总结
糖蛋白缺失狂犬病病毒是研究神经回路结构的有力工具。 在这里,我们描述了新资源的开发和应用,这些新资源允许实验直接研究神经电路的结构和功能之间的关系。 新的方法和试剂可以从质粒DNA中高效生产12种新型ΔG狂犬病变异体。 这些新型狂犬病病毒表达了有用的神经科学工具,包括:Ca ++ 指示灯GCaMP3,用于监测活动; 通道视紫红质-2,用于光激活; allotostatin受体,用于配体应用失活; rtTA、ER T2段 CreER公司 T2段 或FLPo,用于控制基因表达。 这些新工具可以根据神经元的连接性来定位神经元,对其功能进行分析,或对其活动或基因表达进行操纵。 将这些工具与 体内 成像和光遗传学方法,和/或转基因小鼠中的诱导基因表达,将有助于研究现有试剂无法实现的神经回路发育、可塑性和功能的实验。
关键词: 沟道视紫红质,GCaMP3,allotostatin受体,tTA,Cre,Flp
结果
从质粒DNA中回收糖蛋白缺失狂犬病病毒的系统
虽然SADΔG-GFP可以从DNA质粒中回收并使用先前建立的程序进行扩增( Buchholz等人,1999年 )我们旨在提高从DNA中回收ΔG狂犬病病毒的效率。 在这里,我们生成了新的质粒和细胞系,并测试了各种培养条件以优化恢复系统。 由于狂犬病是一种负链RNA病毒,但可用于操纵遗传物质的工具与DNA一起工作,因此有必要生成和使用几种专门的试剂,以便从一组DNA质粒中回收新的转基因狂犬病变体。 至少有四个不同的小组已经开发并使用这种系统来恢复各种狂犬病毒株( Inoue等人,2003年 ; Ito等人,2003年 ; Schnell等人,1994年 ; Wu和Rupprecht,2008年 ). 第一个公布的系统回收了SAD-B19狂犬病病毒株,利用T7启动子的转录,需要由痘苗辅助病毒提供的T7 RNA聚合酶( Schnell等人,1994年 ),在后来的发展中得到了表达T7聚合酶的细胞系(BSR T7/5)的支持( Buchholz等人,1999年 ; Wickersham等人,2007b )代替牛痘。 该系统用于之前所有回收ΔG狂犬病病毒的研究。 使用CMV启动子的转录也可以恢复完整的HEP-流感狂犬病病毒,并且不需要T7聚合酶( Inoue等人,2003年 ). 以前的研究还没有确定这种系统是否可以有效地回收ΔG狂犬病病毒或SAD-B19毒株。
为了产生本文所述的新狂犬病变种,我们独立开发了一种混合系统,用于恢复SADΔG狂犬病病毒,包括CMV和T7启动子,类似于恢复狂犬病ERA毒株的系统( Wu和Rupprecht,2008年 ). 该恢复系统由狂犬病病毒基因组质粒(pcDNA-SADΔG-GFP)和一组辅助质粒组成,该质粒包含狂犬病毒SAD-B19株的全长基因组,糖蛋白基因被删除并替换为GFP(SAD△G-GFP。 在pcDNA-SADΔG-GFP中,基因组序列两侧是锤头状核酶(HamRz)( Le Mercier等人,2002年 )和丙型肝炎病毒核酶(HdvRz)( 西蒙斯,1992年 )表达受CMV启动子和T7 RNA聚合酶启动子控制。 辅助质粒编码单个病毒基因,也受CMV和T7启动子的控制。 上述所有质粒都是在源病毒SADΔG-GFP逆转录后构建的( Wickersham等人,2007a ).
我们测试了T7 RNA聚合酶表达的重要性、三种不同细胞系的相对效用以及两种不同的转染方法,以定量比较使用这些试剂的不同恢复策略的成功率。 表达T7聚合酶的条件包括使用表达T7的细胞系BSR T7/5( Buchholz等人,1999年 )或用质粒转染HEK293t或BHK-21细胞以诱导带有核定位信号的T7 RNA聚合酶的表达( Wu和Rupprecht,2008年 ). 在这些病例中,我们尝试用磷酸钙法将狂犬病基因组质粒和辅助质粒转染细胞,以恢复SADΔG-GFP,并将细胞培养在5%的CO中 2 37°C时。 在所有表达T7聚合酶的条件下,SADΔG-GFP狂犬病病毒都可以成功恢复,但在没有T7聚聚酶的情况下,病毒无法恢复。 使用BSR T7/5细胞获得了最高的恢复率(50.0%,6次尝试中的3次),而使用转染T7聚合酶的HEK293t(16.7%,6次中的1次)或BHK-21细胞(16.7%)获得成功的可能性不到一半。 我们系统对T7聚合酶表达的要求与成功恢复完整的HEP-流感狂犬病病毒的T7聚合体非依赖性相比( Inoue等人,2003年 ). 这种差异可能是由于狂犬病病毒株的差异、病毒基因组中糖蛋白的存在或所用试剂和方法的其他差异造成的。
虽然该系统的中等成功率足以恢复表达荧光蛋白的狂犬病病毒,但它们仍然相对低效。 此外,我们发现使用这些方法不可能恢复ChR2-mCherry病毒。 我们推断,由于回收效率可能取决于T7聚合酶和B19G的表达,因此在生产细胞中稳定表达这两种基因将是有帮助的。 因此,我们建立了同时表达T7 RNA聚合酶和狂犬病糖蛋白的新包装细胞。 在CMV启动子的控制下,表达T7 RNA聚合酶的BSR T7/5细胞被编码组蛋白2B标记的GFP和狂犬病糖蛋白B19G的HIV慢病毒感染。 感染细胞在其细胞核中表达GFP,使用FACS分类收集6.2%的总细胞作为GFP高+组分( 图S1A ). FACS分选的细胞表达T7 RNA聚合酶、B19G和GFP(以下简称“B7GG细胞”)。 图S1B ). 使用B7GG细胞,我们测试了提高ΔG狂犬病病毒恢复和扩增效率的各种参数:质粒浓度、转染试剂和培养条件。 35°C和3%CO条件下 2 条件下,与标准培养条件(37°C和5%CO)相比,B7GG细胞增殖减少,并在约1周内保持健康 2 ). 将携带GFP的狂犬病基因组质粒(pSADΔG-GFP-F2)和携带B19N、B19P、B19L和B19G的辅助质粒与脂质内酰胺2000在3%CO的湿空气中转染B7GG细胞 2 在35°C下,回收率为100%(在一组实验中检查了6个孔。在四组独立的实验中证实了结果的再现性。),显著高于第一个建立的方案(在37°C和5%CO下用磷酸钙法测定BSR T7/5细胞 2 条件; 37.4 ± 8.0 %; p<0.01, t吨 -测试)。 此外,通过新方案(在35°C和3%CO条件下,使用Lipofectamine 2000的B7GG细胞)恢复病毒的滴度 2 条件)比早期方案(在37°C和5%CO条件下用磷酸钙法测定BSR T7/5细胞)高出10倍以上 2 条件)。 因此,35°C和3%CO 2 转染和进一步扩增后,条件显著提高了恢复效率,允许高效恢复表达膜蛋白的病毒,如ChR2和AlstR(见下文)。
编码多个外源基因的糖蛋白缺失狂犬病病毒载体的构建
