半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶1介导的饮食诱导脂肪性肝炎中纤维生成的调节

动物研究

这些实验方案得到克利夫兰诊所动物护理和使用委员会的批准。雄性C57BL/6小鼠，体重20至25克，购自Jackson实验室。C57BL/6半胱氨酸蛋白酶1(案例1^−/−)敲除小鼠（由位于康涅狄格州纽黑文的耶鲁大学的理查德·弗拉维尔博士慷慨提供）的描述如下(20,21). 将小鼠置于甲硫氨酸和胆碱缺乏（MCD）饮食（TD 90262，Teklad Mills）中，这已被广泛证明会导致与严重炎症和进行性纤维化相关的脂肪变性，病理学上与人类严重脂肪性肝炎相似(22,23). 在这个模型中，脂肪变性是由于脂肪酸线粒体氧化减少和脂肪酸以极低密度脂蛋白的形式输出减少所致(24). 相同的动物群(n个=每组5-7人）接受含5%脂肪的标准饮食（TD 2918，Teklad Mills，Madison，WI）作为对照（CTL）。在0周、1周、3周和6周时测量总体重。每组动物在6周后按各自的饮食进行处死。

在选择性研究中，将体重为20-25 g的C57BL/6雄性小鼠置于MCD饮食中，用于静脉注射包裹磷酸盐（PBS）或氯膦酸盐（CLOD）的脂质体（每组3~7只）。在MCD饮食5周后，每隔5天向动物注射两次，每次注射0.1毫升/10克体重的1毫克/毫升脂质体悬浮液，如前所述(25). 每组动物在6周后分别接受相应的治疗。

细胞系与培养

采用6周MCD饮食从C57BL/6小鼠中分离出原代小鼠肝细胞和总非实质细胞。将小鼠麻醉，用温热氧合Hanks（-）灌注肝脏，再灌注1mM EGTA和10mM HEPES，然后用每只小鼠含有10mg胶原酶的Williams E培养基。离心后收集肝细胞，用所得细胞悬液用Percoll梯度离心法收集非实质细胞总数。Caspase 1和IL-1β的表达通过western blot分析确定，详情如下。

组织病理学、免疫染色和血清分析

如前所述，禁食5小时后，在深度麻醉下采集血样和肝组织(26). 将肝组织固定在10%福尔马林中，并嵌入tissue Path（宾夕法尼亚州匹兹堡Fisher Scientific）。苏木精和曙红以及油红O染色的肝脏标本通过光学显微镜进行评估。按照制造商的说明，使用特定试剂盒进行肝甘油三酯测定（Pointe Scientific）。使用商业试剂盒（Sigma Diagnostics）进行血清丙氨酸氨基转移酶测定。由经验丰富的病理学家（BGP）以盲法对喂食MCD和CTL的动物的个体特征，包括脂肪变性程度、炎症和肿胀进行评估。根据NAFLD活动评分（NAS）对脂肪变性、炎症和膨胀进行评分(27).

肝caspase-1激活和细胞定位的评估

使用从Abcam购买的Caspase 1荧光测定试剂盒（cat.ab39412），使用200μg全肝蛋白测定Caspase l活性。使用标准DAB技术，用石蜡包埋的肝组织进行caspase 1的免疫组织化学。使用以下主要抗体：从Millipore购买的兔抗半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶1（猫06-503稀释1:80）。

细胞凋亡评估

制备组织切片（4μm），并按照制造商的说明进行末端脱氧核苷酸转移酶dUTP缺口末端标记（TUNEL）测定(就地细胞死亡检测试剂盒；罗氏分子生物化学公司，德国曼海姆）。通过使用裂解的Caspase-3抗体（细胞信号）对活性Caspase 3进行免疫染色来量化Caspase激活。如前所述，通过在5个随机显微镜场（40倍）中计数TUNEL阳性或活性caspase 3阳性细胞的数量来量化肝切片中的肝细胞凋亡(12).

肝纤维化的测定

肝纤维化用天狼星红定量。直接红80和快速绿FCF（颜色指数42053）由Sigma-Aldrich提供。肝切片在室温下在黑暗中与含有0.1%固绿FCF和0.1%直接红的饱和苦味酸水溶液孵育2小时(26). 将染色的载玻片在流动的蒸馏水下缓慢洗涤6分钟，脱水（每个步骤3分钟），安装，并通过光学显微镜检查。通过数字图像分析对红色胶原纤维进行定量，不包括血管。

