介绍
二维(2D)单层细胞培养代表了上皮细胞和上皮癌的高度还原模型,因为人工塑料表面上的生理细胞外基质(ECM)丢失,并且血清浓度较高。 因此,细胞失去了相关特性,如分化、极化、细胞间通讯和细胞外基质接触,而伤口愈合、炎症过程和过度增殖则被人为促进。 在前列腺癌(PrCa)细胞系的单层培养中,未分化肿瘤干细胞通过基底细胞、瞬时扩增细胞和终末分化的激素敏感性腔细胞的稳态取决于细胞培养条件、钙和血清浓度 [1] , [2] 在体内仅能很好地代表肿瘤细胞生物学。 缺乏相关的基底层(BL)、ECM沉积缺陷以及基质或肌上皮成分缺失 [3] 进一步促进了人工自然。 因此,单层培养中最有效的小分子抑制剂是针对增殖和有丝分裂的化疗药物。 这种不平衡导致了复方疗效在 在体外 和 体内 实验。 与细胞间相互作用、成熟、上皮-间充质转化(EMT)和肿瘤干细胞(CSC)有关的药物作用可能无法检测到。 3D架构和ECM都对药物疗效有很大影响 [4] 腺上皮癌细胞迅速适应不同的微环境,并能在调节增殖、分化和生存的替代途径之间动态切换。
耐药或化疗药物无效的发展也需要适当的细胞培养模型。 耐药性通常归因于肿瘤干细胞(CSC)假说:抗有丝分裂癌药物可以避免缓慢增殖的肿瘤再生干细胞或祖细胞 [5] – [7] ,最终重新构成肿瘤肿块。这可能伴随EMT [7] – [10] 增加了转移潜能 [8] 因此,抗癌药物的研究进入了一个新阶段,研究人员越来越多地利用器官型模型系统来更直接地探索多细胞类有机物的药物靶点,这些有机物通常富含干细胞 [11] .适当 在体外 适用于CSC稳态、EMT、侵袭和转移分析的实验模型正日益与癌症药物研发相关。 这些还应具有成本效益,并为高内容筛选提供足够的吞吐量。
20多年前,在纯化的ECM(如胶原蛋白、水凝胶或Matrigel)中培养腺上皮(癌)细胞 [12] Matrigel代表一种重组的富含层粘连蛋白的基底膜,支持诸如细胞极性、细胞间和细胞-基质相互作用以及分化标记的重新表达等过程,即使在转化系中也是如此 [13] 乳腺和前列腺上皮细胞形成球形,称为乳腺球 [14] 或前列腺素 [15] 分别是。 正常前列腺上皮细胞分化为极化良好的空心球体,这是功能性腺上皮细胞的标志。 相同的微环境也支持细胞迁移、分支和形成特征性腺泡 [16] , [17] 相反,肿瘤细胞通常表现出有缺陷的分化程序,并形成结构紊乱的非典型球体,这在乳腺癌中最为明显 [18] – [20] 球体的基因表达模式被证明与3D培养物中形成的特征表型相关 [19] , [20] 癌症的整体分化和侵袭潜能 [21] , [22] 与正常上皮细胞类似,PrCa细胞也可以主动侵入周围的基质凝胶,尽管它们的迁移模式不同于正常细胞分支中观察到的正常、集体片状或管状迁移模式。 癌症侵袭的表型取决于ECM的组成和密度,可能有变形虫起泡、间充质成纤维细胞样运动和多细胞流或链迁移 [23] , [24] 自然,侵袭潜能还取决于PrCa细胞的遗传背景及其(通常受损)参与严格上皮细胞-细胞接触的能力。 乳腺癌和其他上皮癌细胞形成圆柱形纺锤状细胞,具有收缩和伸长的潜能,支持通过周围ECM网的迁移。 关于PrCa的了解要少得多。 侵袭由蛋白水解过程和蛋白酶(如组织蛋白酶)辅助 [25] 、基质金属蛋白酶(MMPs [24] )成纤维细胞分泌的可溶性因子或成纤维细胞自身的存在 [26] , [27] 以及其他因素,如纤维连接蛋白和赖氨酰氧化酶 [26] 在这方面,肿瘤细胞侵袭的3D模型 [28] 与细胞在塑料表面扩散和滑动的二维单层培养相比,它更能代表肿瘤的细胞动力学和结构。 接受EMT和获得间充质迁移模式的可能性是另一个被假设为有助于乳腺和PrCa侵袭和运动的参数 [29] .
