更改- 生产任务单/ 诺格- MO解决方案( 变更- MO1-SS: 变更- MO2-SS: 诺格- MO-SS:H型 2 O=1:1:4:10)。 在2细胞期共注射8 nl(2倍4 nl或4倍2 nl)吗啉溶液,或在8细胞期注射4 nl(两倍2 nl)吗啉液。
支持信息
图S1。 使用改进的BDA线性追踪方法,可以在64细胞阶段可靠地标记BCNE区域。 (A–H)微注射单个32细胞卵裂球并不能忠实地再现原肠胚处BCNE移植物的谱系(与 图2 B和 2 D) ●●●●。 值得注意的是,D1的谱系包括Nieuwkoop中心的一部分,并参与原肠胚的前内胚层。 这张32细胞图与之前发布的命运图基本一致( Dale and Slack 1987年 ; Bauer等人,1994年 ); 观察到的微小差异可以通过我们选择的定期切割胚胎批次来解释( 克莱因1987 )带有紧密粘附的小动物卵裂球。 缩写:AE,前内胚层。
(I–L)图显示了B1的下女儿和C1的上女儿在64细胞期(I)的注射,该图可靠地确定了BCNE在9期(J)、11期(K)和36期(L)的后代。 箭头表示胚泡。 缩写:fp,楼板; 不,脊索。
(4.39 MB TIF)。
致谢
我们感谢D.D.Brown博士的转基因 X·莱维斯; H.Okamoto博士、D.Wilkinson博士、R.Harland博士和D.Kimelman博士负责DNA构建; U.Tran和A.Cuellar提供技术援助; 以及E.Neufeld、L.Zipursky、S.Millard、E.Pera和C.Coffinier对手稿的评论。 这项工作得到了美国国立卫生研究院(HD21502-18)和霍华德·休斯医学研究所的支持,EMDR是该研究所的研究员。
缩写
β-猫- 卫生官员
β-连环蛋白 吗啉寡核苷酸
BCNE公司
囊胚 科尔丁- 和 诺金- 表达区
BMP公司
骨形态发生蛋白
证书- 卫生官员
Cerberus公司 吗啉寡核苷酸
证书
Cerberus短
变更- 卫生官员
科尔丁 吗啉寡核苷酸
中枢神经系统
中枢神经系统
FGF公司
成纤维细胞生长因子
葛兰素史克3
糖原合成酶激酶-3
IGF公司
胰岛素样生长因子
氯化锂
氯化锂
卫生官员
反义吗啉寡核苷酸
MAPK公司
丝裂原活化蛋白激酶
NCAM公司
神经细胞粘附分子
诺格 -生产任务单
诺金 吗啉寡聚物
ODC公司
鸟氨酸脱羧酶
不锈钢
储备溶液
Xnr公司
爪蟾 节点相关
作者贡献。 HK和EMDR构思并设计了实验。 HK和EMDR进行了实验:HK、OW和EMDR分析了数据。 HK、OW和EMDR提供了试剂/材料/分析工具。 香港和EMDR撰写了这篇论文。 所有作者都在这项工作上合作。
学术编辑:Christof Niehrs,Deutsches Krebsforschungszentrum
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关联数据
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补充资料
图S1。 使用改进的BDA线性追踪方法,可以在64细胞阶段可靠地标记BCNE区域。 (A–H)微量注射单个32细胞卵裂球并不能忠实地再现原肠胚BCNE移植物的谱系(与 图2 B和 2 D) ●●●●。 值得注意的是,D1的谱系包括Nieuwkoop中心的一部分,并参与原肠胚的前内胚层。 这张32细胞图与之前发布的命运图基本一致( Dale and Slack 1987年 ; Bauer等人,1994年 ); 观察到的微小差异可以通过我们选择的定期切割胚胎批次来解释( 克莱恩1987 )带有紧密粘附的小动物卵裂球。 缩写:AE,前内胚层。
(I–L)图显示了B1的下女儿和C1的上女儿在64细胞期(I)的注射,该图可靠地确定了BCNE在9期(J)、11期(K)和36期(L)的后代。 箭头表示胚孔。 缩写:fp,楼板; 不,脊索。
(4.39 MB TIF)。
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