这项研究严格定义了层粘连蛋白B1的缺失是衰老的一个标志,它是对所有经典衰老信号的反应,包括DNA损伤、癌基因激活和复制衰竭。 这种下降是由p53或pRb途径激活引起的,并在体内对衰老诱导剂量的辐射作出反应。
摘要
细胞衰老是一种有效的肿瘤抑制机制,可阻止细胞增殖,并与衰老有关。 然而,由于缺乏简单、专属的衰老状态生物标记物,衰老研究受到阻碍。 衰老的细胞会发生特征性的形态学变化,包括细胞核增大且通常不规则和染色质重组。 由于核纤层的改变会影响核形态和基因表达,我们检测了衰老细胞的核纤层。 我们在这里显示,当DNA损伤、复制衰竭或癌基因表达诱导人类和小鼠原代细胞株衰老时,层粘连蛋白B1会丢失。 层粘连蛋白B1的丢失并不依赖于p38有丝分裂原活化蛋白激酶、核因子-κB、共济失调毛细血管扩张突变激酶或活性氧类信号通路,这些都是衰老表型的正向调节因子。 然而,p53或pRB抑癌途径的激活足以诱导层粘连蛋白B1的丢失。 层粘连蛋白B1在mRNA水平上的下降是由于mRNA稳定性的下降,而不是凋亡过程中caspase介导的降解。 最后,辐射诱导小鼠组织衰老后,层粘连蛋白B1和mRNA表达下降。 我们的研究结果表明,层粘连蛋白B1的缺失可以作为培养物和体内衰老的生物标志物。
引言
细胞衰老是一种有效的肿瘤抑制机制,它基本上不可逆转地阻止有恶性转化风险的细胞增殖。 许多潜在致癌刺激可诱导衰老反应。 这些刺激包括严重的DNA损伤、超生理有丝分裂信号和染色质严重受损。 它们通过参与两条重要的肿瘤抑制途径中的一条或两条来诱导衰老反应。 这些途径由p53和pRB抑癌蛋白控制,对延缓衰老生长至关重要( Campisi和d'Adda di Fagagna,2007年 ).
除了阻止生长外,衰老细胞还具有复杂的表型。 该表型的显著特征包括衰老相关β-半乳糖苷酶(SA-βgal)活性的发展( 迪姆里 等 ., 1995 )通常用于检测培养和体内的衰老细胞。 衰老细胞也表现出基因表达的广泛变化,部分导致衰老相关分泌表型(SASP),即大量细胞因子、生长因子和蛋白酶的强劲分泌( 复制 等 ., 2008 ). SASP,促炎( 弗伦德 等 ., 2010 )这可能解释了衰老细胞与衰老有关的第二个过程:衰老。
许多哺乳动物组织中的衰老细胞随着年龄的增长而积累。 他们也被证明在与年龄相关的病理学部位积聚,包括退行性和癌前病变( 帕里内洛 等 ., 2005 ; Campisi和d'Adda di Fagagna,2007年 ; Jeyapalan和Sedivy,2008年 ; 科拉多和塞拉诺,2010年 ). 这些研究得到了诸如SA-βgal活性、抑癌蛋白p16的表达和特征性DNA损伤灶等生物标记物的辅助( 迪姆里 等 ., 1995 ; 里希纳穆尔蒂 等 ., 2004 ; 杰亚帕兰 等 ., 2007 ). 然而,因为没有衰老- 具体的 目前已知的生物标志物,需要鉴定额外的坚固的标志物,这些标志物可用于在培养和体内鉴定衰老细胞。
衰老细胞发生显著的形态学变化。 其中包括平均细胞和细胞核大小的增加,不规则的核膜,染色体凝聚和分布的变化,一些染色体形成异色焦点,较大的染色体向核外围迁移( 成田 等 ., 2003 ; 梅塔 等 ., 2007 ; 张 等 ., 2007 ). 这种核重排与基因表达变化相关,最近的工作强调了核膜在调节基因表达,特别是基因抑制中的重要作用( 雷迪 等 ., 2008 ).
核膜的内表面衬有一层,这有助于细胞核的大小、形状和稳定性( 布里奇 等 ., 2007 ; 德查特 等 ., 2008 ). 椎板的主要结构蛋白是核层粘连,这是一种V型中间丝,大小从60到80 kDa不等( Krohne和Benavente,1986年 ). 根据等电点,层粘连被分为A型(层粘连A,C)或B型(层黏连B1,B2)( Krohne和Benavente,1986年) 叶片是一个动态结构,因为每次细胞进入有丝分裂时,它都会被分解,然后在下一个细胞周期中重新组装( Gerace和Blobel,1980年 ; 高盛 等 ., 2002 ).
层压板A和层压板C是 LMNA公司 基因( 林和沃曼,1993年 ),主要表现为细胞分化。 Lamin A缺失不会干扰HeLa细胞的生长( 港口 等 ., 2001 )表达层粘连蛋白C但不表达层粘着蛋白A的小鼠表现正常( 方 等 ., 2006 ). 然而,导致错误加工或错误折叠的层粘连蛋白A突变与一系列统称为“层粘连病”的疾病相关。层粘连疾病的病理学包括肌营养不良、心肌病、脂肪营养不良和早发性早衰(Hutchinson–Gilford早衰综合征[HGPS]; 沃曼 等 ., 2010 ). HGPS是由错误处理的层粘连蛋白a引起的( 德桑德雷·吉奥瓦诺利 等 ., 2003 ; 埃里克松 等 ., 2003 ). HGPS患者的成纤维细胞在培养中比正常成纤维细胞衰老更快( 本森 等 ., 2010 ). 有趣的是,野生型细胞中前体蛋白的低水平表达与正常衰老有关( Scaffidi和Misteli,2006年 ).
