介绍
肝纤维化由一系列慢性炎症疾病引起,包括病毒性肝炎、酒精性和非酒精性脂肪性肝炎、免疫损伤、原发性胆汁性肝硬化等 [1] 慢性炎症后胶原蛋白的积累是由一系列事件驱动的,这些事件涉及肝脏常驻细胞和循环免疫细胞产生的细胞因子。 由于这些炎症刺激,Diss空间中静止的星状细胞被激活为肌纤维母细胞样细胞,分泌胶原蛋白。 胶原和其他细胞外基质分子的积累远远超过了从常驻和浸润巨噬细胞释放的金属蛋白酶对它们的降解。 随着损伤的持续,纤维化最初在门静脉束或中央静脉周围发展,最终形成桥接性纤维化,结节形成被纤维组织的厚带包围,最终发展为肝硬化。 肝硬化肝结构的扭曲会导致门脉高压并发症、肝细胞功能降低和肝癌风险。
虽然导致纤维化的潜在疾病的治疗已经取得进展,例如病毒性肝炎的治疗,但目前还没有批准的治疗纤维化的疗法。 许多潜在的抗纤维化靶点已经确定,许多药物已经在临床试验中进行了测试 [2] , [3] .
最近描述的一个潜在治疗靶点是半乳糖凝集素-3蛋白。 半乳糖凝集素是一个由15种蛋白质组成的家族,具有与糖蛋白等大分子上的末端半乳糖残基结合的碳水化合物结合结构域 [4] , [5] 半乳糖凝集素-3蛋白,一种在免疫细胞中表达的显著半乳糖凝蛋白,在炎症中显著增加 [5] —— [7] ,最近在一些疾病模型中被牵涉到纤维化的发病机制。 例如,半乳糖凝集素-3缺失小鼠对四氯化碳导致的肝纤维化具有抵抗力 [8] 以及高脂肪饮食时脂肪性肝炎和纤维化的发展 [9] 此外,半乳糖凝集素-3缺失小鼠的其他器官对包括肺在内的纤维生成具有抵抗力 [10] 和肾脏 [11] 根据这些数据,似乎半乳糖凝集素-3蛋白与炎症或毒性损伤导致的纤维化发展有关,从而为拮抗其治疗纤维化的功能奠定了基础。
在本研究中,我们利用大鼠肝纤维化和肝硬化模型评估了与半乳糖凝集素-3蛋白以及半乳糖凝蛋白-1结合的复合碳水化合物药物的作用。 这些药物,GR-MD-02和GM-CT-01,似乎具有良好的耐受性,并促进硫代乙酰胺诱导的肝损伤后纤维化的显著消退。
材料和方法
药物化合物
GM-CT-01是一种线性多糖,分子量约为54 KDa,源自瓜尔豆半乳甘露聚糖,瓜尔豆半乳糖由(1,4)连接的β-D-甘露糖主链组成,平均每1.7个甘露糖残基含有(1,6)连接的α-D-半乳糖侧分子。 在这些研究中,GM-CT-01是按照美国专利#7893252所述生产的。
GR-MD-01是一种半乳糖-氨基半乳糖醛酸聚糖多糖,分子量约为120 KDa,主链主要由1,4-键半乳糖醛酸(GalA)部分组成,主链成分较少,由交替的1,4-键GalA和1,2-键鼠李糖组成,而鼠李糖又与任意数量的侧链相连, 主要包括1,4-β-D-半乳糖。 GR-MD-01按照美国专利#8236780所述生产。 GR-MD-02是一种半乳糖阿拉伯半乳糖-半乳糖半乳糖醛酸聚糖多糖,分子量约为50 KDa,其主链与GR-MD-01相同,侧链包括1,4-β-D-半乳糖苷(Gal)和1,5-α-L-阿拉伯糖(Ara)。 GR-MD-02按照专利号PCT/US12/55311的规定生产。
大鼠纤维化模型
进行了两组分析,第一组在中国复旦大学,第二组在纽约西奈山伊坎医学院。 复旦大学(中国上海)的研究人员进行了一项比较GR-MD-01和GR-MD-02的实验 根据与Galectin Therapeutics签订的合同,使用160至200克的雄性Sprague–Dawley大鼠,从复旦大学动物研究中心获得,根据《实验动物护理和使用指南》(实验动物资源研究所,1996年,Nat.Acad.Press)进行维护 并经复旦大学(中国上海)动物保护和使用机构委员会(IACUC)批准。 实验结束时,在苯巴比妥麻醉下对动物实施安乐死。 在两周的适应期后,开始了一个八周的纤维化诱导期,在此期间,所有大鼠均接受TAA(Bomei Biological and Technology Co.,产品编号BM1257-1)无菌溶液的腹腔注射(IP),溶解于0.9%盐水中,每周注射两次。 在治疗的最初一周,TAA方案是每两周注射0.25 g/kg体重的IP,然后是每七周注射0.20 g/kg体重,共注射八次。 为了评估纤维化的进展,在第4周和第8周结束时,对每个时间点的两只大鼠进行安乐死,并对肝脏进行组织学检查。 在此期间,一只大鼠在注射TAA期间死于腹部出血。