免疫印迹和免疫沉淀分析

用购自Millipore的5μg兔抗caspase-1抗体（cat.06-503）免疫沉淀500μg总肝蛋白。使用30-40μg全肝裂解物、20μg肝细胞或非实质部分或免疫沉淀的裂解物进行免疫印迹分析。全肝裂解物和肝细胞/非实质样品用12-15%SDS-PAGE进行分离，免疫沉淀的肝裂解物样品用从Invitrogen购买的4-20%梯度凝胶（cat.EC60285BOX）进行分离，转移到硝酸纤维素膜上，并用适当的一级抗体进行印迹。用过氧化物偶联二级抗体（稀释度1:10000（BIOSOURCE International，Camarillo，CA）培养膜，并使用化学发光底物（ECL，Amersham Biosciences）和柯达X-OMAT胶片（Eastman Kodak，Rochester，NY）观察结合抗体。使用以下主要抗体：从Millipore购买的兔抗Caspase 1（cat.06-503稀释度1:80），从Abcam购买的兔抗白细胞介素1β（cat.Ab9722，稀释度1:5000）；从Abcam购买的含有caspse募集域（ASC）的兔抗凋亡相关斑点样蛋白（cat.ab64808稀释度1:1000）；从Abcam购买的兔抗α-平滑肌肌动蛋白（cat.ab5694稀释度1:500）。

实时PCR

使用RNeasy tissue Mini试剂盒（加利福尼亚州巴伦西亚，齐亚根）从肝组织中分离出总RNA。使用iScript cDNA合成试剂盒（Bio-Rad）从1μg总RNA合成逆转录本（cDNA）。进行实时PCR定量。简言之，25μl反应混合物包含：cDNA、Syber-Green缓冲液、Gold Taq聚合酶、dNTP和最终浓度为200μm的引物。用于定量PCR的引物序列如下：αSMA 5′-GTC CCA GAC ATC AGG GAG TAA和5′-TCG GAT TCA GCG TCA GGA；COL1A1 5′-CAA GAA CAG CAA CGA GTA CCG和GTC ACT GGT CAA CTC CAG CAC；转化生长因子-β5′-CTCCCTGGCTTCTAGTGC和5′-GCCTTGTGGAGAGGATCTGG；TNFα5′-CCC TCA CAC TCA GAT CAT CTT CT和5′-GCT ACG TGG GCT ACA G；F4/80 5′-CCCAGTGTCTTACAGAGTG和5′-GTGCCAGAGGTGTGTGTCT；CD11c 5′-CTG GAT AGC CTT TCT TCT GCT G和5′-GCA CAC TGT GTC CGA ACT CA；ASC 5′CTT GTC AGG GGA TGA ACT CAA AA和5′GCC ATA CGA CTC CAG ATA GTA GC；Casp1 5′ACA AGG CAC GGG ACC TAT G和5′TCC CAG TCA GTC CTG GAA ATG；IL-1 5′GCA ACT GTT CCT GAA CTC AAC T和5′ATC TTT TGG GGT CCG TCA ACT；IL-18 5′GAC-TCT-TGC-GTC-AAC-TTC-AAG-G和5′CAG-GCT-GTT-TGT-CAA-CGA；CRP2 5′GCTACGGAAAAG AAGTATGGACC和5′CTCAGTCAGTTAGACTCC.18S核糖体RNA 5′-和ACG GAA GGG CAC CAC CAG GA 5′-CAC CAC CCA CGG AAT CG作为内源性对照。在Mx3000P循环器（Stratagene）中进行RT-PCR：95°C 10 min，40个循环，在95°C下15 s，在60°C下30 s，在72°C下30s，然后在95°C下1min，在55°C下30ms，在95℃下30s。使用CT、ΔCT和ΔΔCT值，使用MxPro软件（Stratagene）计算对照样品的折叠变化。

统计分析

除非另有说明，否则所有数据均表示为平均值±S.E.M。通过方差分析比较3个或更多组之间的差异，然后进行事后Newman Keuls检验参数检验或Kruskall-Wallis非参数检验。通过双边学生t检验比较两组标准化数据之间的差异。差异被认为具有统计学意义第页< 0.05. 使用GraphPad Prism 4.0c进行所有统计分析。

肝Caspase-1激活是实验性NASH的一个显著病理特征

为了研究半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-1激活在NASH发病机制中的作用，我们首先将C57BL/6小鼠置于蛋氨酸和胆碱缺乏（MCD）饮食中，该饮食已被广泛证明与进展性纤维性脂肪性肝炎相关，其病理学类似于人类严重脂肪性肝炎(22,23). 在分别喂食6周后，我们观察到MCD喂养诱导的显著肝脏脂肪积累(图1A)伴随着肝损伤组织学参数的增加，包括肝脏炎症和肝细胞膨胀(图1A和表1). 与对照组相比，喂食MCD的小鼠中caspase 1的表达显著增加(图1B)伴随着ASC mRNA水平的增加，ASC是炎症小体的关键组成部分，是激活caspase 1和IL-1的蛋白平台，但不是IL-18(图1B). 喂食MCD饮食的小鼠肝脏的这些变化与炎症小体激活显著增加有关(图1C和D)，以及胱天蛋白酶1蛋白的表达和活性水平(图1E-G)与这些数据一致，与CTL小鼠相比，喂食MCD的动物肝脏活性成熟IL-1β蛋白表达也显著增加(图1H和I). 对两组小鼠肝脏切片的免疫组织化学分析显示，胱天蛋白酶1主要定位于非实质正弦细胞，在较小程度上定位于肝细胞(图1J). 通过将喂食MCD动物的肝组织分馏成肝细胞和总非实质细胞进一步证实了这一点，这进一步表明，与肝细胞相比，非实质部分中caspase 1和IL1β蛋白的表达显著增强(图1K).