另一方面,B型层粘连蛋白来自两个不同的基因- LMNB1型 和 LMNB2型 一种或另一种B型层粘连蛋白可能足以使单个细胞存活( 布勒斯 等 ., 1997 ; 高盛 等 ., 2002 )尽管最近的报告表明,胚胎干细胞至少可以自我更新,并在没有层粘连的情况下保持其多能性( 基姆 等 ., 2011 ). 然而,层粘连蛋白B1是正常器官发生所必需的( 基姆 等 ., 2011 )和生物体存活:缺乏功能的小鼠 LMNB1型 基因在出生后几分钟死亡,这些小鼠的成纤维细胞细胞核畸形,在培养中过早衰老( 弗格内斯 等 ., 2004 ). 有趣的是,尽管B和A层粘连形成单独的网络,但它们相互作用并影响彼此的表达和组织; 在这种情况下,层粘连蛋白B1尤其重要( 石米 等 ., 2008 ).
在这里,我们证明了当人和小鼠细胞衰老时,层粘连蛋白B1会丢失。 在多种刺激诱导衰老的人成纤维细胞和一些成纤维细胞株中,层粘连蛋白B1的表达下降,但在静止细胞中没有下降。 这种减少与DNA损伤反应(DDR)、p38丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)和核因子-κB(NF-κB)激活以及活性氧物种(ROS)无关,这些都是许多衰老细胞的特征,但确实是对p53或pRB途径直接刺激的反应。 此外,尽管在凋亡过程中,层粘连蛋白被半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶裂解,但层粘连蛋白酶B1的裂解产物在衰老细胞中并不明显,也不影响层粘连酶B1在衰老时的丢失。 相反,层粘连蛋白B1 mRNA水平在衰老时通过层粘连肽B1 mRNA稳定性的降低而下降。 最后,我们检测到,在电离辐射诱导衰老剂量后,小鼠肝脏中的层粘连蛋白B1蛋白和mRNA略有但显著下降,这与辐射后体内衰老细胞的持续存在一致( 勒 等 ., 2010 ). 因此,层粘连蛋白B1的缺失是培养物和体内衰老的一个有力标志,并且是衰老状态的一个容易检测的生物标志物。
结果
层粘连蛋白B1的缺失与多种类型的细胞衰老有关
为了确定层粘连蛋白B1在衰老细胞中的表达是否发生变化,我们检测了增殖前(PRE)的正常人成纤维细胞(HCA2株)和通过暴露于10-Gy电离辐射(x射线[XRA];补充图S1,A–C)而衰老的同一细胞(SEN)。 我们通过Western blotting分析了全细胞裂解物。 两种独立的层粘连B1抗体表明,与PRE细胞相比,SEN(XRA)中的层粘着B1蛋白水平显著下降(>4倍),但层粘连A、C或B2蛋白水平没有下降( 图1,A和B ). 两种层粘连蛋白B1抗体都识别层粘连肽B1中的C末端表位。 因此,我们使用第三种抗体验证了我们的发现,该抗体识别内部层粘连B1表位( 图1C ). 第三种抗体证实衰老细胞和不同正常人成纤维细胞株(BJ)中的层粘连B1蛋白水平下降( 图1C ). 因此,衰老相关的层粘连蛋白B1丢失不是细胞应变特异性的或抗体伪影。 我们在随后的实验中使用了第一种抗体(层粘连蛋白B1#1),因为它发出最强的信号。
图1:
层粘连蛋白B1的缺失与多种类型的细胞衰老有关。 (A) 拉明B1降低DNA损伤诱导的衰老。 HCA2细胞接受模拟照射(PRE)或照射(10-Gy x射线)并允许衰老(SEN(XRA))。 使用识别C末端表位的两种无关的层粘连B1抗体中的任何一种,通过Western印迹分析全细胞裂解产物。 (B) 拉明B2不会降低DNA损伤诱导的衰老。 对HCA2细胞进行模拟照射(PRE)或照射并使其衰老(SEN(XRA))。 通过蛋白质印迹分析全细胞裂解物。 (C) SEN(XRA)细胞中的层粘连蛋白B1下降。 BJ细胞被模拟照射(PRE)或照射并允许衰老(SEN(XRA))。 使用识别内部表位的第三种层粘连B1抗体,通过Western blotting分析全细胞裂解产物。 (D) 拉明B1在复制衰老中下降。 HCA2细胞培养至复制性衰老(SEN(REP);~ 70人口翻倍)。 通过蛋白质印迹分析全细胞裂解物。 (E) 拉明B1在RAS诱导的衰老中下降。 HCA2细胞被缺乏插入物(PRE)或表达致癌RAS的慢病毒感染 V12版本 并允许衰老(SEN(RAS))。 通过Western blotting分析全细胞裂解产物。 (F) 在MKK6诱导的衰老中,层蛋白B1下降。 HCA2细胞被缺乏插入物(PRE)或表达组成活性MAP激酶激酶6突变体(MKK6EE)的慢病毒感染,并允许衰老(SEN(MKK 6)。 通过Western blotting分析全细胞裂解产物。 (G) XRA后WI-38细胞中的层粘连蛋白B1下降。 照射WI-38细胞(SEN(XRA))并使其衰老。 模拟照射PRE细胞。 通过Western blotting分析全细胞裂解产物。 (H) 层蛋白B1在静止细胞中不下降。 HCA2细胞在含有10%血清(PRE)的培养基、无血清培养基中培养48 h以诱导静止(QUI),或照射并允许衰老(SEN(XRA))。 通过Western blotting分析全细胞裂解产物。 (一) 辐照诱导衰老后48h内,层蛋白B1下降。 HCA2细胞接受模拟照射(PRE)或照射(XRA)。 通过Western blotting分析在指定时间点收集的细胞核(N)和细胞质(C)提取物。 RPA用作核馏分的装载控制; 微管蛋白作为细胞质部分的负荷控制。
10-Gy x射线剂量会导致严重的DNA损伤,这可能会降低层粘连蛋白B1的表达,而这与衰老程序本身无关。因此,我们检测了培养以复制衰老(REP)的细胞。 层粘连蛋白B1在这些细胞中急剧下降,但层粘连A或C没有下降( 图1D ). 衰老也可能由某些致癌基因驱动,包括致癌形式的H-RAS(RAS) V12版本 ; 塞拉诺 等。, 1997 ). 我们使用慢病毒载体稳定表达RAS V12版本 并使细胞衰老(补充图S1,A-C)。 这些细胞中的层粘连蛋白B1蛋白水平也下降了,尽管在这种情况下层粘连A的表现类似( 图1E ). 在MKK6EE表达诱导衰老的细胞中,层粘连蛋白B1和层粘连素A也下降( 图1F )MAP激酶激酶6(MKK6; Raingeaud公司 等。, 1996 ; 石川,2003年 ). MKK6EE引起持续的p38 MAPK活性,从而诱导衰老(补充图S1,A–C; 弗伦德 等。, 2011 ). 最后,在XRA诱导衰老的第三个细胞株WI-38中,层粘连蛋白B1下降( 图1G ).