在西奈山使用280至300 g的雄性Sprague–Dawley大鼠(Jackson实验室)进行GR-MD-02与GM-CT-01的比较实验,这些大鼠根据NIH指南进行维护,并由西奈山动物护理和使用机构委员会(IACUC)批准。 在研究期间,大鼠被保存在动物护理设施中,在恒定温度下进行12小时的光-暗循环,并可自由饮水。 通过IP给动物注射150 mg/kg TAA(西格玛化学公司,美国密苏里州圣路易斯),每周三次,持续11周,以诱导肝硬化。 从第8周开始,第1组大鼠每周两次腹腔注射0.9%氯化钠(IP),连续四周。 从第8周开始,第2、3和4组,大鼠分别以60mg/kg的浓度给予GR-MD-02 IP,每周两次,持续四周,60mg/kg的浓度每周一次,持续四周,90mg/kg的浓度每周一次,持续四周。 从第8周开始,第5组、第6组和第7组分别以105 mg/kg的浓度每周两次给药四周,105 mg/kg每周一次给药四周,180 mg/kg每周给药四周。
在治疗期结束时,大鼠被吸入1-5%的异氟烷麻醉,然后进行剖腹手术。 在处死时,用一根插入门静脉的16G血管导管测量门静脉压力,以测量水柱的高度。 取下肝脏,称重,并使用最大肺叶中的碎片进行进一步分析。 脾脏也被取出并称重后丢弃。
血清氨基转移酶的测定
在比较GR-MD-02和GM-CT-01的实验中,用含有微量离心管的EDTA(每毫升血液1.5毫克)采集血液,以5000转/分的速度造粒10分钟,并获取血浆样本,用于使用VITROS®5,1 FS(Ortho Clinical Diagnostics)测量血清丙氨酸和天冬氨酸转氨酶(ALT/AST)和肌酐水平。 如果需要确保分析在线性范围内,用含有7%BSA的VITROS®稀释血浆。
肝脏组织学和纤维化量化
在比较GR-MD-01和GR-MD-02的实验中,将肝脏固定在10%福尔马林中,包埋在石蜡中,切片厚度为4mm,用苏木精伊红(H&E)染色,并分别进行天狼星红染色。所有病理评估均由经验丰富的病理学家随机、盲法进行。 使用计算机图像分析系统(KS400图像分析软件和蔡司显微镜)定量胶原蛋白表面密度。 幻灯片也由一位经验丰富的肝脏病理学家使用改良的Ishak评分系统(0-6)进行评分,他对动物组不了解。
在比较GR-MD-02和GM-CT-01的实验中,将肝脏固定在3.7%福尔马林中,包埋在石蜡中,切割4mm厚,并用H&E染色进行组织学检查。 肝脏切片也用0.1%天狼星红和0.1%固绿在饱和苦味酸中染色(Sigma Chemical Co.)。 每只动物采集四张天狼星红色染色的玻片,每只玻片随机采集九张图像,每只动物共采集36张图像,使用计算机化BIOQUANT Life Science形态计量学®系统进行胶原蛋白定量。
此外,对来自四个治疗组的33个H&E染色肝脏切片进行了盲法组织学评估。 在100倍放大的条件下,从六个随机切片中对八个组织学特征进行评分,从而确定每张幻灯片的最低评分为48分。 这些特征包括导管反应(评分0-3)、门静脉和小叶独立炎症(0-无,1-轻度,2-中度,3-重度)、存在或不存在包含导管反应的非典型细胞、脂肪变性程度(0-没有,1<30%,2>30但<60%,3->60%)、脂肪空泡类型(微泡或大泡) 和气球状变性(0-无,1-偶发,2-多于偶发,3-细胞众多)。 此外,对薄壁组织中是否存在色素进行了评估。 用天狼星红染色玻片评估纤维化程度。 给出了Scheuer方案(0-4)和Ishak纤维化评分(0-6)。
细胞培养实验
LX-2电池 [12] 和原代人类星状细胞,如前所述分离 [13] ,保存在含有10%胎牛血清和1%青霉素类抗生素(Gibco,Invitrogen)的高糖杜尔贝科改良鹰培养基中。 用GM-CT-01、GR-MD-01或GR-MD-02在含有0.02%BSA或10%胎牛血清的培养基中以0.1 mg/ml和高达2 mg/ml的浓度处理细胞12、24、48或72小时。
细胞增殖试验
DNA合成通过测量 三 H-胸腺嘧啶掺入。 LX-2细胞以每孔20000个细胞的密度接种在24孔板中。 24小时后,将培养基更换为含有0.2%BSA的Dulbecco改良Eagle培养基12小时,然后用0.1 mg/ml或1 mg/ml的GM-CT-01、GR-MD-01、GRM-MD-02处理细胞12或24小时,以及1µCi/ml 三 收获前4小时添加H-胸苷。 然后用冰镇PBS清洗细胞三次,并在4°C的甲醇中固定30分钟。 细胞在0.25%氢氧化钠/0.25%十二烷基硫酸钠中溶解。 在用1 N盐酸中和后,使用闪烁计数器(贝克曼·库尔特)测量放射性。
细胞凋亡分析
按照制造商的说明,使用Annexin V凋亡检测试剂盒APC(Ebioscience)检查凋亡证据,然后进行荧光激活细胞分选。 为了检测LX-2细胞中的片段或凋亡DNA(小DNA片段),根据制造商的指南,使用凋亡DNA阶梯提取试剂盒(美国山景城BioVision)从经0.1 mg/ml GM-CT-01、GR-MD-01或GR-MD-02和载剂处理48小时的LX-2电池中分离出DNA。 样品在2%琼脂糖凝胶中运行,用溴化乙锭染色,并通过紫外线透照进行可视化。
