蛋白激酶Cα磷酸化物——钙依赖性刺激血管内皮细胞内皮一氧化氮合酶过程中丝氨酸328处的新型精氨酸琥珀酸合酶位点^*,♦

细胞培养

如参考文献。10经过修改。简单地说，采集主动脉并用不含镁或钙的PBS清洗以清除血液，通过纵向解剖暴露管腔表面，然后用0.1%胶原酶孵育10分钟。内皮细胞分离是通过在表面滚动无菌拭子实现的，然后通过在5 ml富含Dulbecco改良Eagle's培养基（DMEM，1 g/L葡萄糖，Invitrogen）中旋转拭子释放细胞，该培养基含有10%FBS（HyClone）、100 IU/ml青霉素和链霉素以及250 ng/ml两性霉素B（Cellgro）在15-ml锥形管中。将细胞制成颗粒，重新悬浮在6 ml DMEM+10%FBS中，然后在25 cm内进行电镀²处理过的细胞培养瓶。流式细胞术证实了培养中内皮细胞的分离。

在治疗之前，将汇合的BAEC（在第3代和第9代之间）在补充有0.1%BSA和1mL BSA的DMEM（1g/l葡萄糖，减去酚红，Invitrogen）中血清饥饿16小时米谷氨酰胺。治疗包括100 n孵育米胰岛素（西格玛），100 ng/ml VEGF（研发系统），0.5μ米钙离子载体A23187（Sigma），10μ米缓激肽（西格玛），42μ米罗特林，或2.5μ米用于PKC抑制或50μ米BAPTA-AM（钙生物化学）。孵化时间如图例所示。对照组仅用血清饥饿培养基治疗。

AS变异体的产生和瞬时转染

将AS cDNA克隆到pcDNA 3.1/V5-His，B表达载体（Invitrogen）中。然后，按照制造商的说明，通过QuikChange试剂盒（Stratagene）对AS构建物进行定点突变。简言之，Ser-328突变为丙氨酸以模拟非磷酸化状态，突变为天冬氨酸以模拟组成磷酸化状态。用于S328A突变的引物是有意义的：ACGGGTTTCTGGCACGCGCCCGAGTGAATTT和反义的：AAATTCACTCGGCGCTGCCAGAACCCGT。用于S328D突变的引物是有意义的：ACGGGTTTCTGGCACGACCGAGTGAATTT和反义的：AAATTCACTCGGGTCGTGCCAGAACCCGT。使用Lipofectamine 2000（Invitrogen）在无血清Opti-MEM I（Invit罗gen）中瞬时将实验质粒（6孔培养皿中每孔1μg DNA）转染到BAEC中。4 h后，用含10%血清的DMEM替换培养基，培养细胞6或24 h。用钙离子载体A23187和原钒酸钠刺激细胞4 h，然后通过2,3-二氨基萘（DAN）测定培养基中NO的生成。

质谱分析

用AS瞬时转染的BAEC孵育24小时，血清饥饿16小时，并用10μ米缓激肽或50 n米冈田酸作用30分钟。过表达的AS通过其融合的His纯化₆使用镍-硝基三乙酸-海藻糖磁珠标记（Qiagen）。用SDS-PAGE分离蛋白质以鉴定AS带（51 kDa）。使用重复凝胶通过Western blot确认AS质粒的表达。将感兴趣的凝胶带切除并去除污渍。蛋白质二硫化物用三羧乙基膦还原，半胱氨酸用碘乙酰胺烷基化。采用凝胶胰蛋白酶消化法进行蛋白质水解。采用纳米流反相液相色谱法通过疏水性分离肽（LC Packings，Dionex，Sunnyvale，CA）。使用电喷雾线性离子阱质谱仪（LTQ，Thermo Scientific）完成在线检测。使用Mascot和SEQUEST数据库搜索算法将串联质谱分配给肽序列。通过手动检查数据来验证序列分配。

精氨酸琥珀酸合成酶磷酸丝氨酸Ser-328特异性抗体

21世纪生物化学公司使用磷酸肽AS序列322–335:RR-Ahx-YGFWH[pS]PECEFVR-amide（其中pS表示磷酸）生成了针对Ser（P）-328 AS的磷酸特异性抗体。通过进行磷酸肽竞争和免疫沉淀，然后进行Western印迹，确定磷酸-AS抗体的特异性。