接下来,我们生产了表达各种荧光蛋白的ΔG狂犬病病毒,因为不同颜色的组合是必不可少的,例如,用于与表达GFP的小鼠系连接或用于联合注射不同病毒。 我们用红色荧光蛋白DsRed2(SADΔG-DsRed 2)mCherry替换狂犬病基因组中的B19G( 图1A (SADΔG-mCherry)、c-myc表位标记的mCherry-my(SAD△G-mCherly-myc)或蓝色荧光蛋白BFP( 图1B ,SADΔG-BFP)。 这些病毒从DNA中回收、扩增并通过超速离心浓缩。 这些病毒生长和浓缩的滴度与最初的SADΔG-GFP没有区别( 表1 ). 测试浓缩SADΔG-m樱桃 体内 通过向大鼠背侧膝状体(dLGN)注射( 图1A )或两种在皮层中间神经元(GIN)中表达GFP的GAD-GFP小鼠( Oliva等人,2000年 )英寸 图S2 一个 和G30( Lopez-Bendito等人,2004年 )英寸 图S2B ). 正如之前发表的使用SADΔG-GFP注射丘脑的研究所预期的那样( Larsen等人,2007年 )在存活3天后,已知投射到dLGN部位的皮层神经元受到感染,并被mCherry完全填充,从而可以清楚地显示详细的神经元形态,包括树突棘和轴突( 图1A ). 将SADΔG-mCherry注射到GAD-GFP小鼠系的dLGN中进一步证明,感染仅限于不投射到dLGN的皮层抑制性神经元,并且GFP中间神经元可以与狂犬病感染的初级视觉皮层中表达mCherry的皮质丘脑投射神经元明显区别(V1)( 图S2A,B ). 当我们向大鼠V1注射SADΔG-BFP时,V1第2/3层和第4层附近的神经元被BFP标记( 图1B ). SADΔG-mCherry-myc也观察到类似结果( 图S3 ).
图1。 编码多个基因的狂犬病病毒载体的生产。
(A,B)SADΔG-mCherry(A)和SAD△G-BFP(B)狂犬病病毒的产生。 (A) 将SADΔG-mCherry注射到dLGN后,观察到大鼠初级视皮层第6层的神经元。 (B) 大鼠视皮层2/3层和4层的神经元通过向附近的视皮层注射SADΔG-BFP进行标记。 比例尺,100μm。 (C) 每个开放阅读框都需要在狂犬病基因组的开放阅读框之前和之后插入转录起始和终止序列。 为了插入一个额外的外源基因,在GFP的最后一个密码子与其转录结束序列之间插入带有额外转录起始和终止序列(黑色,轮廓为红色)的mCherry,然后插入mCherri。 (D,E,F)感染SADΔG-GFP-mCherry的皮层切片培养中的神经元。 所有感染SADΔG-GFP-mCherry的神经元均表达mCherri(D,F)和GFP(E,F),表明这两种基因产物的转录调控和表达是可靠的。 比例尺,100μm。 (G) 为将一个或两个转硫基因高效导入狂犬病基因组而创建的质粒。 pSADΔG-F3狂犬病基因组载体有两个多克隆位点(MCS-1和MCS-2),用于插入感兴趣的基因。 对于狂犬病载体中单个基因的表达,使用MCS-1中的一个位点和MCS-2中的一种位点可以插入单个ORF并删除停止和启动转录盒。 为了克隆两个转基因,将每个基因插入MCS-1和MCS-2中,可以从狂犬病载体中实现可靠的共表达。
表。 1
姓名
基因1(大小)
Gene2(尺寸)
滴定
SADΔG-GFP
GFP(0.7 kb)
-------
5.8×10^8–7.5×10^9(RG)
8.8×10^7–6.2×10^8(环境)
SADΔG-m樱桃
m樱桃(0.7 kb)
-------
5.5×10^8–1.6×10^10(RG)
1.3×10^8-6.9×10^8(环境)
SADΔG-mCherry-myc
百万像素(1.0 kb)
------
1.5×10^8-5.6×10^8(RG)
SADΔG-DsRed2
DsRed2(0.7 kb)
-------
2.0×10^8-3.6×10^8(RG)
SADΔG-BFP
BFP(0.7 kb)
-------
1.8×10^8–3.7×10^9(RG)
SADΔG-GFP-m樱桃
GFP(0.7 kb)
m樱桃(0.7 kb)
5.7×10^5–8.7×10^6(RG,上清液)
SADΔG-GCaMP3
GCaMP3(1.4 kb)
-------
3.5×10^8-9.1×10^8(RG)
SADΔG-GCaMP3-DsRedX
GCaMP3(1.4 kb)
DsRedX(0.7 kb)
3.7×10^8-7.5×10^8(RG)
SADΔG-ChR2-m樱桃
沟视紫红质2米樱桃(1.6 kb)
-------
1.3×10^8–4.1×10^9(RG)
SADΔG-GFP-AlstR
GFP(0.7 kb)
Allotostatin受体(1.2 kb)
4.3×10^8–6.7×10^9(RG)
SADΔG-GFP-rtTA
GFP(0.7 kb)
实时传输速率(0.8 kb)
7.8×10^8–8.1×10^9(RG)
2.9×10^5–4.9×10*5(EnvA上清液)
SADΔG-GFP-ERT2核心
GFP(0.7 kb)
ERT2核心2(2.9 kb)
3.1×10^8-8.9×10^8(RG)
SADΔG-FLPo-DsRedX
FLPo(1.3 kb)
DsRedX(0.7 kb)
7.5×10^8–2.1×10^9(RG)
对于许多应用,重要的是能够用一个基因标记受感染的神经元,并表达第二个基因,例如控制细胞功能的基因。 这种策略通常比使用融合蛋白更可取,因为在融合蛋白中,标记蛋白的掺入可以阻止正常功能,或者在基因产物可能以膜室为靶点的情况下,细胞形态不容易可视化。 因为表达多个外源基因的G-缺失狂犬病病毒以前没有报道过,而且我们插入物的基因组位置与以前的“双基因”病毒不同( McGettigan等人,2003年 ; Ohara等人,2009年 ; Schnell等人,2000年 ),我们担心与转录调节或病毒能力相关的可能并发症可能会阻碍这两个基因的成功恢复和/或共表达。 因此,我们试图恢复编码两种不同荧光蛋白GFP和mCherry的ΔG狂犬病病毒。 这使得直接观察这两个基因是否可靠地共同表达。 通过将第二个基因导入SADΔG-GFP基因组中独立的开放阅读框,实现了双基因表达。 这些新基因与内源性转录控制元件一起被引入,以利用狂犬病病毒RNA-依赖性RNA聚合酶,确保分割单独的基因组转录物。 来自SAD-B19基因组中N和P编码序列之间的转录停止/启动信号( McGettigan等人,2003年 ; Ohara等人,2009年 ; Schnell等人,2000年 )将其置于mCherry ORF的上游,然后将其插入到GFP终止密码子和GFP转录终止信号之间的pcDNA-SADΔG-GFP中,以创建pcDNA-SADΔG-GFP-mCherry( 图1C ). 我们从质粒pcDNA-SADΔG-GFP-mCherry中回收表达GFP-和mCherry-的狂犬病病毒(SAD△G-GFP-m Cherry),然后在皮层切片培养中检测病毒。 GFP和mCherry表达模式证实狂犬病病毒在同一神经元中可靠且高水平地表达这两个基因( 图1D、E、F ). 因此,为了表达狂犬病基因组中的两个不同转基因,我们在后续需要表达多个基因的实验中使用了相同的转录停止/启动序列。 最后,我们设计了一种新的狂犬病基因组载体,有效地导入一个或两个基因(pSADΔG-F3)。 pSADΔG-F3有两个多克隆位点(MCS-1和MCS-2),位于狂犬病基因组中转录停止/启动序列盒的侧面( 图1G ).