西部印记
使用RIPA裂解缓冲液(50 mM Tris-HCl pH=8,150 mM NaCl,1%IGEPAL,0.5%脱氧胆酸钠和0.1%SDS)以及完整的蛋白酶抑制剂混合物和蛋白磷酸酶抑制剂混合物(Roche和Thermal Fisher)从细胞或肝组织中提取总蛋白。 蛋白质浓度用Bio-Rad DC试剂盒(Bio-Read)测定。 用于分析LX-2细胞的抗体如下:α-SMA(Millipore,#04-1094)、MMP2(Abcam,#7298)、MCP-1(Santa Cruz,Sc-130328)和GAPDH(Abcam#9482)。 用于肝组织分析的抗体如下:兔抗I型胶原(1∶2000)(Rockland)、鼠抗α-SMA(1∶500)(Abcam)和兔抗GAPDH(1∶200)(Santa Cruz)。
逆转录和实时定量PCR
在比较GR-MD-02和GM-CT-01的TAA大鼠实验中,以及在LX-2细胞实验中,使用RNeasy Mini试剂盒(Qiagen,Valencia,CA,USA)从100 mg大鼠肝组织或细胞中提取和纯化mRNA,并将1µg总mRNA逆转录为互补DNA(cDNA) 在LightCycler®480实时PCR系统(Roche)上,使用Sprint™RT Complete-RNA对cDNA EcoDryTM Premix(双引物)管(Clontech,Mountain View,CA)和各种标记的mRNA进行定量PCR分析。 数据表示为GAPDH正常化后成纤维基因的相对表达。
酶谱学
根据Invitrogen方案,使用Novex 10%酶谱明胶凝胶(Invitrogen)测定LX-2中MMP-2的酶活性。
半乳糖凝集素-3免疫组织化学
使用二甲苯对载玻片进行脱蛋白处理,并使用Diva de-Cloaker(Biocare,批号111612)在120°C下进行抗原提取,持续30秒,然后在95°C下持续15秒。 用TBS Auto-Wash(Biocare,批号03813B)将载玻片冲洗两次,并将Sniper(Biocear,批号072312)作为蛋白质块使用60分钟。 将半乳糖凝集素-3的一级抗体(来自PeproTech的抗半乳糖凝素-3兔多克隆,cat.#500-p246)连续稀释至0.1µg/mg的工作浓度,涂抹并在4°C下放置在载玻片上过夜。 载玻片用TBS Auto Wash冲洗两次,过氧化物酶阻断剂过氧化物酶1(Biocare,批号041012)应用5分钟,然后用TBS Auto Wash冲洗两次# 邮编:H10061 )用达芬奇绿抗体稀释液(Biocare,批号110612)将初始浓度1.3 mg/mg稀释1∶500,并涂敷30分钟。用TBS Auto-Wash冲洗两次载玻片,然后涂敷第三抗体(ABC Elite;Vector Labs)30分钟,两次冲洗后, 使用chromagen(Sigma Fast DAB,Sigma lot#LSBB5930)进行5分钟的开发。 用苏木精对载玻片进行复染。
结果
两种半乳糖基葡萄糖酸盐化合物的抗泡沫活性评价
最初,对TAA治疗大鼠的GR-MD-01和GR-MD-02进行评估,以选择在未来实验中使用的最佳药物。 大鼠接受八周的TAA治疗,累计给予的TAA量为3200 mg/kg,然后以每周两次60 mg/kg的剂量或0.9%的生理盐水作为载体对照,接受四周的GR-MD-01或GR-MD-02治疗( 图1 ). 动物对治疗耐受性良好,没有观察到明显的不良反应。
图1。 实验设计。
TAA=硫代乙酰胺; ip=腹腔注射。
图2 显示了各组肝脏切片中用天狼星红染色的典型组织学图片。 车用治疗动物的肝脏在门脉和中央区域都有胶原蛋白,形成良好的胶原链连接门脉和中心区域(开放箭头)。 治疗组(第2组和第3组)的胶原蛋白数量减少,桥接纤维化区域明显减少,有证据表明桥接不完全,表明纤维化得到了解决(实心箭头)。
图2。 实验中描述的天狼星红染色肝切片的代表性组织学
图1
.
从每个实验组中选择一张显微照片,该照片大约等于该组天狼星红染色面积百分比的平均值; 闭合箭头=桥接纤维化的不完整(断裂)链。
按照方法中的描述,使用每只动物的多张载玻片的天狼星红染色的数字形态定量法,盲目评估各组之间的胶原蛋白量( 图3 ). 根据天狼星红染色和形态计量学,TAA治疗四周后,车用对照动物出现了显著的纤维化,占肝脏总面积的6%至7%。 每周两次60 mg/kg剂量的GR-MD-01降低了胶原蛋白的数量,但与溶媒对照组的差异没有达到显著性。 每周两次60 mg/kg剂量的GR-MD-02使天狼星红染区显著减少,具有统计学意义。
图3。 实验中天狼星红阳性组织百分比的图示
图1
.