为了确定层粘连蛋白B1的丢失是否是生长停滞本身而非衰老的结果,我们通过在缺血清培养基中培养48小时,使细胞静止(QUI)。正如预期的那样,QUI细胞加入了极少的溴脱氧尿苷(BrdU;未发表的数据)。 与SEN细胞相比,QUI细胞表达层粘连B1的水平与增殖的PRE细胞相同( 图1H ).
例如,通过XRA同步诱导细胞衰老时,SASP和SA-βgal需要7–10天才能发育成熟( Campisi和d'Adda di Fagagna,2007年 ; Rodier和Campisi,2011年 ). 为了确定层粘连蛋白B1的丢失是否遵循类似的动力学,我们在XRA后以不同的时间间隔分析了核提取物( 图1I ). 而层粘连蛋白B1的下降慢于DDR的激活,DDR激活发生在第一个小时内( 弗伦德 等。, 2011 )XRA后2d基本完成,早于其他衰老标志物。
这些数据表明,无论衰老诱导剂如何,层粘连蛋白B1的下降都是一般衰老程序的一部分。 其发生早于SASP、SA-βgal的表达和形态学改变(未发表的数据),并不是生长停滞本身的结果。因此,层粘连蛋白B1的下降可能作为早期衰老相关标志物有用。
拉明B1的丢失与p38 MAPK、NF-κB、共济失调毛细血管扩张症突变激酶和ROS信号无关
已经确定了几种在衰老表型方面起致病作用的途径。 p38 MAPK通路对衰老生长停滞和SASP都很重要( 王 等。, 2002 ; 岩崎 等。, 2003 ; 广 等。, 2009 ; 弗伦德 等。, 2011 ). 为了确定p38 MAPK是否介导层粘连蛋白B1的下降,我们用特性良好的小分子SB203580(SB; 库恩达 等。, 1995 ; 威尔逊 等。, 1997 ; 年轻 等。, 1997 ),可有效抑制衰老相关白细胞介素-6(IL-6)分泌(补充图S2A; 弗伦德 等。, 2011 ). 当加入SEN(XRA)细胞时,10μM SB未能逆转层粘连B1的下降( 图2A ). 此外,在XRA之前开始连续使用SB治疗,未能阻止或延缓层粘连B1的下降( 图2B ).
图2:
衰老时拉明B1的丢失独立于p38 MAPK、NF-κB、ATM和ROS信号。 (A) p38 MAPK抑制不能逆转DNA损伤诱导的衰老中层粘连蛋白B1的下降。 将p38 MAPK抑制剂SB203580(SB;10μM)添加到SEN(XRA)HCA2细胞中48 h。通过Western blotting分析全细胞裂解产物。 模拟照射PRE细胞。 (B) p38 MAPK抑制不能阻止DNA损伤诱导的衰老中层粘连蛋白B1的下降。 SB在XRA前加入HCA2细胞。 细胞被模拟辐照(PRE)或辐照(XRA)。 通过Western blotting分析在指定时间点收集的全细胞裂解物。 每天更换SB。 (C) p38 MAPK抑制不能逆转或阻止RAS诱导的层粘连B1下降。 HCA2细胞被表达致癌RAS的慢病毒感染 V12版本 并且允许衰老(SEN(RAS))。 未添加SB(–),在感染后8天添加48小时(+SB 48小时),或在感染前添加并维持10天(+SB续)。 前新生对照组(PRE)感染了无插入载体。 通过Western blotting分析全细胞裂解产物。 (D) p38 MAPK抑制可阻止但不能逆转MKK6诱导的层粘连蛋白B1的下降。 HCA2细胞被表达MKK6EE的慢病毒感染并允许衰老(SEN(MKK6))。 未添加SB(–),感染后第8天添加48小时(+SB 48小时),或在感染前添加并维持10天(+SB cont)。 前新生对照组(PRE)感染了无插入载体。 通过蛋白质印迹分析全细胞裂解物。 (E) RelA缺失不能阻止DNA损伤诱导的层粘连蛋白B1下降。 HCA2细胞被一种慢病毒感染,该慢病毒表达两种针对RelA(shRelA)或GFP(shGFP;对照)的shRNAs,并被选中。 然后对细胞进行辐照并使其衰老(SEN(XRA))。 对前新生对照组(PRE)进行模拟照射。 通过Western blotting分析全细胞裂解产物。 (F) ATM耗竭并不能阻止DNA损伤引起的层粘连蛋白B1下降。 HCA2细胞被表达shRNA对抗ATM(shATM)或GFP(shGFP;对照)的慢病毒感染并选择。 然后对细胞进行辐照并使其衰老(SEN(XRA))。 对前新生对照组(PRE)进行模拟照射。 通过Western blotting分析全细胞裂解产物。 (G) ROS抑制不能阻止DNA损伤诱导的层粘连蛋白B1下降。 照射前向HCA2细胞中添加NAC(10 mM),并保持至XRA(SEN(XRA))后10天收集全细胞裂解物。 对前新生对照组(PRE)进行模拟照射。 NAC每天更换一次。 通过Western blotting分析全细胞裂解产物。 (H) ROS抑制不能阻止MKK6诱导的层粘连蛋白B1下降。 感染前将NAC(10 mM)添加到HCA2细胞中,并持续至样品采集。 在感染表达MKK6EE的慢病毒(SEN(MKK6))10天后收集全细胞裂解物。 前新生对照组(PRE)感染了一种缺乏插入物的慢病毒。 NAC每天更换一次。 通过Western blotting分析全细胞裂解产物。