用基因编码钙指示剂监测神经活动
基因编码的钙指示剂使神经科学家能够检测基因定义的神经元群体的功能( 罗等人,2008 ; 宫崎骏,2005 ; Tian等人,2009年 ). 为了便于将电路结构和功能联系起来的研究,我们制备了表达基因编码钙传感器GCaMP3的G缺失狂犬病病毒( Tian等人,2009年 ). 如上所述,对于表达荧光蛋白的病毒,我们产生了编码GCaMP3的两种新狂犬病病毒变体。 第一种病毒只表达GCaMP3而不是B19G(SADΔG-GCaMP2),而第二种病毒同时表达GCaP3和DsRedX(SAD△G-GCaMP 3-DsRedX)。 我们在35°C、3%CO条件下恢复并扩增了B7GG细胞中的SADΔG-GCaMP3和SAD△G-GCaMP3-DsRedX 2 条件,并将病毒集中用于 体内 注入。 同样,这些病毒的滴度与仅编码GFP的病毒无法区分( 表1 ). 为了测试SADΔG-GCaMP3是否有功能,我们立体定向注射了浓缩SAD△G-GCaMP3( 表1 )进入小鼠的V1,然后分析表达GCaMP3的V1神经元的视觉反应 体内 使用双光子成像。 补充图4A 显示了所选V1神经元的解剖重建 体内 感染后11天。 漂移光栅在8个方向上以45度方向步进随机排列。 在视觉刺激呈现期间,监测同一细胞内的荧光变化。 如所示 补充图4B和4C ,视觉刺激导致荧光的强烈增加,荧光的强度取决于光栅的取向。 (对首选方向的响应电影可用作 补充电影1 )。这些结果与使用钙指示剂染料俄勒冈州绿BAPTA(OGB)在小鼠V1中所描述的结果相似,但荧光的百分比变化比使用指示剂染料通常观察到的要大得多( Kerlin等人,2010年 ; 润扬等人,2010 ).
尽管SADΔG-GCaMP3被证明能有效监测受感染神经元的活动 体内 2光子成像低于随后尸检的预期(数据未显示)。 我们怀疑识别受感染神经元的困难 体内 正如预期的那样,荧光强度对基线钙水平的依赖性导致基线荧光相对暗淡( Kerlin等人,2010年 ; Kerr等人,2005年 ; Ohki等人,2005年 ; 润扬等人,2010 ). 因此,为了方便 体内 在随后的研究中,我们使用SADΔG-GCaMP3-DsRedX来鉴定感染神经元,并在随后基于GCaMP3的共同表达来表征功能反应之前,首先搜索DsRedX的表达。 此外,为了对连接到另一视觉皮层区域的已识别V1神经元子集进行功能表征,我们将SADΔG-GCaMP3-DsRedX注射到小鼠纹状体外皮层外侧区AL,并评估V1中逆行感染神经元的视觉反应。
将狂犬病病毒注射到急性淋巴细胞白血病中,随后识别V1并将双光子成像与逆行感染神经元的预期位置对齐,这通过内在信号成像来绘制V1的视网膜拓扑图( 图2A ) (( 卡拉茨基和斯特里克,2003年 ),请参阅方法以了解更多详细信息。)。 病毒感染9天后,使用血管模式在V1中选择一个位置,以向AL中的病毒注射位置提供输入( 图2A ). 对DsRedX检测敏感波长的双光子成像显示V1中有大片受感染神经元。 值得注意的是,在皮质软脑膜表面下一毫米多的深处,可以清楚地看到受感染的神经元( 图2B ; V1中SADΔG-GCaMP3-DsRedX感染神经元的堆叠电影可用作 补充电影3 .),比使用OGB成像通常可能的深度要深得多( Kerlin等人,2010年 ; Kerr等人,2005年 ; Ohki等人,2005年 ; 润扬等人,2010 ). GCaMP3在所有DsRedX阳性细胞和过程中也可见( 图2B ).