进行的统计分析是单向方差分析和Bonferroni后验,比较三组* = 与车辆组相比,p<0.05。
本实验的结果表明,这两种化合物都能降低TAA治疗大鼠的纤维化程度。 此外,除了胶原减少外,还存在结构变化,表明纤维化严重程度的退化,纤维桥减少。 因为GR-MD-02具有更强健的效果,所以进一步的实验使用了该药剂。
GR-MD-2和GM-CT-01抗纤维化活性的评价
在本实验中,在由更强烈的TAA给药方案诱导的更晚期纤维化中,将GR-MD-02与GM-CT-01的治疗进行比较。 大鼠接受TAA治疗11周,累积剂量为4950 mg/kg,在最后4周,使用不同的给药方案添加GR-MD-02或GM-CT-01治疗( 图4 ). 该实验设计的一个关键特征是在药物治疗期间继续进行TAA治疗。 动物对治疗耐受性良好,未观察到明显的不良反应。
图4。 实验设计。
TAA=硫代乙酰胺; ip=腹腔注射。
图5 描绘了天狼星红色染色的图形表示 图6 显示了选定的每组的代表性组织学图片,以近似定量分析的平均值。 本实验中的大鼠出现了严重的纤维化,在载体处理的对照动物中,平均超过25%的肝脏被天狼星红染色。 GR-MD-02和GM-CT-01治疗均减少了纤维化。 每周两次服用60 mg/kg的GR-MD-02后,天狼星红染色略有减少,但无统计学意义,而每周服用一次60 mg/kg则无任何影响。 相比之下,每周给予一次90 mg/kg剂量的GR-MD-02与给药对照大鼠相比,显著降低了天狼星红染色2.5倍以上,具有高度统计学意义。 GM-CT-01表现出非常相似的模式,每周给药一次180 mg/kg的治疗效果最大。
图5。 实验中天狼星红阳性组织百分比的图示
图4
.
采用单因素方差分析(One-Way ANOVA)进行统计分析,然后进行Dunnett多重比较测试,将各组与第1组分别进行比较。 显示了平均值、标准偏差和调整后的p值。
图6。 实验中描述的天狼星红染色肝切片的代表性组织学
图4
.
从每个实验组中选择一张显微照片,该照片大约等于该组天狼星红染色面积百分比的平均值。N=结节; 闭合箭头=桥接纤维化的不完整(断裂)链。
由经验丰富的肝脏病理学家对第1、4和7组中每只动物的6张独立幻灯片进行组织学分期,该病理学家对治疗条件一无所知。 该分析表明,所有经溶媒治疗的对照动物都患有Ishak 6期纤维化或肝硬化( 图7A )有较厚的胶原带和结节形成( 图6 ). 经GR-MD-02和GM-CT-01治疗的动物肝切片在纤维化阶段显著减少,大多数显示肝硬化逆转( 图7A ). 代表幻灯片 图6 纤维间隔明显变薄,间隔明显不完整,箭头突出显示。 这些发现表明,在持续TAA治疗的情况下,GR-MD-02和GM-CT-01都促进了胶原蛋白的退化和与肝硬化相关的结构改变的逆转。
图7。 第1组(V)、第4组(GR)和第7组(GM)肝脏切片的组织学分析
图4
.
如材料和方法所述,由经验丰富的病理学家对每只动物的肝脏组织学进行盲法评估。 统计分析采用非参数测量的Mann-Whitney检验,图表显示中位数和四分位范围。 A类 :Ishak分数; B: 门脉炎; C: 肝细胞气球变性。
与溶媒对照组相比,经GR-MD-02和GM-CT-01治疗的动物的门脉炎症和肝细胞气球样变性减轻。 对所有动物进行的门脉炎症分析显示,GM-CT-01显著降低,GR-MD-02接近显著降低( 图7B ). 与对照组相比,两个治疗组的肝细胞气球样变性均显著减少( 图7C ). 在溶媒治疗的对照组中,有证据表明导管反应性(平均得分2.14),但在治疗的动物中没有显著降低。 然而,与GR-MD-02(第2个,共7个)和GM-CT-01(第3个,共8个)治疗动物相比,对照动物(第6个,共八个)的导管异型性更多。 所有动物的小叶炎症和脂肪变性都很轻微。
将正常大鼠和实验组的门静脉压力测量值进行比较( 表1 ). 组织病理学显示,经车辆治疗的对照动物的门静脉压力显著升高,与肝硬化一致。 两个治疗组(均给予GR-MD-02)的门静脉压力在统计学上显著降低,而其他几个组的压力呈下降趋势。 这些数据表明,肝纤维化的减轻和肝硬化结构改变的逆转也与门脉高压的改善有关。
表1。 大鼠处死时的门脉压力。
治疗
入口压力(cm水)
平均值(标准偏差)
第1组:车辆控制
20.3(2.4)
第2组:GR-MD-02
15.7 (2.9) *
第3组:GR-MD-02
18.9 (1.4)
第4组:GR-MD-02
17.1 (2.4) *
第5组:GM-CT-01
20.8 (1.9)
第6组:GM-CT-01
19.6 (2.4)
第7组:GM-CT-01
18.5 (3.7)
正常大鼠
10.5 (2.4) **
纤维化大鼠血清转氨酶升高( 表2 )与车辆治疗的对照组相比,一些组的肝纤维化程度有所降低,但这些测量结果并没有明确地与纤维化测量结果平行。
表2。 实验的生化数据如所示 图4 .