同样,SB也不能阻止RAS诱导细胞衰老时层粘连蛋白B1的下降。我们用表达RAS的慢病毒感染细胞,8天后加入SB 48小时(+SB 48 h)。 或者,我们连续用SB处理细胞12天,从感染前2天开始(+SB cont)。 在这两种情况下,每天更换SB。 两种治疗方案均未对层粘连蛋白B1的下降产生任何影响( 图2C ). 除了证实层粘连蛋白B1的下降不依赖于p38 MAPK信号,数据还表明层粘连蛋白质B1的下降并不需要衰老相关的生长停滞或形态学改变,因为持续的p38 MAPK抑制可以阻止RAS表达细胞中的这两种表型( 岩崎 等。, 2003 ; 广 等。, 2009 ). 我们还将SB给予表达MKK6EE的细胞,该细胞通过组成性p38 MAPK激活诱导衰老( 图2D ). SB并没有逆转层粘连蛋白B1的下降(+SB 48小时),这表明一旦层粘连基因B1丢失,衰老诱导信号的完全阻断并不能逆转这种下降。 然而,在MKK6EE表达之前开始的持续p38 MAPK抑制(+SB-cont)阻止了层粘连蛋白B1的下降,证实了衰老信号的阻断减轻了层粘连蛋白B1表达的下降。
层粘连蛋白B1的缺失也与SASP无关,SASP在很大程度上受转录因子NF-κB的调节( 弗伦德 等。, 2011 ). 我们通过使用两种不相关的短发夹RNA(shRNAs)对抗RelA来抑制NF-κB的活性,RelA是NFκB活性所需的一种NF-κB亚单位。 shRNAs有效降低了RelA水平( 图2E )并消除衰老相关的IL-6分泌(补充图S2B; 弗伦德 等。, 2011 ). NF-κB的缺失并不能阻止XRA诱导细胞衰老时出现的层粘连蛋白B1的下降( 图2E ).
DDR通路,特别是共济失调-毛细血管扩张突变(ATM)激酶的激活,对衰老生长停滞和SASP很重要( 冯·兹格利尼基,2005年 ; 马莱特 等。, 2007 ; 罗迪耶 等。, 2009 ; 奎尔曼 等。, 2010 ). 此外,该通路独立于p38 MAPK进行调节( 弗伦德 等。, 2011 ). 为了确定DDR是否是层粘连蛋白B1下降所必需的,我们使用shRNA对抗ATM,然后通过XRA诱导衰老。 尽管ATM水平有效降低,IL-6有效抑制(补充图S2C),层粘连蛋白B1仍显著下降,与正常衰老细胞中的行为类似( 图2F ).
最后,活性氧(ROS)在衰老细胞中升高,而ROS信号被认为介导衰老生长停滞( Lu和Finkel,2008年 ; Jun和Lau,2010年 ; 帕索斯 等。, 2010 ; Rai公司 等。, 2011 ). 我们用10 mM连续处理细胞来抑制ROS N个 -乙酰半胱氨酸(NAC),在通过XRA或MKK6EE表达诱导衰老前2天开始。 尽管NAC有效降低了ROS水平(补充图S2D),但NAC治疗对两种情况下的层粘连B1下降均无影响( 图2,G 和 H(H) ).
我们得出结论,衰老相关的层粘连蛋白B1表达下降独立于p38 MAPK、NF-κB、DDR和ROS信号。
当p53或pRB通路激活时,层蛋白B1丢失
由于到目前为止检测到的所有衰老诱导剂都会导致层粘连蛋白B1的表达急剧下降,因此我们询问实现衰老生长阻滞的肿瘤抑制途径的激活是否足以耗尽层粘连基因B1的细胞。 很少有例外( 奥尔森 等。, 2002 ; Campisi和d'Adda di Fagagna,2007年 所有的衰老诱导物都激活了pRB和/或p53肿瘤抑制通路,因此我们询问层粘连B1是否会因直接激活这些通路而下降。
为了激活p53,我们使用了小分子MDM2-触角蛋白-3a,它会导致p53蛋白的积累( 埃费扬 等。, 2007 ; 熊本 等。, 2008 ). 为了激活pRB通路,我们使用慢病毒载体稳定地过度表达p16 INK4a公司 ( 博塞 等。, 2003 ; 复制 等。, 2006 ),一种自身的肿瘤抑制因子,通过阻止pRB磷酸化来激活pRB( Ohtani公司 等。, 2004 ). 我们在连续治疗或表达4天后收集全细胞裂解物,这是在其他衰老标记物表达之前的一段时间。 p53或p16水平升高 墨水4a 足以导致层粘连蛋白B1的损失( 图3,A 和 B ).