此外,尚不清楚PrCa球状体,尤其是在lrECM中生长时,是否显示CSC种群的富集(通常与EMT有关),或对化疗药物和电离辐射产生耐药性 [30] , [31] 至少,与漂浮的前列腺增生和2D单层条件相比,CSC或EMT的参与有望在LrECM中分化3D培养物时显示出非常不同的动力学 [32] 最后,肿瘤细胞侵袭的细胞培养模型目前仅限于一些广泛使用的潜在人工分析(跨孔侵袭分析;擦伤迁移分析)。 由于入侵在3D条件下有着本质上的不同,任何具有代表性的3D入侵模型都代表了真正的新颖性[26、28和33]。
我们在这里报道了利用29个前列腺细胞系组成的小组开发微型3D细胞培养模型系统及其形态学特征。 然后,通过全基因组转录组分析和系统生物学对选择的最具代表性的株系进行进一步表征,以确定对恶性PrCa细胞生长和侵袭至关重要的关键途径、信号分子、基因网络和假定药物靶点。 此外,还开发了生物信息图像分析工具,用于量化动态表型特征,如侵袭性结构、球体形状或药物反应。
材料和方法
细胞系和单层培养
细胞系从ATCC购买或向原始实验室索取( 表S1 ). 正常上皮细胞和衍生物(PrEC、EP156T、RWPE-1、RWPE2、RWPE_2/w99、WPE1-NB14、PWR-1E、PZ-HPV-7和CA-HPV-10)在无角质形成细胞血清培养基(KSFM、Gibco)中培养,补充12.5 mg/l牛垂体提取物和1.25µg/l EGF。 对于3D培养,添加2%胎牛血清(FBS,Gibco)。 大多数PrCa系在补充有10%FBS的RPMI-1640(Sigma-Aldrich)中培养。MDA-PCa-2b和NCI-H660细胞在含有20%FBS、25ng/ml霍乱毒素、10ng/ml EGF、5µM磷酸乙醇胺、0.1ng/ml氢化可的松、45nM亚硒酸和5µg/ml胰岛素(均来自Sigma)的Ham’s F12培养基(Gibco)中培养。 所有细胞在37°C的标准细胞培养条件(5%CO2,95%湿度)下繁殖。 在10–15代细胞停止传代后,通过安捷伦244k人类基因组阵列上的arrayCGH(比较基因组杂交)确认细胞系的身份。
微型3D文化
细胞嵌入在未涂层血管生成μ玻片上的两层Matrigel之间(德国Ibidi Gmbh):用10µl Matrigel/培养基(1∶1;50%)填充底部微孔,并在37°C下聚合30分钟。然后以20.000个细胞/ml密度(~1000个细胞/孔)接种细胞。 附着后(37°C下1-2小时),用第二层Matrigel/培养基(1∶4,25%)覆盖细胞,让其在37°C聚合过夜。 细胞培养基每隔一天更换一次。
用于RNA提取的3D批量培养
前列腺在Millicell悬挂细胞培养插入物中培养,在6孔板(Costar)上使用1.0µm PET透明膜(Millipore)。 用Matrigel/培养基(1∶1)预涂膜,并在37°C下培养1h,以防止粘附到膜上。 将细胞悬液与Matrigel混合1∶4,转移到包被孔中,并在37°C下聚合过夜。 每隔一天用下面的新鲜培养基培养细胞。
细胞固定、免疫荧光标记和成像
将小型化的3D培养物固定在微孔中,使用4%多聚甲醛,补充0.8%Triton X-100(Sigma-Aldrich)、5mM EGTA和1mM MgCl 2 RT15–20分钟。固定培养物用PBS洗涤3次,并用20%马血清封闭1小时。 培养物在4°C下与一级抗体(列于 表S2 )用PBS洗涤,用二级抗体和Hoechst核染色(1∶5000)在室温下孵育4h。
3D结构用Calcein AM活细胞染料(Invitrogen)染色。 使用蔡司Axiover 200 M与旋转圆盘共焦装置横河CSU22和蔡司Plan-Neofluar 5×物镜拍摄共焦三维图像。 Z堆叠的步长为19µm。 强度投影由SlideBook 4.2.0.7和NIH ImageJ创建( http://rsbweb.nih.gov/ij/ ),使用VTT Acca软件进一步分析(灵敏度10;阈值5,过滤出的面积/大小小于500像素的结构)。 盒子图用R.20x相控延时图像进行可视化,用Inucyte(Essen仪器)采集图像,用ImageJ进行预处理,并用VTT Acca进行分析(灵敏度30;阈值5,过滤出的区域中小于1000像素的结构)。
RNA提取和微阵列