治疗
%胶原蛋白(天狼星红)
转化生长因子β-R1(mRNA)
胶原蛋白(信使核糖核酸)
胶原蛋白(蛋白质)
α-SMA(mRNA)
α-SMA(蛋白质)
天冬氨酸转氨酶(单位/升)
谷丙转氨酶(IU/L)
第1组(车辆)
26 (4.5)
1 (0.06)
1
1 (0.3)
1
1 (0.25)
121 (27)
107 (25)
第2组(GR)
22 (1.8) *
1.19(0.08)
1 (0.37)
0.45 (0.05)
0.81 (0.27)
0.7 (0.41)
112 (58)
97 (16)
第3组(GR)
25.5 (7)
0.81 (0.22)
0.69 (0.12) *
0.68 (0.22)
0.77 (0.46)
0.99 (0.14)
86 (20) *
88 (16)
第4组(GR)
9.5 (2.9) **
1.06 (0.56)
0.77 (0.18) *
0.29 (0.06) *
0.58 (0.19) *
0.67 (0.17)
115(30)
93 (17)
第五组(总经理)
23.5 (5.5)
1.14 (0.17)
0.93 (0.33)
0.83(0.4)
0.96 (0.19)
1.2 (0.28)
108 (19)
93 (17)
第6组(GM)
18 (7.7) *
1.19 (0.42)
1.1 (0.26)
0.35(0.13) *
0.92 (0.38)
0.65 (0.1)
91 (11) *
82 (12) *
第7组(GM)
15 (5.6) **
1.67 (0.44)
0.77 (0.26)
0.23(0.17) *
0.88 (0.42)
0.47 (0.24) *
82 (15) *
77 (10) *
正常
0.28
0.2
0.06 (0.01) **
0.35
0.14 (0.01) *
80 (11) *
70 (8) *
半乳糖凝集素-3表达的评估
用免疫组织化学方法评估半乳糖凝集素-3蛋白的表达。 作为半乳糖凝集素-3染色的阳性对照,大鼠结肠显示出结肠上皮的强染色( 图8A )当一级抗体从染色方案中去除时,没有非特异性染色( 图8B ). 正常肝切片很少染色,只有零散和罕见的Kupffer细胞染色( 图8C )如文献中所述 [14] TAA治疗的溶媒对照组(第1组)的肝脏在两个肝小叶中均显示galectin-3染色,在扩张的门静脉束和纤维间隔中表现显著( 图8D ). 门脉区和纤维间隔中染色的细胞具有巨噬细胞的形态,如高倍镜下的上面板所示 图8E 在肝小叶中,细胞染色似乎是Kupffer细胞( 图8D )以及具有星状细胞外观的细长正弦细胞(下面板 图8E ). 在接受TAA治疗的纤维化动物中,门静脉束和纤维间隔的主要染色与之前文献中对两种接受TAA的大鼠所描述的一致 [14] 和用四氯化碳治疗的小鼠 [8] .
图8。 半乳糖凝集素-3免疫组织化学。
A: 大鼠结肠B。缺失半乳糖凝集素-3抗体的大鼠结肠; C: 正常大鼠肝脏; D: TAA治疗大鼠肝脏 图4 并用车辆进行处理(第1组); E: 上面板显示染色的门脉巨噬细胞高倍镜; 下部显示染色的小叶窦细胞,形态为星状细胞。 F: TAA治疗大鼠肝脏 图4 用GR-MD-02处理(第4组); G: TAA治疗大鼠肝脏 图4 用GM-CT-01治疗(第7组)。
用GR-MD-02(第4组)或GM-CT-01(第7组)处理的动物的染色模式在两组中相似,如 图8F和8G 分别是。 与溶媒对照组相比,用半乳糖凝集素-3染色的门静脉和间隔巨噬细胞数量减少,而在第4组染色的细胞似乎染色更苍白。 两组均可见Kupffer和星状细胞的散在小叶细胞染色,与溶媒对照组的染色无明显差异。 这些结果表明,在TAA诱导的纤维化大鼠中,表达半乳糖凝集素-3的细胞显著增加,并且两种药物的治疗均导致门脉区和纤维间隔中表达半乳糖凝集素3的巨噬细胞数量减少。
TAA诱导肝纤维化的分子分析
通过实时PCR对GR-MD-02和GM-CT-01实验中大鼠肝脏中驱动纤维化过程基因的一些mRNA进行评估,包括胶原蛋白1(COL1)、α-1平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、β-血小板衍生生长因子受体(β-PDGFR)、转化生长因子β受体1(TGFBR1)、, 基质金属蛋白酶1和2(MMP-1和MMP-2),以及金属蛋白酶组织抑制剂1和2中(TIMP-1和TIMP-2)。 其中三个标记物与正常肝脏进行了比较( 表2 ). 与正常大鼠肝脏相比,载体和TAA处理的大鼠肝脏中TGFBR1mRNA的表达增加了3.6倍( 表2 ). 同样,在给药动物中,α-SMA mRNA的表达增加了2.8倍,COL1 mRNA增加了5倍( 表2 ).