图3:
p53或p16的表达足以导致层粘连蛋白B1的丢失,这在mRNA水平上受到调节。 (A) p53稳定足以导致层粘连蛋白B1下降。 用5μM nutlin-3a或载体(PRE)处理HCA2细胞。 连续处理4天后,通过Western blotting分析全细胞裂解物。 (B) 异位p16 INK4A(墨水) 表达足以导致层粘连蛋白B1下降。 HCA2细胞被缺乏插入物(PRE)或表达p16的慢病毒感染 INK4A(墨水) (第16页 INK4a公司 OE)并选择。 感染4天后,用Western blotting分析全细胞裂解物。 (C) 层蛋白裂解产物存在于凋亡细胞中,但不存在于衰老细胞中。 用500nM staurosporine处理HCA2细胞24h诱导凋亡(Stauro)或照射4d后收集(SEN(XRA))。 对前新生对照组(PRE)进行模拟照射。 通过Western blotting分析全细胞裂解产物。 (D) 半胱天冬酶抑制可防止葡萄孢霉素诱导的层粘连蛋白B1降解,但不能阻止衰老相关层粘连肽B1的下降。 HCA2细胞用500 nM staurosporine处理24小时(Stauro)或照射4天后收集(SEN(XRA))。 对前新生对照组(PRE)进行模拟照射。 如有指示,从staurosporine/XRA之前开始添加泛酶抑制剂z-VAD-fmk(z-VAD;100μM),直到收集到全细胞裂解物。 每天更换Z-VAD-fmk。 (E) 衰老细胞中的层粘连蛋白B1 mRNA下降。 HCA2和IMR-90细胞接受模拟辐射(PRE)或XRA处理。 4天后分离总RNA,并通过定量逆转录-PCR进行分析。 信号正常化为微管蛋白。 (F) 衰老细胞中的层粘连蛋白B1 mRNA稳定性降低。 HCA2细胞接受模拟辐射(PRE)或XRA处理。 三天后,添加放线菌素D(最终1μg/ml)以停止转录。 24小时后,分离总RNA并通过定量RT-PCR进行分析。 添加放线菌素D前的转录水平设置为100%。
衰老相关的层粘连蛋白B1的丢失在mRNA水平上受到调节
细胞是否衰老或凋亡的决定只取决于几个因素,如p53磷酸化和PTEN状态( 巴戈内蒂和曼弗雷迪 , 2002 ; Campisi和d'Adda di Fagagna,2007年 ; 车道 等。, 2010 ; 李 等。, 2010 ). 在凋亡过程中,细胞结构蛋白主要被半胱氨酸蛋白酶降解,核层粘连蛋白是半胱氨酸酶的靶点( 尼马提亚 等。, 1995 ; 饶 等。, 1996 ; 基维宁 等。, 2005 ). 衰老细胞的细胞核经常被破坏( 梅塔 等。, 2007 ),增加了衰老时观察到的层粘连蛋白B1下降的可能性,这是caspase介导的降解的结果。
半胱天冬酶对层蛋白的裂解可以通过蛋白质印迹观察到( 饶 等。, 1996 ; 加杜塞克 等。, 2001 ; 基维宁 等。, 2005 ). 因此,我们询问是否在衰老细胞中检测到层粘连B1裂解产物。 作为阳性对照,我们用staurosporine(500 nM; 基维宁 等。, 2005 ). Staurosporine有效诱导细胞凋亡,包括特征性的层粘连B1和层粘连A/C裂解产物; 然而,在衰老细胞中没有检测到这种裂解产物( 图3C ).
因为在诱导凋亡24小时后,层粘连蛋白裂解产物会消失( 加杜塞克 等。, 2001 ),我们用z-VAD-fmk处理细胞,z-VAD-fmk是一种不可逆的泛酶抑制剂,可以阻止凋亡过程中层粘连蛋白的caspase降解( 基维宁 等。, 2005 ). 尽管100μM z-VAD-fmk可以阻止staurosporine诱导的层粘连B1降解,但在XRA之前和之后的3d内给予z-VAD-fmk并不能阻止XRA诱导的层黏连B1丢失( 图3D ). 我们的结论是,在衰老过程中,层粘连蛋白B1不会被半胱氨酸蛋白酶裂解降解。
接下来,我们询问层粘连蛋白B1是否因mRNA水平下降而下降。 定量PCR显示,在XRA后2天内,两种细胞株的层粘连蛋白B1 mRNA显著下降(p=0.01)( 图3E ). 结合这一结果和caspase抑制无法阻止层粘连蛋白B1的下降,我们得出结论,层粘连酶B1在衰老期间是在mRNA水平上调节的,而不是通过caspase裂解在翻译后进行的。 有趣的是,层粘连蛋白B1 mRNA的下降至少部分是由于层粘连肽B1 mRNA稳定性的下降。 在加入放线菌素D停止转录后的24小时,我们测量了剩余的层粘连蛋白mRNA的量。尽管层粘连素A mRNA在早衰细胞和衰老细胞中同样下降,但层粘连酶B1 mRNA在衰老细胞中下降得更快(p=0.001)( 图3F )计算了初始(放线菌素D前)mRNA水平的差异。 这一发现表明,衰老细胞中的层粘连B1 mRNA和随后的蛋白质减少,至少部分是由于层粘连B1mRNA稳定性降低。
在衰老诱导剂量的电离辐射后,体内出现层蛋白B1丢失
为了确定体内是否发生衰老相关的层粘连蛋白B1丢失,我们检查了受照小鼠。 我们首先证实在培养的小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)中丢失了层粘连蛋白B1。 MEF来自四种不同的小鼠,并通过辐射诱导衰老。 衰老MEF的层粘连B1显著低于对照MEF(补充图S3A),这表明层粘连B1-缺失也可作为小鼠细胞衰老的生物标志物。
为了量化体内单个细胞中的层粘连蛋白B1水平,我们使用免疫荧光法。 识别自然组织环境中的衰老细胞是一项挑战,免疫荧光(与流式细胞术相反,流式细胞仪中的细胞必须分离)提供了最多的信息。 我们在人类成纤维细胞中验证了这种方法,使用一种通过免疫荧光特异检测层粘连B1的抗体( 石米 等。, 2008 ). 目视检查显示,与对照细胞相比,层粘连蛋白B1衰老程度下降( 图4A )导致层粘连B1强度直方图发生显著变化( 图4B ). 当对每种情况的数据进行平均时,衰老细胞中的平均层粘连B1强度显著降低(补充图S3B)。 无论是专门检测层粘连蛋白B2的抗体还是同时检测层粘着蛋白B1和B2的疫苗,都没有显示出衰老细胞和对照细胞之间的强度发生显著变化(补充图S3C)。