用冰镇PBS清洗3D大块培养物,用手术刀切除细胞膜,将球体转移到6孔板中。 将凝胶与9 ml 5 mM EDTA在PBS中剧烈混合,转移到15 ml Falcon试管中,并在桌面摇杆上培养45分钟,以从Matrigel中分离。 前列腺通过离心沉淀并用RLT缓冲液(Qiagen)溶解。 使用RLT缓冲液直接从10cm的细胞培养皿中以90%的汇合率裂解单层繁殖的细胞。 根据制造商的方案,使用RNeasy Mini试剂盒(Qiagen)提取总RNA(来自生物复制品)。 使用Ambion的Illumina TotalPrep RNA扩增试剂盒扩增300 ng RNA。 隔夜(~16 h)进行IVT反应,以产生足够的生物素化cRNA。RNA和cRNA浓度用纳米滴ND-1000测量,整体质量用BioRad的Experion电泳站监测。 将750 ng cRNA在58°C下在Illumina的Sentrix HumanRef-8 v3 BeadChips上杂交过夜。 用1 mg/ml的菁-3-链霉亲和素(GE Healthcare Biosciences)检测杂交cRNA,并用Illumina BeadArray Reader扫描阵列。 使用Illumina GenomeStudio软件对数据进行质量检查和提取,无需标准化或背景减法。
微阵列数据分析
使用生物导体R包“beadarray”对原始微阵列数据进行分位数标准化。 使用方差和强度过滤器进一步处理归一化数据。 使用limma和lumi R/Bioconductor软件包对差异基因表达进行统计分析。 Benjamini-Hochberg多重测试校正后,差异表达阈值为q<0.05。 整个实验组的标准化Illumina基因表达数据已提交给GEO(基因表达总览)作为研究 GSE19426 .
然后以两种不同的模式使用数据:为了评估2D和3D实验之间或3D培养中不同时间点的基因表达相对变化,从2D单层培养中重复的平均值中减去3D中的平均标准化值,并计算比率。 然后利用Log(2)转换的2D/3D比率进行聚类和热图生成(Cluster 2.11和TreeView 1.60,Stanford University),以及基因本体分析(GO;DAVID, http://david.abcc.ncifcrf.gov/ ). K-Means聚类用于根据2D/3D比率数据绘制代表性热图,生成12个节点(100次迭代)。 R中的基因集分析(GSA)软件包用于定义显著富集的基因类别,这里使用“Maxmean”统计数据计算富集分数,并从1000个bootstrap复制中得出基于排列的p值。 错误发现率(FDR)校正也被用作相关性度量。 用于分析的基因集是从分子特征数据库(MSigDB,Broad Institute)获得的,包括位置、策划、共表达邻域、GO和进化保守的转录因子靶点。
其次,利用标准化但未经处理的基因表达数据定义与表型特征(圆形/正常、质量、星状表型)相关的基因特征。 基于专门的R脚本进行主成分分析(PCA)和与球体形态相关的信息基因绘图。 基于方差分析选择代表最大方差百分比的基因。
RT-PCR验证
用Invitrogen Superscript II逆转录酶在50µl中逆转录2µg总RNA。 cDNA稀释1/10。 用7900HT快速序列检测系统(Applied Biosystems)以96孔或384孔板格式(8µl/孔)进行三次QRT-PCR。 PCR引物和探针是根据罗氏通用探针库设计的,寡核苷酸是从Sigma-Aldrich订购的。 在300 nM下使用引物,在100 nM浓度下使用探针; 使用2x TaqMan®通用PCR主混音。 使用Applied Biosystems SDS软件对PCR运行进行分析。
蛋白裂解物微阵列(LMA)
在第3、6、8、10和14天收集前列腺; 按照以下方案:用PBS清洗微孔,Matrigel与PBS中5 mM EDTA冰镇混合物混合,转移到v型底部96 well板(Greiner)中,并在桌面摇床中的冰上培养30分钟。 通过离心沉淀球体并在LMA缓冲液(0.2%SDS,100 mM Tris,10 mM DTT)中溶解。 单层细胞在LMA缓冲液中以90%的汇合率在10cm的平板上收集。 对于每个时间点,在单个阵列上打印两个生物复制。 如前所述进行打印、染色、扫描、背景减影、与β-肌动蛋白信号相关的标准化和数据分析 [34] .
