跨物种研究揭示NF-κB在抗癌治疗结果中的对立作用

TIS中NF-κB活性增加

我们之前建立了淋巴蛋白Eμ-myc公司转基因小鼠作为TIS模型系统(Schmitt等人，2002年;Reimann等人，2007年). 分离原发性真菌驱动的B细胞淋巴瘤（以下称为“对照”淋巴瘤），进行逆转录病毒治疗β细胞淋巴瘤/白血病基因2转导阻断细胞凋亡，并暴露于DNA损伤的化疗药物阿霉素（ADR）。第5天，ADR治疗对照组；bcl2淋巴瘤完全生长停滞，增殖标志物Ki67染色阴性，并均匀地表现出衰老相关的β-半乳糖苷酶活性（SA-β-gal）（补充图S1A，B；Dimri等人，1995年). 为了揭示转录组水平上TIS相关的变化，我们从12对匹配的主要对照组中生成了全基因组微阵列基因表达谱（GEP）；药物衰老或未经治疗的bcl2淋巴瘤。基因集富集分析（GSEA）表明，NF-κB靶基因作为一个整体，特别是NF-κ的B控制的细胞因子，强烈倾向于TIS组(图1A; 补充表1）。支持这一结果，一项基于多重DNA-结合ELISA的未经治疗与衰老淋巴瘤配对分析检测到衰老细胞中NF-κB家族四个亚单位p50、p52、p65（RelA）和RelB的DNA-绑定活性显著升高，表明TIS中经典和替代NF-κB通路均被激活(图1B). 因此，TIS淋巴瘤中免疫荧光染色的p65主要位于细胞核，而非基因细胞显示出优先的细胞质定位(图1C). 通过免疫印迹分析，TIS淋巴瘤还表现出Ser 536磷酸化p65（p65-P-S536）的诱导表达水平，这种翻译后修饰被认为可以增加p65反式激活功能(图1D;Buss等人，2004年). 为了确认单个靶基因水平的NF-κB活性，我们通过定量实时PCR（RQ-PCR）测量了微阵列分析中差异调节基因产物中转录物的表达。事实上，与非基因淋巴瘤细胞相比，所有NF-κB靶基因检测非分泌基因和SASP在TIS中的表达水平更高(图1E). 总之，活化的NF-κB信号传导是化疗相关肿瘤细胞衰老的一个显著特征。

TIS依赖体内完整的NF-κB功能

接下来，我们询问TIS是否不仅表现出增强的NF-κB活性，而且取决于它。首先，我们测试了NF-κB超级阻遏物IκBα-ΔN（SR）-一种不可降解的IκBα部分的稳定表达是否使NF-κB失活(Krappmann等人，1996年)肿瘤坏死因子-α（TNF-α）治疗后NF-κB靶基因表达水平降低，对未治疗淋巴瘤细胞的增殖影响很小（补充图S2A，B）-足以干扰TIS条件的功能特性。事实上，在ADR暴露的SR工程对照组中，大多数NF-κB靶基因（SASP和非分泌基因）的表达显著降低；bcl2淋巴瘤组，在对具有或不具有代表性NF-κB控制的SASP因子SR部分的相同单个淋巴瘤的配对分析中进一步强调(图2A; 有关暴露于多种药理性IKK抑制剂后获得的类似结果，请参见补充图S2C）。基于这些发现，我们提出了一个明显的问题，即NF-κB活性的消融是否会影响化疗后衰老的诱导性。事实上，对仅在SR状态上不同的配对进行的基于SA-β-gal的分析显示，从一些SA-β-gal阳性细胞的百分比大幅下降到SR队列中其他淋巴瘤的未受损TIS表型，与空载体组相比，SR中SA-β-gal反应性平均降低了30%以上，相应的细胞数平均增加了2.5倍以上(图2B; 数据未显示）。总的来说，这些数据表明，无论是细胞内、自分泌还是旁分泌的作用方式，在同型肿瘤细胞群中，推测的前发性NF-κB调控功能的作用不大(Acosta等人，2008年;Kuilman等人，2008年)-至少在一部分遗传易感原发性肿瘤中。NF-κB网络不是作为DDR诱导衰老途径的一个线性和基本组成部分发挥作用，可以很好地想象，它是前发性DDR的一个证实性的、间接的中继。在这种情况下，所有细胞在培养基中均匀暴露于化疗药物可能会在每个给定细胞中启动如此强大的DDR级联反应，以致SR对衰老增强原理的定量减少不会立即转化为衰老缺陷表型，但侧支前发途径会出现功能障碍，从而使NF-κB信号对TIS的贡献至关重要。