对治疗组动物和对照组动物的纤维蛋白相关mRNA表达进行比较。 与车辆治疗对照组相比,GR-MD-02治疗组3和4的COL1 mRNA水平分别降低了31%(p<0.05)和23%(p<0.05)。 在GM-CT-01治疗的第7组中,COL1 mRNA有降低的趋势,但这没有达到显著性( 表2 ). α-SMA mRNA的表达在一些组中呈下降趋势,但仅在第4组(GR-MD-02)中达到显著水平,减少了42%(p<0.05)( 表2 ). TGFβ-R1mRNA在载体组和治疗组之间没有显著差异( 表2 ). 其他转录物的分析没有显示出与载体对照动物的显著差异,包括βPDGF-R、TIMP-1、TIMP-2和MMP-2(数据未显示)。
Western blot用于评估COL1和α-SMA蛋白水平的差异( 图9 ). 与车辆处理的动物相比,所有处理组的胶原蛋白表达都有下降的趋势,GR-MD-02处理的第4组和GM-CT-01处理的第6组和第7组的水平在统计学上显著降低( 表2 ). α-SMA蛋白的水平变化更大,但在GR-MD-02治疗的第4组动物中有下降的趋势,而在GM-CT-01治疗的第7组动物中则有统计学意义上的下降( 表2 ). 值得注意的是,胶原蛋白的减少程度大于COL1 mRNA的相对减少程度。与其他mRNA相关的蛋白质水平未进行评估。
图9。 实验中动物肝脏分离蛋白的Western blot分析
图4
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COL1=1型胶原蛋白; α-SMA=α-平滑肌肌动蛋白; C=正常大鼠肝脏蛋白; β-微管蛋白作为内部对照。
半乳糖凝集素-3抑制剂对培养的星形细胞的最小直接作用
为了探索半乳糖凝集素-3抑制剂抗纤维化作用的潜在机制,我们使用了LX-2细胞系,这是一种永生化的人类肝星状细胞系,已被广泛用于评估纤维化介质的激活和表达机制 [2] , [12] , [15] 免疫组织化学证实,该细胞系同时表达galectin-1和galectin-3(数据未显示)。 该细胞系用于评估抗半乳糖凝集素复合碳水化合物的作用。
用递增浓度的抗半乳糖凝集素药物处理LX-2细胞。 这些研究中使用的每种药物浓度的增加不会影响细胞生长或生存能力( 图10 ). 此外,使用annexin V凋亡检测试剂盒APC(Ebioscience)或通过DNA片段检测没有发现凋亡的证据( 图11 ).
图10。 复合物对LX-2细胞生长和活性的影响评估。
A类 :与浓度为0.1 mg/ml的药物化合物培养12小时和24小时时,胸腺嘧啶掺入。 B :与浓度为1.0 mg/ml的药物化合物培养12小时和24小时时胸腺嘧啶掺入。 C :用浓度为2 mg/ml的药物化合物培养12、24、48、72小时后的细胞存活率。
图11。 LX-2细胞凋亡评估。
A.使用Annexin V凋亡检测试剂盒APC(Ebioscience)治疗后的荧光激活细胞分选。 B.2%琼脂糖凝胶,用溴化乙锭染色,并在使用Apoptotic DNA Ladder Extraction Kit(BioVision,Mountain View。样品均在同一凝胶上分析;图上的不连续性是由于去除了不同批次的GM-CT-01的重复样品,得到了相同的结果。
在用GR-MD-02和GM-CT-01治疗后,在LX-2中评估与纤维化和星状细胞活化相关的mRNA,包括α-SMA、β-PDGFR、TGF-β1、TGFBR1、MMP-2和TIMP-1。 培养12小时和24小时后,这些转录本中没有任何显著变化。 然而,两种药物治疗后48小时TGFBR1 mRNA显著下降( 图12 ). MMP2和α-SMA的蛋白质分析证实了这些发现,在这种情况下,随着药物剂量的增加,治疗没有改变( 图13A ). 酶谱分析结果表明,LX-2细胞中金属蛋白酶活性较高,且与药物处理无关( 图13B ). 还评估了人星形细胞的原代培养,与LX-2细胞一样,药物治疗后α-SMA蛋白没有变化( 图13B ).