蛋白质印迹
如微孔板所述,从培养孔收集蛋白质样品,并在WB缓冲液中进行溶解(25 mM Hepes pH 7.5,100 mM NaCl,5 mM EDTA pH 8.3,0.5%Triton X-100,20 mMβ-甘油磷酸,100µM原钒酸盐,0.5 mM PMSF和1 mM DTT)。 蛋白质浓度通过Bradford分析测定,蛋白质通过SDS-PAGE用预制PAGEr凝胶(Lonza)分离,转移到Protran硝化纤维素转移膜(Whatman)上,并用表1中列出的主要抗体进行印迹 表S3 用三种抗体进行多重培养,以适应从小型培养物中提取的少量蛋白质。 用Alexa红外染料结合二级抗体(Invitrogen)检测抗体,用Odyssey红外成像系统(LI-COR)扫描膜。
3D药物治疗
化合物从SIGMA或Tocris Inc.订购,并根据制造商的说明溶解在适当的载体(DMSO、乙醇、1xPBS)中。 从研发系统订购重组人趋化因子、细胞因子和功能阻断抗体。 药物以10 mM储备溶液的形式制备,储存于−20。 将大多数趋化因子和肽稀释至1µg/µl储备溶液。 在治疗前立即稀释至工作溶液。 在球状体形成的4天后添加药物,并维持长达7天。 药物浓度根据大多数化合物已知的半数最大抑制浓度(IC50)进行选择。 所有治疗均分三次进行。 通过活细胞成像(Inccyte,Essen Instruments;10x物镜)实时监测球体,每小时采集1张图像。
细胞增殖分析
在加入药物之前24小时,将细胞接种在384孔板上。 72小时后,根据制造商的方案,使用CellTiter Blue®细胞活性测定(Promega)评估活细胞数量。 荧光信号用EnVision多标签平板阅读器(Perkin Elmer)定量。
结果
正常前列腺上皮细胞和PrCa细胞在Matrigel中形成特征性形态
正常前列腺和前列腺癌(PrCa)细胞系不能在纯富含胶原蛋白的细胞外基质中分化和形成多细胞结构( 图S1 ). 在胶原蛋白中,正常细胞和肿瘤细胞都只形成松散的聚集物,细胞间接触不良或无接触,通常表现为成纤维细胞样的生长模式。 相反,Matrigel强烈支持正常和PrCa球体的生长和分化。 Matrigel对所有测试的细胞株都有深远的影响,几乎没有例外; 支持相关多细胞结构的形成。 Matrigel中球体的形成通常由单个细胞启动。 Matrigel形成的球体通常分为四种形态类别 [19] , [35] ( 图1 ; 图S2 ).