图2。 用表达GCaMP3的ΔG狂犬病病毒监测神经活动。
(A) 纹状体和纹状体外皮质区的视网膜异位组织。 内在成像的视网膜主题图覆盖在表面血管图像上。 V1和AL之间的边界位置是根据垂直丁二烯的代表性(鼻腔视野)确定的,以便将病毒注射靶向AL(红色X)。 将SADΔG-GCaMP3-DsRedX注射到小鼠纹状体外皮层外侧区AL,并将V1中相应的视网膜异位位置记录为逆行感染神经元的预期位置(红色方块)。 (B) SADΔG-GCaMP3-DsRedX感染神经元的Z堆叠可视化 体内 注射狂犬病9天后,V1双光子成像。 在从皮层表面延伸到1.5 mm深度的成像平面中可以看到AL投射的V1神经元细胞体和突起(C)SADΔG-GCaMP3-DsRedX感染的神经元在距离皮层表面370μm深度的双光子激光扫描图像的顶视图。 用SADΔG-GCaMP3-DsRedX逆行标记V1神经元,并共同表达GCaMP3(绿色)和DsRedX(红色)。 请注意,GCaMP3可以在树突和轴突以及细胞体中看到。 比例尺,25μm。 (D) SADΔG-GCaMP3-DsRedX感染V1神经元的定向选择性。 D1-D4中的面板对应于面板C中标记为1-4的神经元细胞体(D1-D2)或树突(D3-D4)。方向调谐曲线绘制为整个刺激期间细胞体(D1和D2)或树突状片段(D3和D4)荧光的平均变化, 响应于以随机顺序呈现在不同方向上的方波光栅。 (E) 荧光随时间变化,以响应优先方向上的漂移光栅。 时间0表示视觉刺激的开始,持续4秒,如黑条所示。 请注意,荧光是在与漂移光栅的时间频率相对应的时间频率上调制的。 这些与视觉刺激同步的时间调制也可以在补充电影中看到。 D和E中的值表示视觉刺激重复5次时ΔF/F值的平均值±S.E.M。
接下来,我们在Z轴上选择感兴趣的平面,用于GCaMP3荧光中视觉诱发功能变化的成像。 图2C 显示了距软脑膜表面370μm深度的解剖图像,而 图2D和2E 图示了选定细胞体或树突中GCaMP3对视觉刺激的荧光变化。 为了进行视觉刺激,方波光栅以随机顺序以30度的定向步长在12个方向上漂移。 受感染的V1神经元在特定光栅方向上GCaMP3荧光显著增强。 图示的两个神经元体具有方向选择性视觉反应( 图2D1和2D2 ; 一部电影,反映了对 图2D1 可用作 补充电影3 有趣的是,在GCaMP3标记的树突中也检测到了定向选择反应( 图2D3和2D4 ). 高表达水平和稀疏标记与GCaMP3的结合(与密集OGB标记相比)可能对确定不同神经元过程的视觉反应的能力做出重要贡献。
在皮层深处的神经元中可以观察到令人惊讶的清晰标记,这表明这些试剂可能也可以测量它们的视觉反应。 因此,我们在软脑膜表面以下520-535μm处选择了额外的成像平面,并分析了皮层深层标记神经元荧光变化的方向选择性( 补充图5A-5F ). 我们获得了GCaMP3荧光响应于首选方向的明显变化,与在较浅层中观察到的典型变化相比。 然而,与浅层不同,在已确定的神经元细胞体中可以观察到荧光变化,但在树突状突起中无法观察到。 这可能反映了树突相对于细胞体的荧光较弱,以及更深处成像信号较差。
为了证明狂犬病感染神经元的长期存活能力和视觉反应能力,在狂犬病首次注入AL后的第11天,即2天后再次对同一只动物进行成像。虽然我们没有尝试识别9天后成像的相同神经元, 我们再次确定了一个表达DsRedX的神经元区域,并根据GCaMP3荧光的变化监测了它们的视觉反应。 我们进行了与上述相同的一组实验,以在第9天获得定向选择性调谐曲线( 补充图5G-5L ). 在第11天,V1中的感染细胞在370μm深度处的GCaMP3标记的胞体和GCaMP3-标记的树突中显示出强烈的方向选择性荧光变化。
根据这些结果,我们得出结论,狂犬病病毒介导的GCaMP3的表达可以用于监测靶向神经元的活动,基于它们与更远神经元的连接。 可以监测荧光变化 体内 无论是胞体还是树突,深度大于500μm,病毒感染即使在感染后11天也不能阻止功能表征。
用编码ChR2或AlstR的G缺失狂犬病病毒控制神经活动
接下来,我们开发了狂犬病病毒变体,可以控制靶向神经元群体的神经活动。 为了实现快速、光控的神经元激活,我们使用了与mCherry融合的光激活离子通道ChR2( Boyden等人,2005年 ; Nagel等人,2003年 ). 我们在3%CO下在B7GG细胞中回收并扩增SADΔG-ChR2-mCherry 2 ,35°C条件下。 值得注意的是,SADΔG-ChR2-m樱桃很难用我们的原始恢复系统恢复,并且在更标准的培养条件下生长不好。 然而,使用优化的程序,它可以以与GFP表达病毒无法区分的滴度生长( 表1 ). 这种差异更可能与表达的基因产物有关,而不是与插入物的大小有关,因为在另一种膜蛋白(AlstR,见下文)中观察到了类似的困难,但在其他一些基因组更大的病毒中没有观察到类似的困难( 表1 ). 为了测试SADΔG-ChR2-mCherry的功能,将其注射到P9小鼠的S1皮层。 正如注射后6-10天,注射部位带有轴突终末的神经元感染所预期的那样,在邻近的桶状皮层以及投射到S1的其他结构中观察到大量受感染的神经元,如对侧S1皮层、M1皮层和丘脑核VPM。 我们对注射小鼠急性切片中的ChR2-mCherry阳性神经元进行荧光靶向全细胞记录,并用连接到光纤的蓝光发光二极管(LED)分析其对光激活的反应。 我们选择了标记相对稀疏的ChR2-mCherry阳性神经元的皮层脑片,以最小化大量神经元同时激活可能产生的网络效应。 我们在感染后6天、8天和10天的3个不同时间点记录了不同动物的切片。 尽管在所有时间点脑片中都可以清楚地看到大量的mCherry神经元,但感染后6天的功能激活比8天或10天弱( 图3A ). 图3A 显示了病毒注射后6、8和10天,位于S1病毒注射部位附近的代表性mCherry表达的锥体神经元的电流灯记录结果。 记录后,用贴片吸管中的生物细胞素填充神经元,用随后的链霉亲和素Cy2染色证实,记录的细胞表达来自狂犬病病毒基因组的mCherry( 图3B ). 我们发现,无论感染后的时间长短,5赫兹2毫秒的蓝光脉冲都会在每个ChR2-mCherry阳性细胞(n=14)中诱导去极化( 图3A ),正如之前对ChR2的表征所预期的那样( Boyden等人,2005年 ). 然而,在狂犬病感染后第6天,记录显示,使用这些光水平和脉冲持续时间的光诱导去极化电流低于所有取样神经元产生动作电位的阈值(n=5/5)。 然而,注射病毒后8-10天,同样的蓝光刺激总是在ChR2表达神经元中诱导动作电位(第8天n=5/5;第10天n=4/4)。 这些结果表明,狂犬病病毒介导的ChR2表达可对感染神经元进行可靠的光学控制,但早期的表达水平和/或膜定位可能较低,导致敏感性降低。
