BCL-2家族蛋白“仅BH3结构域”亚群的成员将近端死亡信号与核心凋亡途径连接(1–5). 激活CD95(Fas)或TNFR1死亡受体后,BID被裂解并激活为p15 tBID(6–8)在使用纯化线粒体的模型系统中,它作为死亡配体,诱导BAK齐聚(9)和BAX(10). tBID不会导致纯化的细胞色素c释放贝克-线粒体缺陷,表明tBID和BAK的相互作用至少在体外是一个关键事件(9).
在这里,我们通过使用逆转录病毒载体在小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)中表达tBID来评估BAK是否是tBID诱导完整细胞凋亡所必需的。在贝克-tBID表达载体感染24小时后出现缺陷型和野生型MEF(图1A),但不使用空矢量(pMIG)(11)只表达绿色荧光蛋白(GFP)。另一个“多结构域”促凋亡BCL-2成员BAX缺陷的MEFs也被杀死。相反,Bax、Bak通过多种标记物(包括Annexin-V染色)评估,双缺陷MEF对tBID诱导的细胞死亡具有完全抵抗力(图1C)和细胞形态(图1A). 感染细胞可通过GFP的表达进行鉴定(图1B)并通过控制pMIG病毒在所有遗传背景下的感染率显示出类似的感染率(图1D). 对tBID感染的MEF中GFP表达的分析显示,野生型凋亡细胞中存在少量GFP,Bax公司−/−、和贝克−/−MEF公司(图1D). 相反,将tBID矢量引入Bax、Bak双敲除(DKO)MEF显示形态正常的细胞表达高水平的GFP(图1、B和D). 猿猴病毒40(SV40)转化的野生型和DKO基因型MEF细胞系也分别对tBID敏感和耐药(12). 蛋白免疫分析证实p15 BID在DKO MEF中表达,在凋亡的野生型MEF中少量表达(图1E). 在野生型和DKO MEF中,p15 BID定位于线粒体,作为一种完整的膜蛋白(12)表明尽管tBID表达并靶向线粒体,但它并没有杀死DKO MEF。仅BAX的再表达不足以杀死DKO MEF,但确实恢复了tBID的杀伤作用,证实tBID需要一个多域促凋亡成员来诱导凋亡(图1C).
解释这些观察结果的一个机制是,如果tBID诱导BAX和BAK的激活,导致线粒体功能障碍,包括细胞色素c的释放。我们测试了BAX和BAK的激活状态以及细胞色素c在表达tBID的初级MEF中的细胞内分布。用化学交联剂双马来酰亚胺基己烷(BMH)处理来自对照组和表达p15 BID的初级MEF的线粒体,以检查BAK齐聚状态。正如我们在肝细胞中观察到的那样(9)在表达p15 BID的细胞中,对照细胞中迁移速度较快的非活性BAK构象消失,交联BAK多聚体的数量相应增加,这与二聚体和三聚体的形成一致(图2A). 该过程似乎与BAX无关,因为p15 BID导致BAK在Bax公司−/−MEF公司(图2A). 野生型MEF中p15 BID的表达导致细胞溶质BAX作为完整的线粒体膜蛋白移位和插入(12)与BAX在Fas活化肝细胞中的作用一样(图3B). 在GFP阳性、表达tBID的DKO MEF中,细胞色素c保持点状线粒体模式,但在表达tBID-的野生型MEF中细胞色素c重新分布为弥散的细胞溶质模式(图2B). 因此,促凋亡BAX、BAK或两者的激活是tBID诱导细胞色素c在体内释放所必需的。我们测试了钡/钡通过向MEF细胞质中微量注射细胞色素c,缺失细胞在线粒体下游有完整的凋亡途径。微量注射细胞色素c后,DKO和野生型MEF显示出相似的细胞死亡(图2C)表明细胞色素c下游的凋亡途径释放(13)不依赖于BAX或BAK的功能。
为了检测细胞原位死亡是否需要BAK或BAX分子,我们评估了注射Fas激动性抗体的小鼠肝脏的凋亡。贝克-缺乏Fas的小鼠易受Fas诱导的肝细胞凋亡和出血性坏死的影响(图3A和表1)死亡时间与野生型或杂合子同卵对照相似。这与对Fas的抗性形成对比投标-缺陷小鼠(14). 体内通过Fas激活的肝细胞亚细胞分馏显示,BAX在体内从胞浆转运到线粒体贝克-有缺陷,但不是投标-缺陷小鼠(图3B).Bax公司-缺陷小鼠也死于Fas诱导的肝细胞凋亡(图3A和表1). 因此,BID似乎在肝细胞和MEF中的BAX和BAK的上游发挥作用。
表1。
缺乏药物的小鼠的敏感性Bax、Bak或两者都与抗Fas注射有关。小鼠每克体重静脉注射0.5微克Fas(Jo2,Pharmingen)单克隆抗体,并在垂死或观察24小时后处死。死亡小鼠的平均生存时间为小时±1 SD。
基因型 |
死亡/ 注入 |
平均存活率 (小时) |
贝克−/−
|
9/13 |
5.2 ± 1.7 |
贝克+/−或+/+
|
9/14 |
6.0 ± 2.7 |
Bax公司−/−
|
7/10 |
3.8 ± 1.2 |
Bax公司+/−或+/+
|
13/13 |
2.6 ± 1.9 |
Bax公司−/−,贝克−/−
|
0/3 |
(9小时后死亡) |
接下来,我们测试了BAX和BAK的消除是否会对Fas诱导的肝细胞凋亡产生抵抗。绝大多数Bax、BakDKO小鼠在出生前后死亡,只有一小部分存活到成年(15). 我们给三只可用的DKO小鼠注射Fas抗体,所有这些小鼠均存活9小时,然后将其处死并检查其肝脏(表1). DKO小鼠肝细胞最多出现中度凋亡,部分动物无凋亡(图3A). 受影响的DKO肝细胞的免疫组织化学特征仅限于Caspase-3活化的局部区域,而不释放细胞色素c(图3C),与中看到的类似投标−/−肝细胞(14). 这些关于有限数量的DKO小鼠的数据与单一缺陷小鼠的数据进行了对比,表明BID依赖性凋亡也在肝细胞中使用BAX或BAK。这表明,当原位激活时,“外源性”(死亡受体)途径也可能依赖于选定细胞类型中的“多结构域”促凋亡蛋白(14,16).