图1。 3D Matrigel培养中形成的球体的典型相位对比图像。
大多数结构分为圆形、块状、星状或葡萄柚状。 一些细胞系在Matrigel中未能形成球形,但作为单个活细胞持续存在长达两周(单个表型)。 大多数球状体在接种后第9-10天成像。 PC-3球状体在第9天表现为圆形表型,在第13天发生向侵袭性/星状表型的变态。 PC-3M在更早的时间点(第5-8天)也会发生同样的情况。
分枝/圆形表型
正常初级前列腺上皮细胞(PrEC)和非转化系,如RWPE-1和EP156T细胞在培养6–10天后形成圆形球体( 图1 ). 正常PrEC和体外永生细胞系如RWPE-1和PWR-1E细胞同时形成分支腺泡和圆形球体结构,以大细胞聚集物的形式主动迁移到周围ECM( 图2a-d ). EP156T细胞无分枝结构或很少分枝结构。 圆形结构通常形成坚固的基底层(BL),包裹球体和腺泡结构( 图2 , 图S2 , 图3g–m ). 令人惊讶的是,肿瘤细胞系DU145、PC-3和PC-3M细胞也形成了圆形且分化良好的极化球体( 图2e )周围有一个完整的BL,通常含有管腔(PC-3; 图3e+r ). 此外,PC-3球体通常包含一个内部细胞团,使人想起PIN(前列腺上皮内瘤)中的结构。 紧密连接蛋白如ZO-1(未显示)和F-actin的免疫染色( 图3a-c )在正常细胞和肿瘤细胞形成的圆形球体中,细胞间的接触和细胞极化通常非常牢固。
图2。 对Matrigel中生长的各种前列腺细胞和细胞系进行相位对比和共焦激光扫描显微镜观察,说明了在几个非转化细胞系中典型观察到的分支表型与仅限于肿瘤细胞的星状/侵袭表型之间的表型差异。
A) RWPE-1细胞形成的分支结构的相位对比图,B)用层粘连蛋白B1抗体染色的RWPE-1形成的腺泡结构。 C) 初级前列腺上皮细胞(PrEC)形成的分支或簇状结构。 D) ●●●●。 PWR-1E细胞形成的混合分枝和质量表型结构。 E) 第9天,PC-3细胞形成圆形结构,用钙黄绿素活细胞染色。 F) 第13天,圆形球体形态转变为侵入性结构。 G) 第13天左右侵入性PC-3结构的相位对比图。 H) ●●●●。 用整合素β1活性形式(ITGB1)特异性抗体对PC-3丝状体进行染色,显示纺锤状细胞结构的致密装饰。
图3。 使用抗基底膜成分层粘连蛋白β1(LAMB1)、间充质标记物波形蛋白(VIM)和纤维连接蛋白(FN)的抗体,对在Matrigel中生长9或14天的球体结构进行代表性免疫细胞化学染色。
Alexa488标记的卵磷脂用于检测F-actin,Hoechst染色用于标记细胞核(蓝色)。 RWPE1、DU145和PC3细胞显示EMT相关的间充质标记物的表达,与表型无关(PC-3细胞;第9天为圆形,第14天为星状)。
群体表型
大多数PrCa(LNCaP、22rV1、MDA-PrCa1、UM-SCP1、CWR-r1、LAPC-4)和两种 在体外 变形线(PWR-1E、RWPE-2)产生了大而不规则的球体,通常BL不完整或缺失,也缺乏中空内腔( 图3d+k ). PWR-1E是唯一能够分枝/腺泡形态发生的大规模表型细胞系( 图2d ). 管腔角蛋白KRT8和KRT18总是强烈表达( 表S3 ). 与圆形球体相比,细胞间的接触、成熟和极化通常不太明显,这反映在通常呈肾形的不规则球体上( 图1 ). 群体表型结构通常不显示lrECM的侵袭性; 然而,22rV1和LNCaP和RWPE-2细胞系中始终观察到丝状伪足或伪足的形成。 在LNCaP球体中,经常观察到细胞在BL不完全覆盖的位置离开球体结构( 图S2 ).
葡萄样表型
只有一个细胞系1013L持续形成松散的细胞簇,细胞与细胞之间的接触特别差,缺乏BL。LAPC-4细胞形成了块状和葡萄状结构。 在这些细胞系中未观察到侵袭性。
星形“侵袭性”表型
体外转化的细胞系RWPE-2/w99、WPE-1/NB14和肿瘤细胞系ALVA-31和ALVA-41形成星状或侵袭性结构,其特征是纺锤状丝足( 图2g )以及细胞链通过周围ECM的快速迁移。 所形成的侵袭结构几乎都是多细胞的,呈链状侵入模式。 仅偶尔观察到单个细胞的成纤维细胞样间充质浸润。 这个 在体外 转化系RWPE-2、RWPE-2/w99和WPE1/NB14同时形成星状结构和圆形球体,表明这些细胞系的组成不均匀。 其中,RWPE-2/w99代表具有最一致星状表型的细胞系,并被选择用于进一步实验。 永生前列腺基质细胞(WPMY-1)和肿瘤来源的原代基质细胞(未显示)也形成星形结构,但缺乏快速运动和侵袭性。