体内情况要复杂得多，包括不均匀药物输送和体外分析未涵盖的异型细胞-细胞相互作用等方面。为了解决NF-κB活性对药物诱导衰老表型的潜在贡献，我们决定研究体内遗传相容性移植淋巴瘤。控制；将逆转录病毒感染SR构建物或空载体的bcl2淋巴瘤移植到正常、免疫活性的受体小鼠中，在那里它们形成的系统性淋巴瘤与它们最初来源的原始转基因宿主没有区别。在可触及外周淋巴结病时，对具有类似肿瘤负担的小鼠进行一次DNA损伤抗癌药物环磷酰胺（CTX）治疗，并在5天后分析淋巴瘤的TIS原位征象。有趣的是，体内CTX暴露后，TIS-活性淋巴瘤几乎没有SA-β-gal反应性，如果表达SR部分，则Ki67阳性细胞>80%(图2C). 因此，SR表达的淋巴瘤在体内表现出更为深刻的TIS缺陷，即使它们在体外仅表现出SA-β-半乳糖反应性的一些降低，这表明旁观者细胞在肿瘤微环境中具有关键的NF-κB依赖性促生作用。值得注意的是，正如Lowe及其同事报道的那样，衰老与宿主免疫细胞的相关相互作用也受到NF-κB活性的共同控制(Chien等人，2011年; 另请参阅Xue等人，2007年)因此，提示免疫介导的衰老细胞清除是NF-κB控制肿瘤生长的另一个环节。综上所述，NF-κB网络是药物诱导衰老反应的关键组成部分，因此其对细胞自主和非细胞自主衰老相关过程的干扰的实际定量影响只能在体内进行评估。

致癌网络决定NF-κB在治疗结果中的相反作用

鉴于SR工程化的分枝淋巴瘤在体内无法启动TIS反应，我们旨在量化和分析NF-κB信号对自然形成的B细胞淋巴瘤在任何治疗之前的长期预后的贡献。虽然在候选途径中具有明确遗传损伤的癌症小鼠模型是重要的研究工具，但它们可能会错过甚至干扰驱动自然发展肿瘤的关键致癌网络相互作用。因此，我们从一系列12个初级Eμ-myc公司淋巴瘤，通过p65 DNA-结合ELISA评估其内源性NF-κB激活水平，并将其分为“NF-κ子B低”（NL，最低的四例）和“NF-kb高”（NH，最高的四例(图3A). 首先，我们试图确定其短期药物敏感性，以反映其凋亡潜力。预期NH组实际上对体外ADR治疗产生了耐药性，而NL组的淋巴瘤细胞在相同剂量水平下定量死亡(图3B). 由于Bcl2在人类B细胞淋巴瘤和真正的NF-κB靶点中经常过度表达，我们推断NH淋巴瘤中可能通过Bcl2的诱导介导化疗耐药性，至少部分是这样的(Schmitt等人，2000年;Feuerhake等人，2005年). 的确，Bcl2公司通过RQ-PCR测量，NH组的转录水平显著高于NL组(图3C). 当我们从两组逆转录病毒等位基因中过度表达Bcl2时，Bcl2使NL淋巴瘤与NH淋巴瘤一样具有化疗耐药性(图3D). 相反，我们询问抑制NF-κB活性是否可以克服NH组的短期耐药性。虽然SR部分对NF-κB功能的失活在NL组中几乎没有影响，但它恢复了NH组的化疗敏感性，从而揭示了在化疗期间作为该组“致命弱点”的高活性NFκB信号(图3E;Staudt 2010年). 综上所述，一部分原发性Myc-driven淋巴瘤在诊断时表现出高水平的NF-κB活性，这表明在淋巴瘤发展过程中选择的NF-kb B网络具有致癌功能，同时预测了原发性耐药性。