图4:
急性DNA损伤后,体内出现层粘连蛋白B1丢失。 (A) 层粘连蛋白B1免疫荧光的代表性图像。 对HCA2细胞进行模拟照射(PRE)或照射(XRA)并使其衰老(SEN(XRA))。 固定细胞并对层粘连B1进行免疫染色。 (B) 通过免疫荧光验证层粘连蛋白B1定量:核强度直方图。 HCA2细胞按A处理。使用细胞轮廓仪测量每个确定核区域的层粘连B1强度。 p<0.0001(C)小鼠肝脏层粘连蛋白B1染色的代表性图像。 对小鼠进行辐照(7-Gy XRA)或未经治疗(对照)。 12周后,取肝脏,切片,免疫染色检测层粘连蛋白B1。 在每个确定的核区域测量层粘连蛋白B1的强度。 (D) 照射后小鼠肝脏中的层粘连蛋白B1而非层粘连素C核强度下降:核层粘连强度直方图。 对小鼠进行辐照或未经处理(对照)。 12周后,采集肝脏,切片,并对其进行层粘连B1(顶部)和层粘连C(底部)的免疫染色。 核染色用细胞轮廓仪定量。 在对照组和XRA条件下,通过平均四只小鼠的相对贡献来计算垃圾箱数量。 (E) 照射后小鼠肝脏中的层粘连蛋白B1而非层粘连素C核强度下降:平均核层粘连强度。 D的数据表示为四只小鼠在对照和XRA条件下的平均层粘连强度的平均值。 层粘连B1的p=0.02,层粘连C的p=0.71。(F)照射后层粘连B1mRNA在体内下降。 在照射后12周,从对照小鼠和小鼠的肝脏、肺、肾和皮肤中获取。 mRNA被纯化,层粘连蛋白B1 mRNA水平通过定量PCR测定,并归一化为微管蛋白。 为了从每只小鼠的四个器官中产生一个单独的层粘连蛋白B1 mRNA值,对每个器官进行等量加权(每个器官的平均对照层粘连肽B1水平设置为1),并将每个小鼠的层粘着蛋白B1水平合并。 然后对每种情况下的整只小鼠池进行平均:对照组,n=4; 7-Gy X射线衍射仪,n=5。
我们对未经治疗的小鼠(对照组)和之前用7 Gy(7-Gy XRA)照射12周的小鼠的肝脏切片进行了类似的免疫荧光分析。 我们选择肝脏是因为之前的报告显示,该组织中存在衰老细胞的积聚( 天堂 等。, 2001 ; 薛 等。, 2007 ; 克里扎诺夫斯基 等。, 2008 ; 王 等。, 2009 ; 勒 等 ., 2010 ),肝脏显示低背景染色,允许准确定量。 为了确定层粘连蛋白B1的表达水平,我们量化了来自对照组(n=4)和受照小鼠(n=40; 图4C ). 在受照射的肝脏中,层粘连蛋白B1(而非层粘连素C)表现出向低强度转移( 图4D )其中衰老细胞持续存在( 勒 等 ., 2010 ). 染色强度的重叠分布不允许我们自信地将辐照组织中的单个细胞核标记为“层粘连B1阳性”或“层粘着B1阴性”,尽管未来的优化可能允许进行单细胞分析。 当平均每种情况下肝脏的平均层粘连强度时,受照小鼠肝脏的层粘连B1而非层粘连C的平均强度显著降低(p=0.02)( 图4E ).
考虑到电离辐射后层粘连蛋白B1蛋白的减少,我们询问照射12周后肝脏和其他组织中层粘连B1 mRNA是否下降。 我们分析了XRA前后小鼠肝脏、肾脏、皮肤和肺的mRNA,将其归一化为微管蛋白,并对每个器官进行加权,以计算每个动物的平均层粘连蛋白B1水平。 然后对每种情况下的动物进行平均。 受照小鼠的p16显著增加 墨水4a mRNA水平,表明多个组织中存在衰老细胞(补充图S3D)。 受照小鼠的层粘连蛋白B1 mRNA水平也显著低于未受照小鼠(对照组; 图4F )证明体内层粘连蛋白B1蛋白和mRNA在衰老诱导剂量的电离辐射下下降。
讨论
我们在这里显示,当细胞通过多种方式被诱导衰老时,层粘连蛋白B1急剧下降。 我们还表明,在多种人和鼠成纤维细胞株中,以及在导致体内衰老细胞持续存在的急性DNA损伤后,层粘连蛋白B1的下降是衰老的标志( 勒 等。, 2010 ). 尽管在致癌RAS或MKK6EE表达诱导的衰老细胞中,拉明A被耗尽,但在DNA损伤或复制衰竭诱导的衰老的细胞中,没有被耗尽。 此外,无论衰老诱导剂是什么,层粘连蛋白B2还是层粘连蛋白质C都没有下降。 我们得出结论,层粘连蛋白B1的下降,而不是层粘连蛋白B2、层粘连蛋白a或层粘连蛋白C的下降,可能是衰老的一般生物标志物。
在暴露于衰老诱导的刺激后(2 d),层粘连蛋白B1迅速下降,并不是细胞周期阻滞的一般特征,因为静止细胞将层粘连B1保持在与增殖细胞相同的水平。 有趣的是,层粘连蛋白B1的丢失并没有通过抑制控制衰老许多其他方面的途径来阻止,例如SASP。 因此,层粘连蛋白B1的下降与p38 MAPK/NF-κB通路、DDR通路和ROS信号通路无关。 然而,直接p53激活或直接p16强烈诱导了层粘连蛋白B1的下降 INK4a公司 表达式。 因为几乎所有衰老诱导剂都强烈依赖于p53或pRB/p16 INK4a公司 在其他环境和细胞类型中,层粘连蛋白B1的丢失可能是一个通用的衰老标记。 一个例外可能是氧化应激,它可以诱导衰老的某些特征(例如生长停滞、SA-βgal表达),但不是所有特征(例如c-FOS诱导性丧失、SASP; 帕里内洛 等。, 2003 ; 复制 等 ., 2010 ). 最近的一份报告( 巴拉斯库 等。, 2012 )结果表明,氧化应激通过增加层粘连蛋白B1的表达来诱导衰老,这表明一些衰老细胞并不表达衰老标记的全部补体。 然而,层粘连蛋白B1与氧化应激之间的关系有待进一步研究,因为另一份最近的报告表明,通过shRNAs耗竭层粘连蛋白质B1会通过活性氧降低导致衰老( 石米 等。, 2011 ).
