亲爱的编辑：， 癌细胞表现出随着乳酸的积累，有氧糖酵解水平大大增加，这种现象称为Warburg效应。 显然，癌细胞的存活需要一个精心设计的抗酸系统。 长期以来，L-谷氨酰胺（Gln）被认为是癌细胞生长所必需的，这通常被认为与Gln作为碳源和氮源的营养价值有关。 基于我们最近的发现，Gln为 大肠杆菌 通过氨的释放，我们假设Gln在癌细胞中的主要作用是通过酶脱酰胺来抗酸，而不是提供营养。 在这封信中，我们提供了支持这一假设的初步实验证据。 我们证明，谷氨酰胺有助于癌细胞在酸性应激下生存，而酸性应激是由特定谷氨酰胺酶活性的抑制所削弱的。 我们的数据表明，谷氨酰胺酶抑制剂目前正在作为一种抗癌药物进行临床试验，其作用可能是对抗癌细胞在酸性环境下的生存能力。 我们进一步推测，细胞培养中对谷氨酰胺的一般需求也是由于其在耐酸性中的关键作用。
癌细胞的一个特征被描述为Warburg效应，表现为有氧糖酵解增加和氧化磷酸化降低 1 。即使在有氧的情况下，癌细胞也会将葡萄糖主要转化为乳酸，乳酸的pK为3.7，有助于肿瘤中的酸性环境 2 .人类癌症组织的细胞外pH值可低至5.6 三 由于许多生物反应严格依赖于pH值，降低pH值可能会对癌细胞生长有害。 因此，癌细胞必须能够有效中和乳酸，以确保正常生长。 支持这一分析的是，据报道，即使细胞生长导致细胞外pH值急剧下降，肿瘤细胞内的pH值也基本保持不变 4 这一观察结果表明，癌细胞内存在强大的耐酸系统。 令我们惊讶的是，对癌细胞中的抗酸系统几乎没有描述或研究。
谷氨酰胺（Gln）是人体内含量最丰富的游离氨基酸 5 其浓度高于所有其他19种氨基酸的总和。 谷氨酸也是多种食物来源中最丰富的游离氨基酸，包括肉类和蔬菜 6 值得注意的是，癌细胞在很大程度上依赖Gln进行生长和增殖 5 ，而细胞培养中谷氨酰胺的缺乏会导致细胞活力的迅速丧失 7 令人惊讶的是，与正常细胞相比，大多数肿瘤细胞消耗Gln的速率要高得多 8 流行的观点是，谷氨酰胺通过谷氨酰胺水解转化为L-谷氨酸（Glu）和氨，从而为细胞生长提供碳和氮源 9 不幸的是，这一普遍看法与实验观察相矛盾，实验观察表明，尽管谷氨酸和铵具有高效的运输系统，但任何浓度的谷氨酸，即使补充了NH 4 + 和ATP，不能使L-成纤维细胞生长 7 因此，我们认为，为什么肿瘤细胞生长和更普遍的细胞培养需要谷氨酰胺的问题在很大程度上仍然是个谜。
在随附文件中 6 ，我们报道了一种新型的细菌耐酸系统，该系统依靠谷氨酰胺酶的酶活性从谷氨酰胺释放氨。 释放出的氨中和了 大肠杆菌 .这一发现，以及氨气的使用 极地螺旋杆菌 对抗胃酸 10 ，促使我们假设Gln在癌细胞生长中的重要作用。 在这个假设中，Gln被认为不仅通过提供碳和氮源促进癌细胞生长，更重要的是通过酶促释放氨对抗酸性应激。 我们提出的假设与现有文献和知识一致。 哺乳动物细胞中已鉴定出两种不同的谷氨酰胺酶（GLS）：GLS1（具有两种剪接形式KGA和GAC 11 , 12 )，主要表达于肾脏和GLS2（也称为LGA 13 )主要存在于肝脏。 已发现GAC的mRNA水平在各种肿瘤中升高 12 事实上，GAC被证明对非小细胞肺癌的生长至关重要 14 谷氨酰胺酶抑制剂作为一种潜在的抗癌疗法正在美国进行临床试验 15 然而，值得注意的是，这些先前的研究并未将谷氨酰胺酶的重要作用与肿瘤细胞生长中对谷氨酰胺的抗酸性需求联系起来。
