向p63相关疾病的治疗迈进了一步

4月246/PRIMA-1^遇见拯救EEC患者细胞衍生物

p53转录因子家族包括p53、p63和p73。这三个家族成员在蛋白质水平上都有很高的同源性，尤其是在DNA结合域上。然而，这三种转录因子似乎发挥着不同的生物学功能。p53在大约50%的人类肿瘤中突变，在肿瘤抑制中起着关键作用，^3,4而p73和p63已被证明是发育中的调节因子。例如，p63的突变会导致皮肤和角膜等外胚层相关结构的缺陷。^5,6由于p53和p63的DNA结合域高度同源，化合物APR246/PRIMA-1^遇见重新激活用于癌症治疗的p53突变体（第一/二期临床试验）⁷可能能够恢复外胚层发育中p63的活性。基于这一原理，我们测试了APR246/PRIMA-1^遇见在去势、外胚层发育不良和唇腭裂（EEC）综合征患者建立的原代细胞中，p63-DNA结合域发生突变。EEC患者有肢体畸形、口面裂和外胚层发育不良，包括皮肤、头发、牙齿、指甲和几个外分泌腺的缺陷。此外，EEC患者患有进行性角膜缘干细胞缺乏症（LSCD），并伴有眼表炎症，导致进行性角膜病变。LSCD改变了角膜透明度，导致角膜血管翳，最终导致视力受损。用APR246/PRIMA-1测试了两种不同的模型系统^遇见即源自患者成纤维细胞的角膜上皮细胞，这些成纤维细胞首先被重新编程为诱导多能干细胞（iPSCs）¹和患者表皮的角质形成细胞。²通过角膜特异性基因表达检测，p63 EEC患者建立的iPSCs未能分化为角膜上皮细胞，而APR246/PRIMA-1治疗^满足恢复角膜上皮的功能。同样，从p63 EEC患者中建立的表皮分化缺陷的皮肤角质形成细胞用APR246/PRIMA-1治疗^遇见表皮标志基因表达增强。在这两个模型系统中，p63介导的分化的恢复可能是通过拯救p63靶基因的表达来实现的。这种合理药物测试的成功表明，对于由类似的潜在分子机制引起的表型不同的疾病，开发靶向治疗的可能性很有意思。

药物筛选的柔性细胞模型

我们报道的细胞模型是研究p63发病机制的灵活体外系统。由于皮肤是p63患者受影响的结构之一，从患者皮肤基底层分离出的角质形成细胞可能是研究这些患者受影响表皮发育最相关的细胞。我们的皮肤角质形成细胞体外分化模型基于表皮各亚层的标记基因表达，再现了表皮分化过程。因此，该模型可用于研究p63患者皮肤的详细细胞和分子疾病机制。除了皮肤问题外，p63突变患者还经常出现肢体畸形、唇腭裂、泌尿和肾脏问题。⁵此外，p63小鼠模型也显示心脏和胸腺发育缺陷。^8,9这些结构的正确发育取决于不同类型细胞和组织的增殖和分化。并非所有这些细胞和组织都能从患者那里轻易获得。p63患者的iPSC可以分化为不同的细胞谱系，因此为研究其他p63表型的疾病机制和进行药物筛选提供了合适的系统。

EEC综合征的体内治疗模型

确定APR246/PRIMA-1^遇见可用于治疗p63 DNA结合域突变的EEC患者，体内研究至关重要。到目前为止，现有的鼠标模型似乎不适合用于此目的。与人类p63疾病表型相似的皮肤、口腔面部和四肢具有明确表型的p63小鼠模型是p63基因敲除小鼠。^10,11然而，由于这些小鼠中没有p63或只有野生型p63（杂合敲除），APR246/PRIMA-1的作用^遇见无法想象。尽管报道了EEC综合征的R279H敲除小鼠模型，¹²除了纯合敲除小鼠的肢体表型外，其他表型的详细描述尚待描述。需要一个忠实的小鼠模型来测试APR246/PRIMA-1的作用^遇见关于p63控制的发育过程。此外，p63突变的EEC综合征患者存在明显的临床变异性，¹³这表明个体遗传背景是影响表型的重要因素，动物模型可能不足以说明APR246/PRIMA-1的疗效^遇见此假设与我们对APR246/PRIMA-1差异效应的观察结果一致^遇见针对不同的p63突变。^1,2因此，最好测试APR246/PRIMA-1^满足用患者细胞建立移植或移植物的体内模型。