侵入式开关
PC-3和PC-3M细胞形成了圆形且分化良好的极化球体,但在3D中分别在10-13和6-8天左右发生了向侵袭形态的自发转化( 图2e+f ,补充入侵 电影S1 ). 形态转化为星形侵袭表型的开始取决于细胞密度。 注入新鲜培养基后,转化可能会暂时延迟,甚至部分恢复,但最终会继续进行,直到所有结构彻底转化,只有星状结构保留下来( 图2g ). 甚至在入侵之前形成的入侵结构和丝状伪足强烈表达层粘连蛋白受体整合素β1的活性形式,表明与细胞外基质的强烈接触是入侵过程的先决条件( 图2h ). 同时,转换结构的BL变得越来越模糊和瓦解( 图3m ). 间充质标志物波形蛋白VIM和纤维连接蛋白FN1的强表达( 图3o–y )在非侵袭性RWPE-1(异质性)和DU145以及PC-3细胞中观察到,与星状表型无关。 此外,PC-3和PC-3M细胞侵袭性转化后,VIM和FN1的表达没有增加( 图3s+y )
“单一”表型
一些癌细胞株(VCaP、DuCaP、NCI-H660和MDA-PCa 2b)未能形成球形,但作为单个细胞(“单一”或“单一表型”)持续存在长达2周。 有趣的是,所有这些细胞系的ETS转录因子融合事件或重排均为阳性(H660、VCaP和DuCaP中的TMPRSS2-ERG,MDA-PCa 2b中的平衡ETV1重排)。 对Matrigel中VCaP细胞的基因表达分析表明,当细胞嵌入Matrige1中时,细胞可能会发生终末分化或衰老(数据未显示)。 在Matrigel中TMPRSS2-ERG融合基因和增殖相关基因的表达降低。 然而,VCaP和DuCaP在I型胶原凝胶中的生长不受限制; Col I中的基因表达模式有限(未显示)。
Matrigel引起的基因表达动态变化与正常、转化和侵袭特性相关
LrECM和球体的形成导致PrCa细胞的细胞生物学、蛋白质和mRNA基因表达发生根本性变化。 大约3400个mRNA在2D和3D条件下差异表达,但在所有细胞系和所有时间点上并不一致。 在细胞系组中观察到三种普遍的基因表达改变模式( 图4a+b ). 通过qRT-PCR验证所选基因的表达改变( 图4c ). 经qRT-PCR证实,差异表达因子通常比阵列数据大。 GO分析和GSEA揭示了大多数簇的高度显著的丰富功能基因类别( 表S4 , 第5章 和 S6系列 ).
图4。 与单层培养相比,在富含层粘连蛋白的ECM(Matrigel)中培养的细胞的mRNA基因表达改变的特征模式(比率3D/2D)。
A) Heatmap,说明了K-means算法生成的12个簇。 簇1+2代表仅在正常细胞中受影响的基因(PrEC,EP156T)。 簇6-8表示所有细胞系中对Matrigel 3D中3D细胞培养的反应中类似诱导或抑制的基因,无论表型或转化如何。 簇9-12包含星状/侵袭型细胞系(ALVA31、PC3、PC3M、RWPE2/w99)的特征基因,或在圆形结构自发转化为星状结构期间诱导的基因(例如PC3、第13天和第15天)。 B) 平均表达变化,说明集群内改变基因表达的中位数(深灰色)和变异(浅灰色)。 C) 一组选定基因的QRT-PCR分析(黑色)和Illumina阵列数据(灰色),验证侵袭性PC-3细胞中表达增加。
a) 非转化细胞
对3D Matrigel培养反应的基因(簇1+2; 图4a ; 表S4 )仅限于非转化细胞,主要与ECM周转、脂质和二十烷酸/前列腺素代谢或细胞分化有关。 这些基因集可能是正常球体成熟和腺泡分支所必需的,包括上皮分化、细胞迁移和腺泡形态发生的已知调节因子,如WNT5A [36] , [37] 基底型细胞角蛋白如KRT5和KRT14。 这些基因中有许多与基底上皮分化模式相关。 相反,PrCa细胞优先显示管腔分化。
b) 基质对基因表达的广义影响
无论细胞系、转化状态或球体形态如何,对lrECM都有均匀反应的基因集分为3个簇:簇7(被抑制)在线粒体和核糖体功能、mRNA加工和一般代谢过程中高度富集,表明总体生长减少, 与单层培养相比,3D中细胞的代谢活性和增殖。 同样,聚类8也显示出极显著性(p<10 −57 )细胞周期、DNA合成、有丝分裂和增殖过程的富集,证实了lrECM导致细胞增殖的普遍降低。 然而,平均褶皱变化( 图4b )观察到这些基因在1.5到2倍之间; 表明3D培养中的细胞继续复制,但与2D相比速度较慢。 与PrCa系相比,lrECM中正常PrEC的持续增殖时间更长; 这种作用也被描述用于原代乳腺上皮细胞 [18] 簇6富含与脂质/类固醇代谢相关的基因(p<10 −11 )染色质修饰和表观遗传重编程(p<10) −7 )这表明腺泡分化涉及到深刻的表观遗传变化。