为了帮助验证这一假设，我们分别使用来自宫颈癌和乳腺癌的HeLa和MCF-7细胞研究了Gln对细胞生长的影响。 在这封信中，我们报告说，随着细胞生长，细胞外环境变得越来越酸性，细胞持续生长需要谷氨酰胺。 在较低pH值的培养基中，癌细胞消耗更多的Gln，细胞外环境中积累更多的Glu。 谷氨酰胺酶抑制剂破坏了谷氨酰胺在酸性pH下的促生存作用。 这些数据共同支持了Gln在酸性胁迫下癌细胞生长中发挥重要作用的假设。 我们的初步实验证据简述如下。
首先，我们发现癌细胞系似乎依赖谷氨酰胺维持正常生长。 按照制造商的方案培养HeLa和MCF-7细胞，但提供不同浓度的Gln（0、5、10和25 mM）； 在0、8、16、24、48、72和96小时时测量细胞密度。细胞生长和Gln的存在之间有很强的相关性( 补充信息，图S1 ). 在存在5mM或更高浓度的Gln的情况下，HeLa或MCF-7细胞的生长曲线在质量上看起来是相同的。 相比之下，在缺乏Gln的情况下，HeLa或MCF7细胞密度要低得多( 补充信息，图S1 ). Gln水平降低也导致HeLa和MCF-7细胞生长速度降低( 补充信息，图S2 ).
接下来，我们测量了培养基在不同时间点的pH值。 与细胞生长导致培养基酸化的观点一致，两种细胞系的pH值都随着时间的推移而降低( 补充信息，图S3 ). HeLa或MCF-7细胞的培养基在存在5 mM或更高Gln的情况下，pH值出现类似的时间性下降，这反映了其生长曲线的相互关系。 相比之下，在缺乏Gln的情况下，HeLa或MCF-7培养基的pH值下降幅度较小，可能是由于缺乏细胞生长。 在没有细胞的情况下，培养基pH值随时间基本保持不变( 补充信息，图S3 ).
如果细胞生长引起的酸性pH值不利于细胞的持续生长，那么继续提供缓冲介质可能会缓解这个问题。 为了检验这种情况，我们在相对恒定的pH值下培养HeLa或MCF-7细胞，每8小时更换一次培养基。在pH值为7.3时，即使没有Gln，HeLa和MCF-7的细胞也表现出强劲的生长( 图1A ). 相比之下，在没有谷氨酰胺的情况下，pH值为6.3时细胞的生长要少得多( 图1A ). 与此分析一致，10 mM Gln的存在使得细胞在pH 6.3和pH 7.3条件下生长旺盛( 补充信息，图S4 ). 总之，我们的数据表明，对于HeLa或MCF-7癌细胞，Gln可能提供一种对抗酸性应激的有效方法。
图1。
L-谷氨酰胺（Gln）可能通过酶促释放氨来实现抗酸，从而在癌细胞生长中发挥重要作用。 （A） HeLa和MCF-7细胞在缺乏Gln的情况下生长，并持续提供缓冲培养基。 在pH 6.3和7.3的条件下培养HeLa和MCF-7细胞，不含Gln。 每8小时更换一次培养基，以保持相对恒定的pH值。 用CV染色法测定细胞密度。 （B） HeLa和MCF-7细胞在低pH的培养基中消耗更多的Gln，释放更多的谷氨酸（Glu）。使用了两个pH值，6.5和7.0。 通过质谱分析测定Gln和Glu浓度。 （C） 谷氨酰胺酶活性的抑制导致细胞在酸性环境下的存活和生长减少。 相对细胞生长表示细胞在不同培养基中生长8小时后细胞数量的归一化变化。0.05的相对细胞生长值意味着与0小时相比增加了5%的细胞生长。 结果显示为10个独立实验的平均值。 介质pH值由25 mM管道缓冲。 （D） GLS1剪接变异体GAC的活性高于KGA，尤其是在pH值6.0时。 这里显示的是 在体外 GAC和KGA在不同pH值下的活性表征。 谷氨酰胺酶活性通过基于谷氨酸脱氢酶的两步谷氨酰胺酶方案进行测量。 此处使用的蛋白质包含N末端截断（残基1-122），以便在 大肠杆菌 . （E） 图示说明我们关于Gln在癌细胞生存中的基本作用的假设。