衰老时的层粘连蛋白B1下降与凋亡时的caspase介导层粘连降解不同,因为衰老细胞中没有层粘连裂解产物。 此外,抑制半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶并不能阻止与衰老相关的层粘连蛋白B1水平的下降。 相反,层粘连蛋白B1的丢失是由于mRNA水平的早期下降。 这种下降至少部分由层粘连蛋白B1 mRNA稳定性的下降介导。 考虑到层粘连蛋白A mRNA的稳定性不受影响,我们假设层粘连肽B1 mRNA在衰老过程中通过as-yet-unidentified机制被特异性破坏。
虽然没有一个标记是完全特异的,但许多衰老标记已被用于鉴定体内的衰老细胞( Campisi和d'Adda di Fagagna,2007年 ; 奎尔曼 等。, 2010 ). 例如,生长停滞虽然是衰老的必要条件,但不足以确定体内的状态细胞是终末分化或静止的( 奎尔曼 等。, 2010 ). 第16页 INK4a公司 与衰老和年龄高度相关( 津迪 等。, 1997 ; 里希纳穆尔蒂 等。, 2004 ; Ohtani公司 等。, 2010 ),尽管一些肿瘤细胞表达高水平的p16 INK4a公司 此外,第16页 INK4a公司 衰老不需要表达,因为一些细胞在DNA损伤后仅通过激活p53通路衰老( 博塞 等。, 2003 ). 此外,最广泛使用的衰老标记SA-βgal对衰老既不必要也不充分( 迪姆里 等。, 1995 ; 李 等。, 2006 )并且在体内不稳定且难以检测。 我们在此报告,层粘连蛋白B1在具有持续衰老细胞的小鼠组织中下降,因此可能在研究和临床应用中都有用。 我们发现,12周前照射过的小鼠组织中,层粘连蛋白B1 mRNA和蛋白有轻微但显著的下降,这与少数持续性衰老细胞一致( 勒 等。, 2010 ). 我们让小鼠接受的放射治疗方案与接受癌症放射治疗的人类患者所经历的类似。 优化层粘连蛋白B1的测量可能会产生一种健壮的体内衰老细胞单细胞测试,为研究人员和临床医生提供一种工具,用于准确评估各种疾病患者组织中衰老细胞的相对贡献,包括癌症、糖尿病、慢性炎症、, 以及与年龄相关的疾病。
材料和方法
细胞培养
获得原代人成纤维细胞(HCA2、WI-38、IMR-90、BJ株)并按所述进行培养( 复制 等。, 2008 ). 除非另有说明,文本和图例中的“成纤维细胞”或“细胞”指HCA2成纤维细胞。 PRE HCA2细胞完成了<35倍的群体倍增,24小时BrdU标记指数>60%。 如前所述,通过重复继代培养使细胞发生复制性衰老( 迪姆里 等。, 1995 ; 克托利卡 等。, 2001 ). 对于DNA损伤诱导的衰老,细胞生长到汇合处,暴露在10-Gy x射线下,除非另有说明,否则在8-10天后进行分析; 模拟照射PRE细胞。 对于肿瘤诱导的衰老,细胞被表达RAS的慢病毒感染 V12版本 ( 博塞 等。, 2003 ; 复制 等。, 2008 )8~10d后进行分析。
化学抑制剂和诱导剂
细胞被给予10μM SB203580(559395;Calbiochem,La Jolla,CA)或10 mM NAC(A7250;Sigma-Aldrich,St.Louis,MO)溶解于水中并每日补充。 用溶于二甲基亚砜中的100μM z-VAD-fmk(FMK001;R&D Systems,Minneapolis,MN)处理细胞,并每日补充。 Staurosporine(500 nM)来自Sigma-Aldrich(S4400)。
载体、病毒和感染
MKK6EE、基因抑制因子22和RAS V12版本 如前所述,被子克隆到网关目标向量670-1中( 博塞 等。, 2003 ; 坎波 等。, 2009 ). 使用无插入载体感染作为对照。 针对绿色荧光蛋白(GFP;RHS4459)和RelA(TRCN0000014686,TRCN000001687)编码shRNAs的慢病毒载体来自Open Biosystems(Thermo Biosystes,Huntsville,AL)。 编码ATM shRNA的慢病毒载体( 罗迪耶 等。, 2009 )和病毒产生如所述( 纳尔迪尼 等。, 1996 ; 博塞 等。, 2003 ).