图12。 培养48小时后LX-2细胞的mRNA表达。
药物浓度为0.1/ml培养基。 数据表示为平均值和标准偏差。 与对照组相比,采用t检验进行统计。
图13。 星形细胞培养中的蛋白质表达和明胶酶活性。
所有样本均在同一凝胶或放射自显影上进行分析; 图上的不连续性是由于去除了不同批次的GM-CT-01的重复样本,这些样本给出了相同的结果。 A类 :从LX-2细胞培养物中分离的蛋白质的Western blot分析。 MMP2=金属金属蛋白酶2; α-SMA=α-平滑肌肌动蛋白; GAPDH被用作内部控制。 CT-01=GM-CT-01; MD-01=GR-MD-01; MD-02=GR-MD-02。 B :从原代人类星状细胞培养物中分离的蛋白质的Western blot分析。 α-SMA=α平滑肌肌动蛋白; GAPDH被用作内部控制。 所有药物浓度均为1 mg/ml,在添加药物后24小时进行评估。 C :酶谱法测定MMP2活性。 使用10%酶谱(明胶)凝胶(含0.1%明胶底物的10%三甘氨酸凝胶)测定LX-2中MMP-2的酶活性。 细胞中存在的明胶酶会降解明胶基质,在对凝胶进行蛋白质染色后留下一条清晰的带(箭头)。 以0.1 mg/ml的浓度给细胞注射药物24小时。
这些细胞培养实验的结果表明,对星状细胞没有显著影响,这足以解释体内实验中的影响。 然而,TGF-β受体-1的变化可能会降低TGF-α激活星状细胞的能力。
讨论
我们的研究结果表明,GR-MD-02和GM-CT-01这两种药物对硫代乙酰胺治疗诱导的大鼠肝纤维化的组织学有显著的治疗作用。 除了减少胶原蛋白含量外,尽管持续接触硫代乙酰胺,这些药物还减少了桥接性纤维化和组织学肝硬化。 此外,门脉高压症显著降低。 与正常大鼠相比,经药物治疗的肝硬化大鼠的门静脉压力增加了一倍,而经药物治疗组的大鼠,尤其是GR-MD-02的大鼠门静脉压力显著降低。 因此,使用这些药物治疗不仅会导致胶原蛋白降解和晚期纤维化和肝硬化组织学表现的退化,而且还会减轻肝硬化的病理生理后果。
根据抑制半乳糖凝集素分子,特别是半乳糖凝蛋白-3,可能被证明是治疗肝纤维化的一种假设,选择复合碳水化合物药物。 缺乏半乳糖凝集素-3基因的小鼠可以存活、繁殖、一般健康且寿命正常 [16] ,但他们对急性腹膜炎有晚期炎症反应 [17] 在四氯化碳治疗后,半乳糖凝集素-3缺失小鼠显著减少了肝脏中胶原蛋白的积累 [8] 在这些研究中,半乳糖凝集素-3的缺乏似乎与肝脏中肝星状细胞的活化减少有关。 基于这些和其他肾脏研究 [11] , [18] ,肺 [10] 和心脏 [19] 半乳糖凝集素-3似乎与实质组织中纤维化的积累是不可或缺的。
虽然这些对纤维化和肝硬化的作用机制被认为是药物与半乳糖凝集素-3蛋白的相互作用,但与半乳糖凝集素分子的相互作用是复杂的,并且对半乳糖凝集素蛋白下游的分子事件知之甚少。 半乳糖凝集素-3有一个糖结合域(CRD),在半乳糖凝蛋白蛋白中共享 [5] ,但与其他半乳糖凝集素蛋白质相比,它有一个长的N末端结构域,参与形成多聚体 [20] 半乳糖凝集素-3与单个半乳糖分子结合不良 [21] 更热衷于含半乳糖的双糖 [22] 最喜欢大分子,如带有末端半乳糖残基的糖蛋白 [21] 尽管半乳糖凝集素是通过其与含有半乳糖的模型碳水化合物(如乳糖胺)结合的能力来定义的,但单个半乳糖凝集素似乎与糖蛋白上的不同组聚糖结合,从而提供半乳糖凝集素之间的特异性 [23] 例如,galectin-1和galectin-3与T细胞上不同的细胞表面受体结合 [24] galectin-3的凝集素特性有许多潜在的配体,包括层粘连蛋白、整合素、胶原蛋白、纤维连接蛋白、弹性蛋白、粘蛋白、CD4+、CD8+、TGFBR、神经细胞粘附分子等 [25] galectin-3与N-聚糖的结合与多种细胞过程有关,包括细胞粘附和迁移、免疫细胞功能、炎症和肿瘤 [5] , [26] —— [30] 很可能,半乳糖凝集素-3的抑制调节细胞外空间的多种蛋白质相互作用,从而改变细胞功能。 除了聚糖相互作用外,还存在与非糖基化蛋白质发生的蛋白质相互作用,主要发生在细胞核和细胞质中 [31] 因此,半乳糖凝集素的细胞外效应似乎与其结合糖蛋白的凝集素特性有关,而其细胞内效应则更多地与蛋白质相互作用有关。