c) 侵入性转换
在星形细胞中表达或在圆形PC-3球体向星形结构的形态转化过程中诱导的基因集(簇9)富含与细胞粘附、细胞间接触、侵袭/转移和ECM周转相关的GO术语(胶原蛋白、层粘连蛋白亚型、整合素ITGB2、ITGB4、ITGAV、ITGA1和ITGA10; 表S4 ). 该簇还包含许多早期发育转录调控因子(CITED2、HEY1、SOX4、SOX9、FOXO3、HOXA13、HOXB13、qRT-PCR验证 图4c ). 簇11在侵袭性PC-3和分支RWPE-1细胞中均表现出强烈的基因诱导,主要包含干扰素诱导基因(OAS1、OAS2、MX1、IFI27、STAT1、STAT2等)。 这可能表明IFNα/β、STAT1/STAT2转录因子和炎症过程在非转化上皮细胞(RWPE-1)的侵袭和分支中具有双重作用。
主成分分析:细胞株mRNA基因表达特征与3D形态学相关
主成分分析(PCA, 图5a )用于识别可区分正常/圆形球体(PrEC、EP156T和RWPE1)、质量球体(LNCaP和22rV1)和星状形态球体(ALVA31、PC3、PC3M、RWPE-2/w99)的最具特征的基因特征。 基础角蛋白KRT5、KRT6A-C、KRT13、KRT14和KRT17代表了圆形球体最具代表性的基因,是体外永生系和正常前列腺上皮细胞的基础样表型的特征。 内脏标记物,如角蛋白KRT8和KRT18仅表达较差( 表S3 ),但炎症趋化因子如白细胞介素1a和白细胞介素1b也是特征性的。 相反,管腔分化相关和雄激素诱导基因,如NKX3-1、SYT4、KLK4、CK18和TMSL8,被确定为群体表型的最具特征性标记,代表大多数PrCa细胞系。 CTGF(结缔组织生长因子)或PLAT(组织型纤溶酶原激活剂)等基因是侵袭性细胞系PC-3或RWPE-2/w99最具特征性的基因; 表明TGF-β信号转导、ECM主动重塑和间充质特性在侵袭过程中可能发挥作用 [38] 使用Ingenuity Pathway analysis(IPA)对与侵袭性/星状表型最密切相关的基因进行进一步分析,产生了多个基因网络,包括一个与AKT通路和通过各种G蛋白偶联受体(Gα 我 蛋白)、趋化因子受体CXCR4、侵袭和血管生成相关神经毛蛋白(NRP1)和神经肽apelin(APLN)。 其他相关基因包括细胞骨架蛋白zyxin(ZYX)和nebulette(NEBL)、ECM相关基因EFEMP2(含EGF的纤维样细胞外基质蛋白2)、嗜菱形蛋白(RHPN)和FAM107A,以及转录因子FOXO3和TCF4( 图5b ). 尽管侵袭性星状结构的基底层变得越来越模糊和解体,但侵袭性PC-3、PC-3M和ALVA31细胞继续分泌不同的层粘连蛋白。 在3D培养的PC-3细胞早期,与正常上皮分化相关的层粘连蛋白-5(α3β3γ2)被重新诱导,而其他层粘连素亚基(α5,β2,γ1)在转化后被去新生表达( 图5c )经免疫荧光验证( 图5d ,LAM-89泛素抗体)。
图5。 与2D单层相比,3D培养中改变的基因表达数据的功能分析。
A) 主成分分析(PCA),说明区分圆形、块状和星状形态的基因集。 圆形表型细胞包括PrEC、EP156T和RWPE1。 肿块表型以LNCaP和22rV1细胞为代表。 星形细胞/侵袭性细胞包括ALVA31、PC3、PC3M和RWPE-2/w99。 B) 入侵相关集群9-12的灵巧路径分析(IPA)( 图4 ),说明生成了13个网络中的2个。 该网络以AKT和PI3-激酶途径为中心。 颜色与圆形和侵入性球体之间观察到的差异表达因子相关(红色:诱导,绿色:抑制)。 C) 热图,说明2D和3D培养中层粘连蛋白mRNA表达的改变。 层粘连蛋白α5、γ1、β2和α3的表达在PC-3和PC-3M细胞的侵袭性转化中受到强烈诱导(13+15天)。 D) 侵袭开始后各种层粘连蛋白的持续表达,如用检测各种α和β亚单位的人类特异性抗体(LAM-89)染色所示。
上皮-间充质转化(EMT)在侵袭和星状表型中的作用?