免疫荧光
细胞在玻璃室载玻片上培养,用福尔马林固定10分钟,并用0.1%Triton在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中渗透。 在PBS中用1%牛血清白蛋白(BSA)和4%正常驴血清在室温下封闭玻片30分钟,清洗玻片,并在PBS的1%BSA中用一抗在室温下孵育1小时。用Alexa Fluor(Alexa 350,488,594;Molecular Probes,Invitrogen,Carlsbad,CA)清洗玻片并孵育 用1%BSA中的二级抗体以1:750的比例在PBS中标记45分钟。用4′,6-二氨基-2-苯基吲哚(DAPI)标记DNA。 用Vectashield(H1000;加利福尼亚州伯林盖姆Vector Laboratories,Burlingame)清洗并安装载玻片。 初级抗体如所述( 石米 等。, 2008 )并在以下稀释液中使用:层粘连蛋白B1,1:1000; 层粘连蛋白B2,1:500; 层粘连蛋白B1和B2(M-20),1:500; 层粘连蛋白C(321-11),1:3000。 使用CellProfiler(一种开放存取的图像分析程序)对图像进行量化( 网址:www.cellprofiler.org ).
收获小鼠肝脏,快速冷冻,切片,装在载玻片上,然后固定并在−20°C下用冰镇甲醇/丙酮(50/50)渗透5分钟。 在室温下用1%牛血清白蛋白和5%正常山羊血清在PBS中清洗并封闭载玻片1小时,按照细胞培养所述用一级和二级抗体清洗并培养载玻片。 使用带DAPI的ProLong Gold防褪色试剂清洗并安装载玻片( 第36931页 ; Invitrogen)。 使用CellProfiler对图像进行定量。
蛋白质印迹分析
用温热的PBS清洗细胞,在含有蛋白酶抑制剂(P8340,1:200;Sigma-Aldrich)的变性(1%SDS,10 mM Tris)或非变性(Cell Lysis Buffer,9803;Cell Signaling,Beverly,MA)缓冲液中溶解和刮除细胞 和磷酸酶(200 mM咪唑、100 mM氟化钠、115 mM钼酸钠、100 mC原钒酸钠、400 mM酒石酸钠,1:100)。 将裂解液进行针剪,通过离心进行澄清,使用4-12%双三凝胶进行SDS-PAGE,并转移到聚偏氟乙烯膜上。 用圣克鲁斯生物技术公司(Santa Cruz,CA;NF-κB p65,SC-8008,1:1000;MKK6,SC-1992,1:1000, Sigma-Aldrich(微管蛋白,T-5168,1:4000)、BD转导实验室(肯塔基州列克星敦;RAS,R02120-050,1:1000)或BD生物科学(加利福尼亚州圣地亚哥;p16 INK4a公司 , 554070, 1:1000; 层粘连蛋白A/C,6121621:4000)。 在室温下清洗膜并用辣根过氧化物酶(1:5000;细胞信号)或IR-dye(1:20000;LI-COR Biosciences,Lincoln,NE)结合二级抗体培养45分钟,然后清洗,分别通过增强化学发光或LI-COR Odyssey检测信号。
定量逆转录-PCR
使用RNeasy Mini Kit(74104;加利福尼亚州瓦伦西亚Qiagen)和iScript cDNA合成试剂盒(170-8891;加利福尼亚州Hercules Bio-Rad)生成的cDNA分离RNA。 使用UPL系统(印第安纳波利斯罗氏)测定mRNA水平。 人类引物(探针编号分别为31、17和58)如下:LMNB1,3′:aagcagctggtgtgtt; LMNB1,5′:ttggatgctcttggttc; LMNA,3′:agcaaagtgcgtgaggatt; LMNA,5′:tcaggtaccctcctttg; 微管蛋白,3′:cttcgtctccgccatcag; 微管蛋白,5′:ttgccaatctggacacca。 小鼠LMNB1引物如下(探针#15):3′:gggaagttattcgcttgaaga; 5′:atctccagcccatt。
酶联免疫吸附试验和条件培养基
检测IL-6(D6050)的酶联免疫吸附测定(ELISA)试剂盒来自研发系统。 通过用无血清DMEM洗涤并在无血清DMEM中孵育24小时制备条件培养基。所有ELISA数据均归一化为细胞数。
统计分析
除非另有说明,否则使用双尾学生的 吨 等方差检验和假设。 使用二元分析(即阳性和阴性得分)之间的统计显著性通过交叉检验进行评估。 误差条表示SD。
致谢
我们感谢Robert Goldman用于免疫荧光的抗层粘连抗体,感谢Eisuke Nishida(日本东京大学)用于pSRalpha-myc-MKK6-EE载体。 这项工作得到了美国国立卫生研究院(National Institutes of Health Research Grants)AG09909和AG017242(J.C.)以及美国国家科学基金会(National Science Foundation)研究生奖学金(a.F.)的支持。
使用的缩写:
自动取款机
共济失调毛细血管扩张突变
BrdU公司
溴脱氧尿苷
DAPI公司
4′,6-二氨基-2-苯基吲哚
DDR公司
DNA损伤反应
酶联免疫吸附法
酶联免疫吸附试验
HGPS公司
早衰症
MAPK公司
丝裂原活化蛋白激酶
最大有效载荷
小鼠胚胎成纤维细胞
NAC公司
N个 -乙酰半胱氨酸
运行经验
过度表达
之前
现成的
魁北克
静止的
代表
可复制的
ROS公司
活性氧物种
SA-β加仑
衰老相关β-半乳糖苷酶
SASP公司
衰老相关分泌表型
某人
SB203580型
SEN公司
衰老的
shRNA
短发夹RNA
X射线衍射分析
x射线
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