总结DLBCL患者的临床结果，～60%的小鼠携带Eμ-myc公司对照组淋巴瘤获得长期缓解（反映治愈），而其余40%在CTX诱导治疗后复发(Schmitt等人，1999年,2000;Lenz等人，2008b). 我们生成了13个原发性（非β细胞淋巴瘤/白血病基因2-感染）Eμ-myc公司淋巴瘤移植到受体小鼠体内，并在淋巴瘤出现时暴露于CTX。当所有动物都进入缓解期时，有7例淋巴瘤在100天的观察期内复发，我们可以将诊断时的13例淋巴瘤分为“永不复发”（NR）或“复发预防”（RP）。基于先前的结果，我们通过表达IκBα，一个中央NF-κB调节器和NF-κ）B靶点，以及Bcl2公司在这两组未经治疗的淋巴瘤中(图4A). 引人注目的是，RP淋巴瘤的发病率明显高于IκBα表达水平进一步升高β细胞淋巴瘤/白血病基因2表达水平，从而使人想起NF-κB/Bcl2网络在图3在活化B细胞样（ABC）DLBCL中可检测到的遗传标志性病变中，预测性较低的DLBCL亚型的特征是NF-κB通路中的多种激活突变导致组成性活性NF-κ的B信号传导，并且具有非常高的Bcl2公司转录水平(Iqbal等人，2006年;Lenz等人，2008b;Compagno等人，2009年;Staudt 2010年;Nogai等人，2011年).

相反，生发中心B细胞样（GCB）DLBCL具有更好的临床结果(Lenz等人，2008b)尽管Bcl2过表达在该亚型中也很常见。重要的是，GCB DLBCL很少具有活化的NF-κB突变，但经常（~45%）在t（14；18）易位的背景下发展，该易位以NF-κB非依赖性的方式通过免疫球蛋白重链基因座驱动Bcl2过表达，这种病变在ABC型DLBCL中几乎从未发现(Nogai等人，2011年). 如果外源性Bcl2过度表达阻断小鼠淋巴瘤中药物诱导的凋亡，从而模拟GCB相关t（14；18）易位，则NR淋巴瘤能够进入TIS（数据未显示）。为了测试更高的NF-κB激活水平是否会进一步促进这些淋巴瘤的衰老诱导，我们使用了一种强烈的NFκB活化卡片11（也称为CARMA1公司或Bimp3型)突变体，人类CARD11-L244P突变体的小鼠同源物，其过度表达导致NF-κB靶基因表达增加（补充图S3；Lenz等人，2008a). 自然发生时卡片11突变优先出现在ABC DLBCL中，我们在这里使用这种突变来增强“GCB回忆”淋巴瘤队列中的NF-κB活性，该队列是在缺乏高度激活的NF-kb B的情况下形成的，并且凋亡通过自身Bcl2过度表达而独立于NF-kbB被阻断。事实上，在早期，当ADR暴露的Bcl2-engineed NL淋巴瘤在TIS症状方面仍基本呈阴性时，高比例的匹配突变CARD11-过度表达淋巴瘤细胞已被SA-β-gal活性染色为阳性(图4B)表明较高的NF-κB活性通过TIS促进治疗结果。

因此，我们决定对233名患者进行利妥昔单抗-CHOP样标准免疫化疗（包括ADR和CTX）后的DLBCL GEP和临床数据进行大数据集查询(Lenz等人，2008b)，并在Bcl2高表达的GCB DLBCL患者子集中，询问由63个已知NF-κB靶基因组成的先前确定的NF-κ的B基因表达特征是否允许我们将两组临床结果不同的患者进行分层(Shaffer等人，2006年). 的确，如所示图4C,Bcl2公司-NF-κB标志性表达高于中位数（NH；n个=25）与补充NL组相比，无进展生存率显著提高(n个= 24;P（P）<0.005），而在携带高Bcl2公司-表达ABC亚型淋巴瘤或低表达Bcl2公司表达式（补充图S4；未显示数据）。值得注意的是，多变量分析表明NF-κB状态Bcl2公司-过度表达的GCB DLBCL病例在统计上与国际预后指数总分无关(P（P）=0.3956），用作预测淋巴瘤患者预后的临床标准(1993年国际非霍奇金淋巴瘤预测因素项目). 总之，我们的实验策略确定了一个遗传定义的、具有临床意义的GCB DLBCL患者亚组，如果NF-κB信号传导过度活跃，这些患者的治疗效果会更好，从而对比了ABC亚型与组成性活性NF-κB信号传导和不良治疗结果的既定关联。