角膜是EEC治疗的理想靶点

虽然没有合适的EEC综合征动物模型，但有几个论点认为APR246/PRIMA-1^遇见治疗可以直接在人类角膜上进行评估。首先，角膜因其易于接近而成为治疗的理想组织。第二，角膜上皮最终是无血管的，这为移植创造了一个相对优越的位置。第三，成功恢复人类患者的视力很容易监测。第四，EEC患者的LSCD-相关视力损害在年龄增长时出现，允许在症状发生之前或发生时对患者进行治疗。第五届，4月246/PRIMA-1^遇见该药物已经在难治性血液恶性肿瘤和前列腺癌患者的I/II期临床试验中进行了测试。⁷这种药物是静脉注射的，没有副作用。因此，这些临床数据强烈建议局部用药作为滴眼液应尽可能安全。手术切除EEC患者角化的角膜上皮会导致伤口愈合，并激活突变的p63基因表达。¹⁴4月246/PRIMA-1^遇见该药物应恢复p63及其靶基因的正常功能。然而，作为动物模型的替代品，EEC-iPSC可以在没有或存在APR246/PRIMA-1的情况下注射到受伤的小鼠角膜上^遇见在体内评价药物的治疗效果。

4月246/PRIMA-1^遇见-反应性突变体

在iPSC和角质形成细胞模型中，单个p63突变R304W和R204W（均为p63的DNA结合域）对APR246/PRIMA-1表现出不同的反应^遇见治疗。R304W突变体更容易被APR246/PRIMA-1重新激活^遇见而不是R204W突变，这可能是由于这两个突变的分子性质。已经表明APR246/PRIMA-1^遇见治疗导致对p53突变体的不同反应。¹⁵p63中的R304对应于p53中的R273，这是一种与DNA直接接触的残基。p53中R273的突变在很大程度上保留了野生型构象。¹⁶相反，p63中的R204对应于对DNA结合域的结构完整性很重要的p53 R175，该氨基酸的突变显示出严重的结构缺陷。p63突变体对APR246/PRIMA-1的不同反应^遇见治疗与之前显示的APR246/PRIMA-1的效果一致^遇见APR246/PRIMA-1的TAp63γ亚型^遇见恢复TAp63γR304W的促凋亡特性，而主要诱导TAp63βR204W细胞的生长停滞。¹⁷检测与EEC综合征有关的p63中的其他DNA结合突变将很有意义。

替代通用药物

APR246/PRIMA-1的选择^遇见这是基于我们对癌症中p53和发育中p63突变的分子机制的合理解释。许多化合物已被开发用于p53突变。其中，p53R3特异性恢复p53突变体R175H和R273H的DNA结合¹⁸将对测试非常感兴趣。其他可以通过其他机制稳定p53突变的化合物，如PhiKan083和CP-31398¹⁵也可以测试p63相关疾病模型。此外，我们的细胞系统也可以用于筛选一组化合物，包括那些已经批准用于临床的化合物，或进一步优化，以改善p63患者的表型缺陷。

附录：Shalom-Feuerstein R、Serror L、Abedam E、Müller FJ、van Bokhoven H、Wiman KG等。小化合物APR-246/PRIMA-1MET可挽救外胚层发育不良相关患者诱导的多能干细胞的上皮分化受损。国家科学院院刊。2013;110:2152–6. doi:10.1073/pnas.1201753109。

附录：Shen J，van den Bogaard EH，Kouwenhoven EN，Bykov VJ，Rinne T，Zhang Q，et al.APR-246/PRIMA-1MET拯救p63突变的EEC综合征患者皮肤角质形成细胞的表皮分化。美国国家科学院院刊2013；110:2157–62. doi:10.1073/pnas.1201993110。

潜在利益冲突的披露

没有披露潜在的利益冲突。