图3。 表达ΔG狂犬病病毒的ChR2-mCherry感染神经元的光激活。
(A) 蓝光脉冲在ChR2-mCherry表达神经元中产生动作电位。 在出生后9天的小鼠注射SADΔG-ChR2-m樱桃后6、8和10天,从S1桶皮层的第5层神经元进行细胞内记录。 在电流闪烁期间,第8天和第10天(而不是第6天)的5 Hz和2 ms持续时间的蓝光脉冲可靠地产生了动作电位。 (B) 记录的神经元充满生物细胞素并用链霉亲和素Cy2染色(绿色),mCherry呈阳性(红色)。 比例尺,30μm。
我们还生成了AlstR编码的ΔG狂犬病,以允许选择性和可逆的药物沉默神经活动( Lechner等人,2002年 ; Tan等人,2006年 ; Tan等人,2008年 ; Zhou等人,2009年 ). 哺乳动物神经元中AlstR的表达和配体allotostatin(AL)的应用导致G蛋白偶联内向整流钾通道的开放( Birgul等人,1999年 ),使神经元超极化并降低其输入电阻,从而抑制其产生动作电位的能力( Lechner等人,2002年 ). 为了可视化受感染的神经元并控制其活动,我们生成了编码GFP和AlstR的ΔG狂犬病(SADΔG-GFP-AlstR)。 我们在B7GG细胞中恢复并扩增SADΔG-GFP-AlstR,再次在35°C和3%CO条件下 2 尽管在标准培养条件下生长的病毒滴度略低于SADΔG-GFP,但在这些改良的培养条件下,这种病毒可以生长到高滴度,与其他G-缺失的狂犬病病毒无法区分( 表1 ). 将浓缩SADΔG-GFP-AlstR注射到P18小鼠S1皮层的桶状野。 在注射7天后,我们制备了注射小鼠的急性皮层切片,并将全细胞记录靶向GFP阳性神经元。 记录描述了SADΔG-GFP-AlstR感染神经元的膜电位、输入电阻和兴奋性。 以中的神经元为例 图4 在应用AL之前,静息膜电位为-56.1 mV,输入电阻为87.0 MΩ。通过注入一系列去极化电流脉冲,峰值逐渐增大,初始峰值小于+50 pA,确定峰值阈值( 图4A ). AL(1μM)的使用使膜电位降至−62.2 mV,输入电阻降至37.3 MΩ。 在AL存在的情况下,+50 pA的电流脉冲不再足以诱导动作电位,甚至+220 pA的脉冲仍然不足,这表明兴奋性大大降低( 图4B ). AL洗脱后30分钟,AlstR表达神经元的静息膜电位和输入电阻分别部分恢复到−59.8 mV和53.1 MΩ。 激发动作电位所需的去极化电流脉冲振幅为+150 pA,也表明部分恢复( 图4C ). 记录后,我们通过GFP和生物细胞素的联合标记(用链霉亲和素Cy3染色)确认记录的细胞感染了SADΔG-GFP-AlstR( 图4D ). 回收不完全可能是因为在冲洗期间未能从记录室中完全清除铝。 注射SADΔG-GFP-AlstR(n=2/2)后5天,观察AL的沉默作用。 然而,在注射后13-15天,感染细胞表现出相对去极化的静息膜电位(从−30 mV到−40mV),尽管细胞形态看起来完好无损(n=10/10)。 预计13-15天时细胞健康状况不佳,因为一些狂犬病感染细胞可能在此时间点被杀死( Wickersham等人,2007a ). 高水平膜蛋白(如AlstR)的表达也可能加剧这种影响。 这些结果表明,从狂犬病病毒中表达的AlstR是功能性的,所有结果都与之前进行的更严格的特征相一致( Lechner等人,2002年 ; Tan等人,2006年 ).
图4。 用表达AlstR的ΔG狂犬病病毒诱导Allatostatin沉默神经活动。
(A-C)注射SADΔG-GFP-AlstR后7天,从18天龄小鼠大脑皮层的脑薄片中的锥体神经元进行全细胞电流钳记录。 (A) 在应用allotostatin(AL)之前,对去极化电流脉冲(+50、+100、+150和+200 pA,750 ms持续时间)的典型反应轨迹表明,只要+50pA就可以产生多个动作电位。 (B) 1μM的配体AL使SADΔG-GFP-AlstR感染的神经元失活+ 在AL存在的情况下,200 pA电流不能再产生动作电位。(C)AL的作用被正常ACSF的AL洗脱部分逆转+ AL洗脱后150 pA诱导的动作电位。(D)记录的神经元以及相邻感染神经元的照片。 记录的神经元充满生物细胞素并用链霉亲和素Cy3染色(红色),SADΔG-GFP-AlstR衍生的GFP阳性(绿色)。 比例尺,30μm。
基因靶向单个突触后神经元基因表达的时间控制和跨突触病毒追踪
控制基因表达的遗传方法,如Cre-lox、FLP-frt和TetO/rtTA(Tet-On)系统,具有广泛而强大的应用。 我们设想在狂犬病病毒基因组中编码Cre重组酶、FLP重组酶或rtTA的大量应用。 这些包括:暂时控制病毒在多个突触步骤中的传播,以及与Cre和tTA应答鼠系或病毒载体的接口能力。 例如,在Brainbow小鼠中使用表达Cre的狂犬病( Livet等人,2007年 )可以标记单个神经元的输入( Marshel等人,2010年 ; Wickersham等人,2007b )突触前细胞每个细胞都有不同荧光蛋白组合表达的独特标记。 与条件性表达狂犬病糖蛋白的应答小鼠接触( Weible等人,2010年 )可能允许暂时控制ΔG狂犬病在多个突触步骤中的反复传播。 虽然我们没有在这里探索所有这些可能性,但我们描述了G缺失狂犬病病毒的发展,这些病毒表达允许控制基因表达的基因,证明这些病毒可以生长到高滴度,并且基因产物在狂犬病感染细胞中具有功能。
使用上述方法,我们制造了三种新的狂犬病病毒变体,每种变体都编码一种荧光标记基因和另一种用于控制基因表达的蛋白质。 其中包括反向tTA(rtTA)( Urlinger等人,2000年 )需要多西环素(dox)激活的他莫昔芬诱导的Cre重组酶(ER T2段 CreER公司 T2段 ) ( Matsuda和Cepko,2007年 ; Young等人,2008年 )和FLP-重组酶(FLPo)( 雷蒙德和索里亚诺,2007年 ; 朱和萨多夫斯基,1995年 )分别是。 由此产生的病毒被称为SADΔG-GFP-rtTA,SAD△G-GFP-ER T2段 CreER公司 T2段 和SADΔG-FLPo-DsRedX,并且所有都可以生长到高滴度( 表1 ).