小鼠、淋巴瘤监测和体内治疗

本研究中使用的所有动物方案均经政府审查委员会（柏林Landesamt Berlin）批准，并符合各自的监管标准。Eμ-myc公司通过等位基因特异性基因组PCR对转基因小鼠进行基因分型，并监测淋巴瘤发病情况(Adams等人，1985年;Schmitt等人，1999年). 分离活的淋巴瘤细胞，通过尾静脉注射将其移植到应变匹配的C57BL/6受体小鼠（～3×10⁶至5×10⁶每只小鼠的细胞数），或在培养基中繁殖，并按照所述进行snap冷冻或福尔马林固定淋巴结组织的保存(Schmitt等人，1999年). 在受体动物可触及淋巴结的那一刻，将小鼠暴露于单次腹腔内剂量的CTX（300 mg/kg体重），并通过淋巴结触诊或治疗后第5天分离的淋巴瘤材料来监测反应(Schmitt等人，1999年,2002).

定点突变、质粒和逆转录病毒基因转移

致癌CARD11-L251P突变（在ABC DLBCL细胞系OCL-Ly3中检测到的人类CARD11-L244P突变的小鼠同源物）(Lenz等人，2008a)由全长野生型小鼠CARD11（BioCat）的定点突变产生。编码小鼠野生型CARD11、CARD11-L251P、Bcl2和NF-κB SR的cDNA(Krappmann等人，1996年)被亚克隆到小鼠干细胞逆转录病毒（MSCV；即，进入MSCV-IRES-GFP或MSCV主干中，同时存在一个短杆菌素或嘌呤霉素抗生素耐药基因）。用带有相应MSCV质粒的Phoenix包装细胞瞬时转染产生的逆转录病毒上清液稳定感染Eμ-myc公司转基因淋巴瘤细胞(Schmitt等人，2000年).

生长参数和体外药物测定

通过台盼蓝染料排除法评估细胞数量和细胞活性，并在添加指定浓度的ADR后24 h或5 d分别测量细胞毒性或细胞衰老(Schmitt等人，1999年;Reimann等人，2010年). 在一些实验中，淋巴瘤细胞预先暴露于NF-κB抑制剂Bay11-7082（1μM；IκBα磷酸化抑制剂；Sigma-Aldrich）、TPCA-1（0.5μM；IKK-2抑制剂；Merck）或KINK-1（0.4μM；一种IKK-1抑制剂；由M.Schmidt-Supprian善意提供[Schon等人，2008年])在随后的ADR治疗之前，或在50μM浓度下用TNF-α（Sigma-Aldrich）治疗30分钟或24小时。对于MSCV-SR-IRES-GFP感染细胞的GFP富集分析，ADR暴露前后GFP阳性细胞百分比的变化通过用MSCV-GFP对照载体感染的GFP阳性细胞的各个部分进行标准化。如前所述，在snap冰冻淋巴结冰冻切片中进行悬浮培养的细胞分裂素制备，用于随后的抗原或SA-β-半乳糖活性检测染色以及原位SA-β-gal分析(Schmitt等人，2002年;Braig等人，2005年;Reimann等人，2010年).

NF-κB DNA结合活性

根据制造商的方案，使用TransAm Flexi NFκB家族转录因子ELISA分析（Active Motif）测量五种哺乳动物NF-κB亚单位的DNA结合活性。

基因表达分析

为了对淋巴瘤细胞中NF-κB靶基因进行RQ-PCR分析，使用SuperScript逆转录酶（Invitrogen）和随机六聚体或寡核苷酸将用TRIzol（Invit罗gen）提取的RNA转录到cDNA中。小鼠RQ-PCR分析Bcl2公司,CCL2级,CCR7号机组,c-FLIP公司,CXCL1系列,CXCR2型,周期素D2抗原,GADD45b公司,GAPDH公司,GM-CSF公司,IGFBP6型,IGFBP7型,IκBα,IL-1α,白细胞介素-6,IRF-4型、和SOD2标准转录本是基于商用引物（Applied Biosystems）进行的。对于每个给定的样本，ΔCt值被确定为特定转录物的Ct值与GAPDH公司作为内务管理控制mRNA，然后根据2^{（-ΔΔCt）}ΔΔCt=ΔCt_治疗−ΔCt_{未经处理的}.