Western Blot分析

在添加蛋白酶和磷酸酶抑制剂（Pierce）的放射免疫沉淀分析缓冲液中裂解BAEC，然后刮取收集。对全细胞裂解物进行澄清，并使用BCA蛋白测定法（Pierce）对总蛋白进行定量。等量（20μg）的蛋白质在4–15%Tris-HCl TGX预制凝胶（Bio-Rad）上溶解，并印在Immobilon-P聚偏氟乙烯膜上。如前所述进行蛋白质印迹(11). 在100%StartingBlock（Pierce）中封闭膜，并在20%StartingBlock1:2500抗AS（BD Transduction Laboratories）中与一级抗体孵育。使用的二级抗体是1:50000稀释度的过氧化物偶联山羊抗鼠或抗兔IgG（Jackson ImmunoResearch Laboratories）。使用West Pico试剂（Pierce）通过化学发光对斑点进行可视化，并将其暴露于薄膜中。使用Quantity-One软件（Bio-Read）对谱带强度进行量化。

一氧化氮测定

如前所述，使用荧光DAN（Sigma）分析法测量培养基中的亚硝酸盐，作为细胞NO的指示剂(12). 在96 well黑板中进行反应，在BMG FLUOstar Galaxy荧光光谱仪板读卡器上读取荧光，在360 nm激发，在405 nm检测发射。数据描述为每微克蛋白质中亚硝酸盐的pmol。

PKCα敲除试验

将90%融合的BAEC与靶向PKCα第五外显子（集成DNA技术）的dicer底物siRNA（DsiRNA）转染48小时，使用Lipofectamine 2000（Invitrogen），如前所述进行as构建。用于沉默基因表达的双链序列如下：5′-CGAGGAGCAAGCACAAGUUCAAGAT-3′和5′-AUCUGAACUGUGUGCUCGGG-3′。然后用钙离子载体（A23187，Sigma）处理转染的BAEC，并在蛋白印迹后进行裂解。如上所述，对所示蛋白质的相对量进行定量。

体外激酶检测

按照科尔宾的描述进行分析等。(8). 简单地说，纯化的重组AS是通过牛AS亚克隆产生的(NP_776317型)转化为pET-28（c）+载体（Novagen），并用大肠杆菌按照制造商的说明（Novagen），随后通过His·Bind树脂纯化蛋白质。SDS-PAGE证实纯化成功。用于测定每个激酶激酶活性的阳性对照含有适用的肽底物，而阴性对照含有除肽以外的所有成分。添加[³³P] 每种反应混合物的ATP启动了在30°C下培养30分钟的分析。通过在磷纤维素P81板上进行反应斑点，然后进行三次清洗，可以终止分析，然后通过闪烁计数读取放射性。图像在体外通过添加样品缓冲液终止激酶反应，然后在10%聚丙烯酰胺凝胶上分馏。

精氨酸琥珀酸合成酶Ser-328磷酸化位点的鉴定

为了在AS序列中建立具有生物学意义的磷酸化位点，我们通过应用质谱（LC-MS/MS）对经缓激肽或冈田酸（蛋白磷酸酶2A（PP2A）和PP1磷酸酶抑制剂）处理的培养BAEC纯化的过表达AS进行了蛋白质组学分析。质谱分析揭示了三个高度保守的丝氨酸/苏氨酸磷酸化位点，它们与背景离子信号不同。其中包括Thr-131/Ser-134、Ser-180/Ser-189和Ser-328(图1). Thr-131与Ser-134的接近性以及Ser-180与Ser-189的接近性使得这些单独的信号无法区分，因此被描述为Thr-131/Ser-134和Ser-180/Ser-189。

在确定的位点中，Ser-328在用磷酸酶抑制剂（冈田酸）处理的细胞和未处理的细胞之间显示出最大的信号变化。此外，与未经处理的对照细胞相比，经缓激肽处理的Ser-328的信号发生了实质性变化(图1). 此外，生物信息学建模表明，激酶相互作用最容易到达的位点是Thr-131/Ser-134和Ser-328，而Ser-180/Ser-189似乎埋藏在酶的活性位点附近（数据未显示）。根据这些结果，Ser-328被选为磷酸化最强的候选基因体内因此，开发了一种针对Ser（P）-328的磷酸特异性抗体用于进一步研究（见“实验程序”）。