为了说明SADΔG-GFP-rtTA在分析神经回路中的用途,我们证明了基因靶向神经元的dox-dependent跨突触传播。 以前我们建立了一种追踪方法,使用EnvA-假型SADΔG-GFP选择性标记突触前神经元到单个突触后神经元( Wickersham等人,2007b ). 利用该系统,ΔG狂犬病病毒的跨突触传播依赖于靶向突触后神经元中组成性表达的狂犬病糖蛋白的互补。 在这里,我们通过将狂犬病糖蛋白表达置于TetO启动子的控制下,并使用SADΔG-GFP-rtTA狂犬病病毒,证明了对病毒传播的条件和时间控制。 我们构建了一个条件表达核定位mCherry和狂犬病糖蛋白B19G的质粒,该糖蛋白由F2A自裂解元件和GSG连接子连接( Ryan和Drew,1994年 ; Szymczak等人,2004年 ),在TetO启动子(TetO-H2B-mCherry-2A狂犬病糖蛋白)的控制下( 图5 ). 在器官型皮质薄片培养物中,使用生物活性剂与pTetO-H2B-mCherry-2A狂犬病糖蛋白和另一个表达TVA的质粒共同转染神经元,TVA是包膜蛋白EnvA的同源受体,由CMV启动子驱动( Wickersham等人,2007b ). 然后,我们将EnvA-假型SADΔG-GFP-rtTA应用于转染切片培养物,无论是否存在四环素类似物(1.0μG/ml)dox。 正如先前研究所预期的那样( Wickersham等人,2007b )以及mCherry和狂犬病糖蛋白的dox和rtTA依赖性表达,在dox存在下,EnvA伪型病毒选择性感染TVA转染的神经元,随后表达mCherri和狂犬症糖蛋白, 这使得狂犬病病毒可以通过跨补体传播到附近的许多突触前神经元,突触前神经细胞表达狂犬病基因组中的GFP( 图5A ). 相反,在没有dox的情况下,狂犬病基因组中GFP的表达仅限于分离的神经元,这些神经元可能被转染并表达TVA,并且它们不表达mCherry( 图5B ). 这一结果证明了dox存在的必要性,以使最初感染的孤立神经元表达mCherry和狂犬病糖蛋白,这是相邻神经元跨突触标记所必需的。
图5。 多西环素依赖性基因表达和SADΔG-GFP-rtTA狂犬病病毒的条件性跨突触传播。
(A,B)在用pTetO-CMVmin-Histone2B-mCherry-F2A-B19G和pCMMP-TVA对大鼠皮层切片培养的分离神经元进行生物转染后,应用EnvA-假型SADΔG-GFP-rtTA导致转染神经元的选择性感染。 (A) 狂犬病病毒表达的dox和rtTA的存在允许mCherry在EnvA-SADΔG-GFP-rtTA感染的神经元中表达,如“突触后神经元”胞体的黄色(GFP和mCherri)外观所示。 狂犬病糖蛋白在同一突触后神经元中的表达允许ΔG狂犬病互补,因此病毒可以传播到许多突触前神经元并在其中表达GFP。 (B) 在没有dox(1.0μg/ml)的相同条件下,EnvA-SADΔg-GFP-rtTA狂犬病病毒也选择性感染分散的、孤立的TVA表达神经元。 但如果没有dox,则没有mCherry或狂犬病糖蛋白表达,因此狂犬病病毒没有互补或跨突触传播。 在没有dox的情况下,在脑切片中只能发现三个转染和最初感染的神经元(箭头所示的绿色细胞)。 比例尺,100μm(右图),50μm(左图)。
检测表达他莫昔芬诱导的Cre重组酶(SADΔG-GFP-ER)的狂犬病病毒 T2段 CreER公司 T2段 ),用表达loxP-STOP-loxP-DsRed盒(pCALNL-DsRed)的报告质粒转染HEK293t细胞,然后感染SADΔG-GFP-ER T2段 CreER公司 T2段 在4-羟基三苯氧胺(4-HOT)存在下,Cre重组pCALNL-DsRed,并观察到GFP和DsRed的共同表达。 然而,在没有三苯氧胺的情况下,只观察到GFP的表达。 这些结果表明,三苯氧胺控制病毒感染细胞中Cre依赖性重组( 图6A ).
图6。 ER介导的重组依赖性基因表达 T2段 CreER公司 T2段 或FLPoΔG狂犬病病毒。
(A) 使用可诱导Cre重组酶对基因表达进行时间调控。 SADΔG-GFP-ER T2段 CreER公司 T2段 激活转染pCALNL-DsRed(重组指示剂)的HEK293t细胞中DsRed的他莫昔芬依赖性表达。 顶部和底部面板分别显示了三苯氧胺(+4HOT,1 nM)存在和不存在的结果。 左侧面板显示狂犬病基因组中的GFP表达,中间面板显示4HOT存在时Cre诱导的DsRed表达(顶部),但不存在4HOT(底部); 以及右拼接的覆面。 比例尺,100μm。 (B) 病毒感染3天后,SADΔG-FLPo-DsRedX感染细胞在HEK293t细胞中表达红色荧光DsRedX。 比例尺,100μm。 (C,D)SADΔG-FLPo-DsRedX感染细胞中诱导的重组。 X-gal染色显示,稳定表达frt-STOP-frt LacZ盒(重组指示剂)的HeLa细胞在SADΔG-FLPo-DsRedX(C)存在时表达LacZ,但在SAD△G-FLPo-DsRedX不存在时不表达。 比例尺,300μm。
同样,我们使用HEK293t细胞和稳定表达frt-STOP-frt核定位LacZ盒的HeLa细胞检测SADΔG-FLPo-DsRedX狂犬病病毒。 SADΔG-FLPo-DsRedX感染的HEK293t细胞出现红色荧光( 图6B ). 只有狂犬病基因组中表达FLPo的细胞才能切除前侧翼的STOP信号并激活构成性LacZ表达。 X-gal染色显示SADΔG-FLPo-DsRedX病毒在HeLa细胞中引起重组和LacZ表达( 图6C )而在没有表达FLPo的病毒的情况下未检测到LacZ表达( 图6D ). 这些观察结果表明狂犬病病毒FLPo的功能重组。
讨论
我们描述了一组适合产生SADΔG狂犬病病毒新的转基因变体的DNA质粒的开发。 我们使用这些试剂生成了十二种新的SADΔG狂犬病病毒变体,这些变体表达了广泛实用的转基因。 其中包括表达来自同一狂犬病基因组的两个外源基因的ΔG狂犬病病毒变体,以及将狂犬病标记与监测或操纵神经元活动相结合的病毒,最后是表达基因的新变体,以控制受感染神经元内的基因表达。 此外,我们已经证明了这些病毒的效用,可以直接将连接与完整大脑中的功能联系起来,还可以操纵活细胞中的活动或控制基因表达。 这些新变体现在可以无限期传播,并可供使用。 这些工具有望成为研究神经回路的越来越多的遗传工具的重要组成部分( 罗等人,2008 )并为电路研究开辟了新途径,使神经元连接可以直接与电路功能相关。
G-缺失狂犬病病毒的优势和局限性
最近发表的许多研究都证明了G-缺失狂犬病病毒在高分辨率追踪神经回路方面的巨大优势。 例如:为了进行详细的解剖学研究,有可能逆行感染神经元并高水平表达荧光蛋白( Larsen等人,2007年 ; Nassi和Callaway,2007年 ; Wickersham等人,2007a ); 识别与特定类型投射神经元直接相关的突触前神经元( Stepien等人,2010年 ; Yonehara等人,2011年 ); 识别对特定基因定义的细胞类型具有突触前直接作用的神经元( Haubensak等人,2010年 ; Miyamichi等人,2011年 ; Wall等人,2010年 ); 并识别直接突触前神经元到单个功能上具有特征的神经元( Marshel等人,2010年 ; Rancz等人,2011年 ).