接下来,我们研究了在其他刺激导致线粒体释放细胞色素c后,BAX、BAK或两者是否都是死亡所必需的(17–21). 野生型,Bax公司−/−、和贝克−/−MEF易感,而DKO MEF对staurosporine(激酶抑制剂)、etoposide(拓扑异构酶II抑制剂)和紫外线辐射(UVC)具有耐药性,即使在非常高的剂量下(图4,A到D). 时间进程研究和剂量反应评估表明,DKO MEF对这些刺激有明显的抵抗力,通过核小体DNA片段评估表明长期存活(图4A),染料排除(图4D)或Annexin-V染色(图4E). 此外,DKO MEF,但不是单一缺陷的MEF,被证明对来自内质网(ER)的应激信号具有抵抗力(22–24)由thapsigargin诱导(抑制Ca2+腺苷三磷酸酶泵)、衣霉素(抑制N-连接糖基化)(图4B)或brefeldin A(抑制ER-Golgi转运)(12). 进一步的评估表明,DKO细胞中的线粒体后事件被阻止,包括在所有这些刺激后效应胱天蛋白酶活性的激活(图4C). DKO MEF对血清(生长因子)缺乏引起的细胞死亡也有抵抗力(图4F). 相反,投标−/−细胞对所有这些信号都敏感(图4,A和B),表明他们不依赖BID,并且BID不是BAX或BAK的唯一激活器。DKO MEF易受肿瘤坏死因子α(TNF-α)和放线菌素D的外源信号的影响,在这种细胞类型中,放线菌肽D诱导线粒体非依赖性caspase级联反应(图4,A和C).
抗凋亡或促凋亡BCL-2成员是否发挥主导作用还存在很大的不确定性。我们的研究表明,在体内,完整的细胞需要一个多域促凋亡成员来响应不同的死亡信号。tBID必须激活BAX或BAK,以启动肝细胞和MEF中的线粒体功能障碍和细胞死亡。可以想象,在其他组织中,这种功能可能由其他促凋亡多域家族成员发挥,如BOK(25). BAX或BAK的活化和齐聚被认为可以形成同聚孔(9,26),形成依赖电压的阴离子通道-包含孔隙(27),或线粒体膜透化(28)启动细胞色素c的释放。细胞色素c的释放激活Apaf-1–Caspase-9凋亡小体和下游效应Caspase(13)细胞色素c大量丢失后,进行性caspase非依赖性线粒体功能障碍可导致细胞死亡(29). 线粒体下游的细胞色素c或Caspase-9和Apaf-1基因敲除表明,staurosporine、etoposide和辐射的损伤取决于线粒体释放细胞色素c所介导的信号(17–21). 这个Bax、Bak-紧靠线粒体上游的缺陷细胞似乎能更好地抵御这些药物。即使内质网应激诱导的凋亡也需要BAX或BAK,这可能反映了BAX或BAK在内质网部位的作用不明确(30,31)或ER通路对线粒体的最终依赖(32). BAX和BAK的其他上游激活剂明显存在,如投标-缺乏BAX和BAK的细胞往往容易受到无法杀死它们的刺激。我们的功能丧失研究表明,在包括质膜、细胞核和内质网在内的多个部位启动看似无关的信号后,凋亡前BAX和BAK分子的缺失会造成严重的阻滞,保护线粒体并抑制凋亡。
参考文献和注释
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34原代鼠胚胎成纤维细胞由Bax公司+/−;贝克+/−或Bax公司+/−;贝克−/−怀孕后13.5天定时交配。通过转染含有SV40基因组DNA的质粒使原代MEF永生化。将初级MEF置于六孔板中,并根据制造商的说明,使用Fugene(Roche)转染1µg总DNA。通过连续稀释产生稳定的永生克隆。
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35细胞固定在3%多聚甲醛中,并在1%牛血清白蛋白和0.1%Triton X-100中渗透。将细胞与细胞色素c的一级抗体(克隆6H2.B4,Pharmingen)和小鼠的Cy3-共轭山羊二级抗体(Jackson Immunoresearch Laboratories)和Hoechst 33258(Molecular Probes)依次孵育,然后将其安装在盖玻片下N个-没食子酸丙酯。使用安装在尼康Eclipse E600上的SPOT摄像机(诊断)和PlanFluor物镜或奥林巴斯IX50显微镜采集图像。
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36我们感谢E.Smith的图形和手稿准备工作,感谢B.Avery和S.Wade的畜牧业工作,感谢C.Gramm的技术援助,感谢C.Beard的逆转录病毒援助,感谢P.Tegtmeyer的SV40表达载体,感谢W.Sellers使用微注射器。M.C.W.部分由NIH培训拨款5T32AT09361支持。W.-X.Z.由癌症研究所的博士后资助。这项工作得到了NIH拨款R01CA50239和R37CA48023的部分支持。