钙依赖性刺激BAEC降低Ser-328的磷酸化

为了确定Ser-328的磷酸化是否具有生理意义，通过改变NO生成的生理线索来检查Ser-328磷酸化相对于治疗的变化。特别是，选择VEGF和胰岛素刺激NO生成有两个原因。首先，有证据表明，血管内皮生长因子（VEGF）治疗后AS磷酸化发生改变，而VEGF治疗是通过PKA信号介导的(8). 第二，已知VEGF和胰岛素通过促进eNOS的Ser-1179磷酸化来刺激内皮细胞NO的生成(13,14).

如所示图2，与文献一致(13)，我们发现胰岛素和VEGF促进Ser-1179处约50%的eNOS的磷酸化增加（Western印迹，图2,A类和C; 密度测定，图2,B类和D类)NO生成相应增加(图2E类). Thr-497处eNOS的磷酸化也随之降低约40%（Western blot，图2,A类和C; 密度测定，图2,B类和D类) (15–17). 令人惊讶的是，通过VEGF（85%）或胰岛素（40%）治疗，Ser-328的磷酸化显著降低（Western blot，图2,A类和C; 密度测定，图2,B类和D类).

钙依赖性刺激BAEC增加Ser-328的磷酸化

胰岛素和VEGF通过PI3K/Akt途径介导Ser-1179处的eNOS磷酸化，该途径在很大程度上与钙无关(18–20). 由于胰岛素或VEGF介导的钙非依赖性信号传导促进了AS Ser-328的明显去磷酸化，因此我们质疑Ser-328处的磷酸化是否与钙依赖性信号传递有关。为了初步探讨这个问题，进行了定点突变分析。使用了三种结构体，一种包含野生型（WT）AS，一种含有Ser-328的Ala替代物（磷酸-全），另一种包含Ser-328（磷酸-甲基）的Asp替代物。如所示图3A类当用钙离子载体刺激时，磷酸型S328D AS的过度表达增强了NO的生成，类似于WT AS。相反，在相同的治疗中，过表达磷酸化全S328A AS未能提高NO的生成。Western blotting显示结构的一致表达(图3B类). 只有S328D过度表达将NO生成增加到WT水平的观察结果表明，Ser-328的磷酸化支持精氨酸在钙依赖性刺激条件下传递到eNOS。

由于这些发现与钙依赖性一致，因此进行了实验，以确定Ser-328中的钙依赖性变化是否可用于内源性AS。在这些实验中，BAEC用钙离子载体A23187或内质网ATP酶抑制剂thapsigargin处理。众所周知，这两种药物都能促进细胞内钙的增加(21)刺激NO生成。如所示图4,A类和B类，两种药物均可促进eNOS在Ser-1179的磷酸化近50%，随后在Thr-497的eNOS磷酸化降低40%，与报告值一致(21,22). 然而，在这种情况下，用钙离子载体或thapsigargin治疗显示AS Ser-328的磷酸化增加（～60%）(图4,A类和B类).

为了进一步证实AS Ser-328磷酸化的钙依赖性，用细胞内钙螯合剂BAPTA-AM处理BAEC。正如预期的那样，钙离子载体和thapsigargin挽救了eNOS Ser（P）-1179处的磷酸化，而单独使用BAPTA-OM处理后磷酸化减弱。重要的是，如所示图4A类，用50μ处理米BAPTA-AM完全消除了Ser-328的磷酸化以及eNOS Ser-1179的磷酸化。因此，AS Ser-328的磷酸化似乎通过钙依赖信号与eNOS Ser-1179的磷酸化协调调节。

为了证明生理相关性，在用BAPTA-AM处理细胞30分钟，然后用钙离子载体A23187刺激20分钟后进行NO测量。A23187和thapsigargin与未处理或BAPTA-AM-处理的BAEC相比显著增加NO生成(图4C). 此外，BAPTA-AM处理显著降低了A23187或thapsigargin刺激的NO生成，分别为2.5倍和2倍。