所有这些研究都追踪到了联系 体内 这表明它们可以与成像或操纵完整神经系统中活神经元的方法相结合,正如我们在这里所演示的那样。 这些病毒在此类研究中的效用取决于G缺失狂犬病病毒感染细胞的能力,以及在不杀死细胞的情况下驱动高水平病毒基因表达的能力。 此前已有研究表明,感染7天后,受感染神经元的基本特性不会因感染而改变,但许多神经元在感染后14天左右就会死亡( Wickersham等人,2007a ). 我们在这里已经表明,当对感染的神经元进行功能研究是可行的时,在感染后大约5到11天之间存在一个工作时间窗口。 然而,对于使用者来说,考虑狂犬病感染的可能有害影响是很重要的,这种影响可能是任何可能使用的实验条件所特有的。 例如,狂犬病病毒感染会降低受感染细胞的基因表达( Weible等人,2010年 )我们对表达AlstR狂犬病病毒的实验表明,在感染后13-15天,活神经元显示出改变的生理特性。 因此,对这些试剂的潜在使用者来说,检测和控制狂犬病病毒感染的任何不良影响至关重要。 尽管存在这些局限性,但狂犬病病毒是我们所知的唯一一种嗜神经病毒,在这种病毒中,将连通性与功能在一个时间窗口内直接联系起来的研究可能长达6天,因为其他病毒如HSV和PRV会更快地杀死神经元( Brittle等人,2004年 ; Card and Enquist,2001年 ).
考虑高水平转基因表达的可能影响也很重要。 在许多实验中,狂犬病病毒获得的高水平基因表达,相对于复制能力不足的病毒(例如( Wickersham等人,2007a ))优点:GFP高水平表达可以进行详细的解剖重建( Larsen等人,2007年 ; Nassi和Callaway,2007年 ); ChR2必须以高水平表达,以进行活动的光遗传控制( 图3 ); 高水平的荧光蛋白可能有助于活脑组织深层神经元的双光子成像( 图2B ). 虽然一些转基因在高表达水平下具有毒性,但成功培育出表达GFP、mCherry、GCaMP、ChR2、AlstR、rtTA、tTA、Cre或FLP的转基因和敲除动物( Arenkiel等人,2007年 ; Diez-Garcia等人,2007年 ; Gosgnach等人,2006年 ; Hippenmeyer等人,2005年 ; Tsien等人,1996年 )表明这些基因的适度表达在长时间内是可以耐受的。 因此,用户必须考虑ΔG狂犬病病毒高水平转基因表达的可能影响,然而,长期的影响可能是无意义的,因为病毒可能会在这些问题发生之前杀死感兴趣的神经元。 如果在狂犬病病毒感染的神经元存活的有限时间内,特别有毒的基因产物的高水平表达是一个问题,那么在rtTA的控制下,可能可以从效率较低的方法(例如在转基因动物中)来驱动转基因表达, 狂犬病基因组表达的Cre-ER或FLPo(例如。 图5 ).
我们在这里描述的新型狂犬病变体的效用还取决于它们与表达GFP或mCherry的特征更好的ΔG狂犬病病毒相似的程度。 例如,有效感染是一个重要特征,可能主要取决于这些病毒生长和纯化的滴度。 我们观察到,表达ChR2和AlstR的ΔG狂犬病病毒比表达GFP的病毒更难生长,但使用改良的培养条件,它们可以在与表达GFP病毒无法区分的高滴度下生长( 表1 ). 在我们测试的有限插入大小范围内,对病毒滴度没有一致的关系或明显的影响( 表1 ). 例如,我们回收的最大基因组是SADΔG-GFP-ER T2段 CreER公司 T2段 ,包括GFP(0.7kb)和ER T2段 CreER公司 T2段 (3.4 kb)以及四个天然病毒基因(N、P、M和L),总计13.6 kb,比天然SAD-B19基因组11.9Kb大1.7 kb( Conzelmann等人,1990年 ). 恢复后,该狂犬病病毒的扩增效率与SADΔG-GFP狂犬病毒(10.2 kb基因组)一样高。 虽然在我们手中,无论是表达的转基因还是病毒基因组的大小都无法阻止高滴度ΔG狂犬病病毒的产生,但这些病毒的实用性很可能取决于培育者的技能和护理,以及对我们制定的既定方案的认真遵守。
将连接性与功能联系起来
系统神经科学的主要目标之一是了解神经电路的结构和功能。 了解神经回路的功能需要解决组件的连接问题,将组件的功能与其连接联系起来,操纵选定组件的活动,监测网络中其他组件的活动,并最终评估行为结果。 然而,实现这些目标的技术是有限的。 我们在这里描述的狂犬病工具提供了许多新的机会,可以将基于狂犬病病毒的回路追踪与功能研究相结合。
例如,钙传感器GCaMP3在因与特定细胞类型或单个神经元的连接而感染的神经元中的表达,可以观察到单个活制剂中连接和功能之间的直接相关性。 在这里,我们通过将逆行感染与表达GCaMP3的ΔG狂犬病病毒和 体内 视觉反应的双光子成像。 这允许测量根据与AL区的连接选择的特定小鼠V1神经元子集的视觉感受野。
同样,ChR2和AlstR的表达应允许控制神经活动 在体外 和 体内 为了便于测试定义的神经电路中连通性和功能之间的因果关系。 还可以通过细胞内记录结合狂犬病基因组中表达ChR2的神经元轴突的光激活,测试连接性靶向狂犬病病毒感染神经元的可能突触后靶点与潜在突触后神经元的功能连接( Petreanu等人,2007年 ).