半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-1抑制与肝甘油三酯积累和炎症活动之间的分离有关

在确定MCD喂养小鼠肝脏中存在炎症小体激活和caspase-1活性增加后，我们接下来利用caspase-1基因敲除小鼠研究caspase-2是否参与NASH的发育(案例1^−/−). 我们首先调查了案例1^−/−小鼠对肝脏脂肪变性和炎症具有抵抗力。将C57BL/6野生型Casp1基因敲除小鼠置于MCD饮食或对照（CTL）饮食中6周案例1^−/−小鼠在MCD饮食中的体重变化相似(图2A). 然而，H&E和油红O染色的显微镜检查显示Casp1^−/−与食用MCD饮食的WT小鼠相比，食用MCD食物的小鼠发生了更为显著的大泡状肝脂肪变性(图2B、C). 与这些结果一致，肝甘油三酯水平在案例1^−/−与MCD饮食的WT小鼠相比(图2D). 对与NASH相关的其他个体特征的肝脏样本进行组织学检查，发现炎症灶减少，导致炎症活动评分降低案例1^−/−MCD饮食小鼠与WT饮食小鼠的比较(表1). 然而，两组小鼠的总NAFLD活性评分（NAS）相似，这主要是因为MCD-fed Casp1中脂肪变性程度较高以及肝细胞气球化程度较高^−/−老鼠(表1). 血清ALT水平在案例1^−/−与喂食对照饮食的动物相比，喂食MCD饮食的小鼠和WT小鼠(图2E). 接下来，我们在分子和细胞水平上检查了肝脏的炎症状态，发现喂食MCD的MCD-α、F4/80和CD11c的mRNA水平显著降低案例1^−/−小鼠与MCD饮食中的WT动物的比较(图2F、G、H).

通过不依赖于caspase 3激活和凋亡的caspase 1抑制，MCD饮食诱导的HSC激活和胶原沉积减少

caspase 1在肝细胞损伤和炎症信号传导中的关键作用（这两个事件与HSC激活有关）的发现使我们进一步研究了caspase 2在MCD饮食诱导的纤维化和纤维化中的作用。然而，正如预期的那样，在MCD饮食六周后，野生型动物HSC活化和纤维化相关基因的mRNA表达显著增加，如TGFβ、αSMA、COL1A1和CRP2(图3A-D). 这些变化在案例1^−/−MCD喂养的小鼠。此外，在喂食WT MCD的小鼠中，αSMA蛋白表达增加，而在案例1^−/−MCD喂养小鼠(图3E、F). 更重要的是，与对照组动物相比，MCD饮食中的野生型动物的胶原蛋白沉积几乎增加了四倍，这一点可以通过肝组织天狼星红染色结合数字图像分析定量来证明(图3G，H)而胶原蛋白沉积的增加在案例1^−/−小鼠，尽管仍高于CTL饮食的小鼠(图3G，H). 接下来，我们量化了不同组小鼠中肝细胞死亡的数量。在WT动物和案例1^−/−MCD饮食小鼠与CTL饮食动物的比较(图4A–D).

综上所述，这些观察结果表明，在NASH发育过程中，肝细胞中caspase 1的激活在肝细胞损伤、炎症信号传导、HSC激活和肝纤维化中起着重要作用，与caspase 3激活和肝细胞凋亡无关。

MCD诱导的脂肪性肝炎中选择性Kupffer细胞耗竭可减少caspase 1的激活并防止纤维化和纤维化

炎症小体激活的发现以及caspase 1和IL-1β的显著增加，主要来自喂食MCD的动物肝脏的非实质细胞，再加上炎症小体主要存在于单核细胞和巨噬细胞，这一事实导致我们假设Kupffer细胞，即肝内驻留的巨噬细胞，是这些变化的主要来源。为了验证这一假设，我们接下来研究选择性耗尽枯否细胞对caspase 1表达和MCD诱导的肝损伤的影响。在喂食6周MCD饮食的C57BL/6 WT小鼠的最后一周内，用氯膦酸盐（CLOD）或PBS载体（PBS）脂质体静脉注射两次。CLOD和PBS处理的MCD喂养小鼠的肝脏脂肪变性没有变化(图5A). 肝脏F4/80免疫染色证明了CLOD治疗对肝脏Kupffer细胞耗竭的有效性(图5A). 通过RT-PCR测定TNFα、F4/80和CD68的mRNA水平，进一步证实了这一点，与PBS处理的MCD喂养小鼠相比，CLOD处理组的TNFα，F4/80及CD68 mRNA水平显著降低(图5B). 更重要的是，通过肝组织免疫组织化学和全肝裂解物免疫组化分析检测到，在CLOD治疗的MCD喂养小鼠中，caspase 1蛋白表达也显著降低(图5C-E). 这些变化与纤维生成相关基因表达减少有关(图5F)以及CLOD处理的MCD喂养小鼠胶原沉积显著减少(图5G). 这些数据强烈表明，Kupffer细胞是MCD饮食诱导的脂肪性肝炎中活性caspase 1的主要细胞来源。