如果Gln用于耐酸性，那么我们预计会看到Gln从培养基中消耗并释放到培养基中。 此外，在较低的pH值下可能会有更多的Gln消耗。为了研究这种情况，我们在0.5 mM L-[U的存在下培养HeLa或MCF-7细胞- 13 C类 5 ，-U- 15 N个 2 ]Gln和10mM未标记的Gln。 8小时后，使用质谱法对培养基中的剩余Gln进行定量。 对于HeLa和MCF-7细胞，pH值为7.0时的细胞生长量大于pH值为6.5时的细胞增长量( 补充信息，图S5 ); 然而，在pH 6.5条件下（按细胞密度标准化），谷氨酰胺的消耗量比pH 7.0条件下大得多( 图1B ，左侧面板）。 具体而言，与pH值7.0相比，pH值6.5的HeLa和MCF-7细胞的Gln消耗量分别增加了61%和37%。 与Gln向Glu的细胞内转化一致，HeLa和MCF-7细胞培养基中Glu的浓度分别增加了39%和33%( 图1B ，右侧面板）。
如果需要将谷氨酰胺转化为谷氨酸才能获得耐酸性，那么抑制谷氨酰胺酶活性将优先抑制低pH值下的细胞生长。为了检验这种情况，我们在pH 6.0和6.5的有或没有谷氨酰胺酶抑制剂的培养基中培养HeLa和MCF-7细胞。 在两个pH值下，尽管存在10 mM Gln，但与不存在谷氨酰胺酶GLS1特异性抑制剂968相比，存在谷氨酰胺酶类GLS1的细胞数量要少得多( 图1C ). 作为这些实验的对照，在没有谷氨酰胺的情况下，细胞生长比在有谷氨酰胺的条件下要差得多。 这些结果还表明，GLS1可能是酸性胁迫下HeLa和MCF-7细胞中谷氨酸分解的关键酶。
许多哺乳动物的酶只有在狭窄的pH值范围内才有活性。 为了检测谷氨酰胺酶活性的pH依赖性，我们表达并纯化了两种GLS1亚型（KGA和GAC），使其均匀，并测量了它们的酶活性 在体外 结果清楚地表明，即使在pH 6.0时，GAC和KGA都保持了显著的谷氨酰胺酶活性( 图1D ). 在pH 6.0、7.0和8.0时，GAC的谷氨酰胺酶活性高于KGA。 特别是，与pH值为6.0的KGA相比，GAC表现出约108%的活性。 这一结果表明，GLS1剪接变异体GAC可能对酸性pH下的癌细胞生长更为重要。
这些实验观察为支持我们的假设提供了初步证据，即谷氨酰胺可能通过酶促释放氨来提高抗酸性，从而在癌细胞的生存和生长中发挥重要作用( 图1E ). 换言之，癌细胞对谷氨酰胺的依赖不仅是为了营养，更重要的是为了对抗华伯格效应导致的酸性应激。 由于谷氨酰胺代谢利用的第一步涉及谷氨酰胺酶活性，因此很难区分谷氨酰胺碳/氮源与耐酸性的两个潜在功能。 谷氨酰胺酶的任何分子生物学操作都会同时影响谷氨酰胺的代谢利用及其在耐酸性中的作用。 尽管如此，我们发现Gln在低pH的培养基中优先转化为Glu，这有力地支持了耐酸性假说。 据我们所知，这可能是首次提出Gln通过耐酸性在癌细胞生长中发挥重要作用。 这种概念上的进步对于理解癌细胞的体内平衡和设计潜在的治疗方法具有重要的影响。 详细方法见 补充信息，数据S1 .