GR-MD-02和GM-CT-01是复杂的碳水化合物分子,它们具有能够与半乳糖结合的N-末端半乳糖残基。 异核单量子相干(HSQC)核磁共振(NMR)光谱用于确认这些复合碳水化合物与半乳糖凝集素蛋白的不同结构域之间的关联 [32] —— [35] 半乳糖凝集素蛋白上与这些复杂碳水化合物结合的结构域被发现比双糖和低聚糖的结合更复杂 [21] 或与CRD具有较高亲和力的基于双糖的化合物 [36] 与GM-CT-01相互作用的半乳糖凝集素-1结合位点的定位显示,与穿过蛋白质二聚体结构域的分子的F面结合最强烈,在典型CRD(S面)的相互作用最小 [32] 类似地,虽然GR-MD化合物与CRD结合,但与与半乳糖凝集素-1的S面和F面相互作用的小糖类相比,它们也与蛋白质上的更大区域结合 [37] 此外,这两种复合碳水化合物与每个碳水化合物分子的多个半乳糖凝集素分子结合。 我们还表明,GM和GR碳水化合物通过不同的氨基酸残基组与半乳糖凝集素-3 CRD结合,并且GR-MD-02和GM-CT-01在50%饱和度下对半乳糖凝蛋白-3的亲和力分别为2.9µM和2.8µM(未公布的数据)。 这与之前发布的关于GR-MD-02和GM-CT-01的galectin-1结合亲和力的数据进行了比较,分别为8µM和10µM [32] , [33] , [37] 这些化合物的高分子量和凝集素结合特性表明,它们可能主要作用于细胞外半乳糖凝集素。
这些半乳糖凝集素-3结合药物对纤维化的潜在作用机制尚不清楚。 亨德森等人表明,半乳糖凝集素-3似乎是激活肝星状细胞为肌成纤维细胞所必需的 [8] 活化星状细胞的减少显然很重要,因为它们是肝纤维化中合成细胞外胶原蛋白的原代细胞 [1] , [2] , [15] , [38] , [39] 在我们的实验中,具有最大抗纤维化作用的治疗组的α-SMA蛋白减少,与治疗后星状细胞活化减少一致。 然而,这并不一定反映对星状细胞的直接影响,而是通过调节炎症的性质或程度而产生的间接影响。 事实上,这些药物对分离的星状细胞和LX-2星状细胞系的影响非常温和,因此不太可能完全解释体内的显著疗效。
未来的研究需要确定这些化合物在肝脏中的主要作用是通过半乳糖凝集素-3对星状细胞的抑制,还是通过细胞因子和/或炎症环境变化的间接作用。 先前的研究评估了半乳糖凝集素-1和半乳糖凝素-3对培养的星状细胞增殖和活化的影响 [40] , [41] galectin-3对星状细胞吞噬依赖性激活的影响 [42] 在我们的实验中,LX-2细胞对增殖、凋亡或大多数纤维生成相关基因和蛋白的表达没有影响。 经GR-MD-02和GM-CT-01治疗后,TGF-β受体-1基因表达降低。 TGF-β是一种重要的细胞因子,在纤维形成和星状细胞活化中起重要作用。 此外,有证据表明肺纤维化中TGF-β受体的活性依赖于半乳糖凝集素-3蛋白,半乳糖凝素-3的抑制抑制了受体活性 [10] 因此,抑制TGF-β依赖性星状细胞活化可能是药物抑制半乳糖凝集素-3可以提供此动物模型中的某些效果的机制之一。
巨噬细胞是半乳糖凝集素-3结合药物可能影响纤维化的另一个潜在靶点。 巨噬细胞对器官中胶原沉积的形成和分解至关重要 [43] 并且在肝纤维化中明显重要 [44] 此外,现在清楚的是,活化的巨噬细胞分化为许多不同的亚型,称为巨噬细胞极化,它们在炎症和纤维化形成到纤维化消退的连续过程中具有不同的功能。 典型激活的M1-巨噬细胞具有急性炎症表型,对细菌具有强烈的吞噬作用,并产生大量细胞因子。 交替激活的抗炎M2-巨噬细胞可分为三个亚群,它们在免疫调节、耐受性和组织修复或伤口愈合方面具有不同的功能。 最近,发现了一种新的M2巨噬细胞亚型,它对解决肝脏纤维化至关重要 [45] .
虽然在许多免疫和其他细胞类型中表达,但galectin-3最初在巨噬细胞中被描述为Mac-2,并且在巨噬细胞中的表达水平远高于其他细胞类型 [46] 此外,一些证据表明,半乳糖凝集素-3在纤维化疾病中对巨噬细胞功能很重要 [6] , [11] , [18] 包括调节巨噬细胞的交替激活 [18] 在所描述的实验中,通过持续毒素治疗,肝硬化和纤维化在短时间内消退,并且存在不完全隔膜,这表明胶原蛋白的降解相对较快。 在本研究中,位于门静脉束和纤维化区域的巨噬细胞是肝硬化肝免疫组织化学中表达galectin-3的主要细胞类型。 此外,药物治疗减少了表达galectin-3的巨噬细胞数量。 这些数据表明巨噬细胞可能是这些药物化合物的主要靶点。 未来的研究将评估这些化合物与半乳糖凝集素-3的相互作用是否会改变巨噬细胞极化,从而减少促炎性巨噬细胞,增加可降解胶原蛋白的修复性巨噬细胞。
总之,我们已经证明,在毒素诱导的大鼠肝纤维化模型中,半乳糖凝集素结合的复合碳水化合物药物可以引起纤维化的消退和肝硬化的组织学变化。 此外,肝硬化的消退与门脉高压的减少有关,这表明肝脏结构的改变对肝脏血流和/或阻力有生理影响。 这些研究结果表明,用结合半乳糖凝集素-3的复合碳水化合物药物进行治疗可能是一种治疗方法,可用于治疗人类晚期纤维化和肝硬化,尤其是因为它们似乎耐受性极佳。
资金筹措表
其中三位作者(PGT、EZ、AK),包括通讯作者(PGP)是Galectin Therapeutics的员工,该公司为该研究提供了资金。 因此,资助者的员工在研究设计、数据收集和分析、出版决定和手稿准备方面发挥着直接作用。
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