用GCaMP3-ΔG狂犬病、ChR2-ΔG和AlstR-ΔG在特定细胞类型或单细胞逆行感染中靶向感染和跨突触标记( Stepien等人,2010年 ; Wickersham等人,2007a ; Wickersham等人,2007b ; Yonehara等人,2011年 )、Cre依赖的TVA转导( Haubensak等人,2010年 ; Wall等人,2010年 ),与TVB桥接蛋白质( Choi等人,2010年 )或TVA的单细胞电穿孔( Marshel等人,2010年 ; Rancz等人,2011年 )对于已识别的神经电路的功能研究非常有用。 特别是,通过利用越来越多的针对特定细胞类型的Cre表达小鼠系(GENSAT和艾伦脑科学研究所提供了驱动系),将有一个前所未有的机会来揭示小鼠特定细胞类型详细的连接性和功能( Madisen等人,2010年 ; Wall等人,2010年 ).
最后,狂犬病基因组中三苯氧胺诱导的Cre、FLPo或rtTA的表达将允许转基因的有条件表达,例如转录因子。 特别是,将ΔG狂犬病病毒与越来越多以Cre、FLPo或tTA依赖方式表达狂犬病糖蛋白的小鼠株和病毒载体结合( Weible等人,2010年 )可能允许通过给药他莫昔芬或多西环素在多个突触步骤中进行时间控制追踪。 总之,我们开发的新试剂有望通过允许神经元连接与功能直接相关来促进神经系统功能的未来研究。
方法摘要
G-缺失型狂犬病病毒的产生
纯化SADΔG-GFP狂犬病病毒基因组RNA并进行逆转录,获得狂犬病基因组的部分cDNA片段。 用PCR方法克隆了狂犬病核衣壳(pcDNA-SADB19N)、狂犬病病毒RNA聚合酶(pcDNA-SADB19P和pcDNA-SADB19L)或狂犬病糖蛋白(pcDN-ASADB19G)。 为了构建狂犬病病毒基因组cDNA,在pcDNA3.1中连接了几条狂犬病基因组cDNA并与HamRz和HdvRz侧翼连接,形成pcDNA-SADΔG-GFP。 为了在狂犬病基因组中建立双基因表达系统,合成并克隆了转录停止序列和启动序列以及6个独特的限制性内切酶位点,以产生pSADΔG-F3。
为了回收ΔG狂犬病病毒,将狂犬病基因组pSADΔG载体、pcDNA-SADB19N、pcDNA-SADB19P、pcDNA SADB19L和pcDNA-SADB19G转染B7GG细胞,并将其保存在3%CO的湿润环境中 2 温度为35°C。 为了用EnvA进行假分型,用未假分型的SADΔG狂犬病病毒感染BHK-EnvA细胞,用PBS洗涤,用0.25%胰蛋白酶-EDTA反应,并在新的培养皿上重新接种。 对于 体内 注射用ΔG狂犬病病毒在10%、15cm的培养皿中,在3%CO的湿化环境中扩增 2 在35°C下,用0.45μm过滤器过滤,并通过两轮超速离心浓缩。 分别用HEK293t细胞和HEK293-TVA细胞滴定未伪型狂犬病病毒和EnvA-伪型狂犬病毒。 病毒的滴度和转基因大小如所示 表1 .
狂犬病病毒变异的特征
将ΔG狂犬病病毒注射到小鼠或大鼠的LGN、V1、AL或S1中。 在成年小鼠V1和AL中分别注射SADΔG-GCaMP3和SAD△G-GCaMP 3-DsRedX。 使用双光子显微镜对V1中的GCaMP3信号进行成像。 使用向不同方向移动的漂移方波光栅分析视觉感受野。 将SADΔG-ChR2-mCherry和SAD△G-GFP-AlstR分别注射到出生后第8天和第18天的小鼠大脑皮层。 在脑切片上进行感染神经元的全细胞记录。 对于ChR2表达神经元的光刺激,蓝色LED以0.2-5Hz的频率发出光刺激。 对于AlstR表达神经元的失活,肽配体AL(Ser-Arg-Pro-Tyr-Ser-Phe-Gly-Leu-NH 2 )通过灌注应用。
用器官型脑片培养检测SADΔG-GFP-rtTA。 在对pCMMP-TVA800和pTetO-CMVmin-Histone2B-mCherry-F2A-B19G进行生物转染后,用EnvA-SADΔG-GFP-rtTA感染切片,并在没有或存在dox(1.0μG/ml)的情况下保持。 用于测试SADΔG-GFP-ER T2段 CreER公司 T2段 用Cre依赖性质粒pCALNL-DsRed转染HEK293t细胞,感染狂犬病病毒,并在没有或存在4-HOT(1.0μM)的情况下保持。 为了测试SADΔG-FLPo-DsRedX,稳定表达frt-STOP-frt核定位LacZ盒的HeLa细胞感染病毒,然后进行X-gal染色。
亮点。
新方法允许从质粒DNA高效生产ΔG狂犬病病毒
12种新狂犬病变体表达有用的基因编码神经科学工具
编码基因监测或控制定义电路中的活性或基因表达
这些试剂有助于将电路结构与功能直接联系起来的研究
致谢
我们感谢I.Wickersham和J.Choi的有益讨论,感谢K.Roby、M.De La Parra和K.von Bochmann的技术援助,感谢Callaway实验室的成员鼓励讨论,感谢K·Conzelmann的BSR T7/5细胞系,感谢O.Britz和M.Goulding的HeLa细胞表达frt-STOP-frt-nLacZ,I。 Verma用于HIV慢病毒包装质粒,X.Wu用于pNLST7,R.Tsien用于mCherry质粒,K.Deisseroth用于ChR2-mCherri质粒,L.Looger用于GCaMP3质粒,C.Cepko用于pCAG-ER T2段 CreER公司 T2段 和pCALNL-DsRed。 F.O.感谢大坂北彦不断的鼓励和支持。 我们感谢美国国立卫生研究院(MH063912、NS069464和EY010742:E.M.C.)、加州大学圣地亚哥分校卡夫利脑与思维研究所(E.M.C, 和奈托基金会(F.O.)。
脚注
出版商免责声明: 这是一份未经编辑的手稿的PDF文件,已被接受出版。 作为对客户的服务,我们正在提供这份早期版本的手稿。 手稿在以最终可引用的形式出版之前,将经过编辑、排版和校对结果证明。请注意,在制作过程中可能会发现可能影响内容的错误,适用于该期刊的所有法律免责声明均适用。
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