PKC参与调节BAEC中Ser-328磷酸化

为了进一步阐明参与Ser-328处AS钙依赖性磷酸化的信号通路，使用激酶抑制剂进行了一系列实验。因为经典的PKC同型是钙依赖性激酶，不参与胰岛素或VEGF信号传导(23,24)，我们假设PKC家族的一个成员可能参与AS Ser-328的钙依赖性磷酸化。为了验证这一假设，进行了非等型特异性PKC抑制研究。作为第一种方法，通过检测As Ser-328磷酸化直接测量PKC抑制的效果。如所示图5A类和B类与未经处理的对照组相比，用PKC抑制剂罗特列林或PKC抑制剂双吲哚甲基苯胺I治疗BAEC，然后用钙离子载体刺激，使AS Ser-328磷酸化降低了～60%。这些结果被认为是一致的，并且支持经典PKC同型在Ser-328促进AS磷酸化的作用。

有趣的是，无论钙刺激如何，经鹿特伦治疗后，eNOS的Thr-497或Ser-1179的磷酸化也降低了～60%。相反，当BAECS仅用双吲哚甲酰胺I治疗时，eNOS在Ser-1179和Thr-497的磷酸化仅下降20%。然而，在钙刺激下，eNOS Ser-1179的磷酸化增加到类似于单独钙离子载体治疗的水平。然而，在双吲哚甲酰胺I存在下，Ser-328的磷酸化不受钙的影响(图5A类).

为了证明系统对抑制剂反应的生理相关性，我们测量了每种治疗的NO生成(图5C). 用双吲哚甲酰胺I抑制PKC对BAEC产生NO的影响不大；然而，鹿特伦显著降低了钙离子载体刺激的NO生成2倍以上。这些结果表明，罗氏菌素可能影响几种激酶的活性，而双吲哚甲基苯胺I明显降低eNOS Thr-497的磷酸化，从而促进NO的生成，类似于单独钙离子载体。

为了进一步研究可能磷酸化Ser-328的其他钙依赖性激酶的潜在参与，进行了额外的激酶抑制研究。ERK1/2被PD98059抑制，Ca²⁺/用KN93抑制钙调素依赖性蛋白激酶II（CaMKII）。在这两种情况下，当BAEC与钙离子载体或thapsigargin联合处理时，未观察到对AS Ser-328磷酸化的抑制作用（数据未显示）。这些结果表明PKC，而不是ERK1/2或Ca²⁺/钙调素依赖性蛋白激酶II负责钙刺激的AS Ser-328磷酸化。

因为PKCα是一种钙依赖性激酶，在钙依赖性刺激eNOS期间被证明是活性的(25)，我们试图确定这是否是负责AS Ser-328磷酸化的同型。为了测试这一点，我们检测了用DsiRNA直接敲低PKCα的效果。DsiRNA不同于用于基因沉默的传统siRNA，因为用于沉默的RNA双链不仅模仿骰子产物，但也通过RNA诱导沉默复合物（RISC）对骰子处理进行了优化，以产生更有效的击倒(26). 如所示图6，PKCα被显著击倒。针对PKCα的DsiRNA在1和5 n时允许50%和75%的敲除米DsiRNA。敲除PKCα后，用钙离子载体进行处理，发现1或5 n时Ser-328的磷酸化降低了50%和60%米并防止钙离子载体处理引起的磷酸化增加。在这些条件下，eNOS在Ser-1179的磷酸化在很大程度上不受PKCα敲除的影响，而eNOS Thr-497在PKCα被敲除80%时下降～60%。这些结果表明PKCα是一种磷酸化AS的Ser-328的激酶。

PKCα直接磷酸化物AS

由于观察到由于激酶敲除导致的磷酸化降低可能是信号级联中上游激酶抑制的结果在体外激酶分析用于确定PKCα是否直接磷酸化AS。基于缺乏一致的Akt磷酸化基序（RX（X）R（右）XX年（S/T））(27)在AS蛋白序列中。

如所示图7A类，PKCα清楚地证明了AS磷酸化的能力在体外。虽然Akt1空白反应的计数有所增加，但这低于被视为显著的阈值。SDS-PAGE分馏³²P-标记的激酶反应产物和放射自显影胶片曝光的可视化证实PKCα磷酸化AS，而不是Akt1(图7B类).