使用在十二烷基硫酸钠（SDS）样品缓冲液（60 mM Tris-HCl，pH 6.8，10%甘油，2%SDS和5%2-巯基乙醇）中裂解细胞生成的全细胞裂解物进行免疫印迹，在12%SDS-PAGE上进行解析，并使用Bcl2抗体转移到Immobilon-P膜（Millipore）（1:2000稀释；#554087，BD Pharmingen）（数据未显示），H3K9me3（1:1000；ab8898，Abcam），NF-κB p65（1:1000，#3034，细胞信号技术），NFκB P 65-P-S536（1:1000：#3033，细胞信号技术），以及α-管蛋白（1:2500；T5168，Sigma）作为负载控制(Schmitt等人，1999年). 对于免疫荧光，细胞固定在4%多聚甲醛中，用0.1%Triton X-100/PBS渗透，用1%牛血清白蛋白封闭，用抗p65的一级抗体（1:250；Santa Cruz Biotechnologies，SC-372）孵育，然后用0.01%吐温20作为洗涤剂缓冲液和二级抗兔IgG抗体（1:400；AlexaFluor 488[A11008]，Invitrogen）；用DAPI（4′，6-二氨基-2-苯基吲哚）对载玻片进行染色，作为核复染，并用Mowiol 4-88（钙生物化学）固定载玻片。为了对Ki67进行免疫染色，将2%的副甲醛固定胞浆制剂或组织冷冻切片与抗Ki67的一级抗体（1:25；M7240，Dako）孵育，然后使用链霉亲和素-生物素复合物过氧化物酶试剂盒（LSAB⁺System-AP，DakoCytomation），根据制造商的说明使用。

对于基于微阵列的基因表达谱，从未处理或5-d ADR处理的对照中分离RNA；bcl2 Eμ-myc公司使用RNeasy minikit（Qiagen）的淋巴瘤，并根据制造商的说明与Affymetrix小鼠基因组430 2.0微阵列（Affymmetrix）杂交。阵列在GeneChip Fluidics Station 450中进行杂交和清洗，并在Affymetrix GeneChip3000扫描仪上检测到信号。Affymetrix文件被导入Partek Genomic Suite软件（6.4版，Partek，Inc.），并由实现的稳健多阵列（RMA）工作流程进行处理（包括中值抛光探针集摘要、RMA背景校正和分位数归一化）。原始微阵列数据以登录号存放在国家生物技术信息中心的基因表达综合（GEO）存储库GSE31099标准(网址：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi？acc=GSE31099).

为了进一步分析小鼠微阵列数据，在没有进一步改变的情况下，从Thomas Gilmore实验室网站获取了NF-κB激活的基因签名（完整的基因列表和相关参考文献可在http://www.bu.edu/nf-kb/gene-resources/target-genes). NF-κB靶基因集在未经治疗与ADR治疗对照组配对的全球转录信号中的富集；应用GSEA 2.0版软件（麻省理工大学布罗德学院和哈佛大学，http://www.broad.mit.edu/gsea). 归一化富集分数（NES）反映了P（P）-值<0.05，FDR（错误发现率）值<0.25(Subramanian等人，2005年).

233名接受R-CHOP样免疫化疗并使用Affymetrix HG-U133 Plus 2.0微阵列进行分析的患者的淋巴瘤活检的基因表达数据(Lenz等人，2008b)，来自NCBI GEO(GSE10846标准). 患者按照以下标准分为ABC DLBCL、GCB DLBCL和非分类DLBCLLenz等人（2008b）100例GCB DLBCL患者样本（可获得无进展生存期的临床随访信息）均分为高、低两组Bcl2公司表达式，基于中值表达式。在这两个队列中，患者随后根据之前描述的由63个已知NF-κB靶基因组成的NFκB基因表达特征的中位数表达分为高NF-κ子B组和低NF-κ子B组(http://lymphochip.nih.gov/cgi-bin/signaturedb/signature DB_DisplayGenes.cgi？signatureID=83;Shaffer等人，2006年).

统计评估

使用Kaplan-Meier估计计算GEP相关患者亚群的生存率，并与log-rank（Mantel-Cox）检验进行比较。皮尔逊χ²-多元分析中采用了检验法。未成婚者吨-试验用于比较平均值和标准偏差。染色反应的所有定量（即免疫染色或SA-β-gal分析）均由独立且盲法的第二位检查者进行，并反映至少三个样本，每个样本至少统计200个事件（通常在三个以上不同区域）。A类P（P）-值<0.05被认为具有统计学意义，并用星号标记。