具有最显著潜在侵袭潜能的细胞系(ALVA31、PC-3和PC-3M)在一定程度上与异质性RWPE-1和RWPE-2/w99细胞共享,显示间充质标记物(Vimentin VIM、Fibronectin FN1、N-cadherin CDH2)的表达最高( 图S3a ),CDH11( 图S3b ),以及上皮标志物如E-钙粘蛋白CDH1的表达缺失( 图S3c ). 同时,RWPE-1细胞(CDH1和CDH2; 图S3a ). 这表明这些细胞(或亚群,例如在RWPE-1内; 图S3c )可能在体外经历了上皮-间充质转化(EMT)。 PC-3和PC-3M中的连环蛋白α-1(CTNN1A)纯合缺失进一步支持了这一观察结果,该基因与E-cadherin协同形成上皮细胞-细胞对照物(未显示)。 PC-3、PC-3M和ALVA31细胞中PTEN(磷酸酶和张力蛋白同系物)的丢失也可能导致这种EMT [39] , [40] 以及AKT和PI3激酶途径的伴随激活。 然而,许多间充质标记基因(VIM、FN1)和EMT相关转录因子(如Slug、SNAI2)在2D和3D培养物中都强烈表达,在球体形成的所有阶段都保持不变,并且在PC-3球体的侵袭性转化中没有显著诱导( 图3s ). 此外,VIM和FN1也在非转化RWPE-1和非侵袭性DU145细胞中表达( 图3o–y ). Slug(SNAI2)在非侵袭性细胞系中表达最高,可能是正常前列腺分化所必需的( 图5a ; 图S3b ). TWIST1表达与EMT相关观察结果更为一致。
高水平的EMT标记表达可能表明存在潜在或亚稳定的EMT表型,该表型被lrECM暂时抑制,有利于正常上皮分化。 最终,间充质表型特征占优势,压倒上皮分化模式,从而可能导致细胞入侵。 与EMT/间充质标记物相反,当PC-3和PC-3M细胞侵袭时,AKT下游的许多基因和相关的癌相关通路(PI3-激酶、PTEN、IGF1R、mTOR和S6激酶)被诱导( 图S4a–c ). 除其他外,这些主要包括与侵袭相关的整合素α10、β4和β2; 许多层粘连蛋白和胶原亚单位以及白细胞介素IL10和IL23A。 临床基因表达数据( 图S4d ) [41] 证实侵袭和AKT/PI3-激酶相关基因,如胶原蛋白1α1所示,与正常前列腺相比,PrCa中也可能上调,并可能与高Gleason分级肿瘤相关。
与球状体形成和侵袭相关的途径、关键调节蛋白和分子机制
与2D/单层培养相比,通过多种生物信息学方法的组合,包括主成分分析(PCA)、创新路径分析(IPA)、基因本体注释(GO)和基因集富集分析(GSEA),确定了形成圆形和块状球体的关键途径。
圆形和块状表型
与3D中圆形和块状球体的形成最相关的途径主要与脂质和类固醇代谢、前列腺素/二十烷酸以及基因表达的表观遗传调控有关。 ( 表S5 和 S6系列 )在确定的关键信号分子中,IGF1/IGF2受体、NFκB、促炎性趋化因子(IL-1α、TNFα和CCL2)以及AKT和PI3Kinase被认为是最突出的。 NFκB1的表达(p50,p105); IKKα、STAT1和p-STAT1(但不是STAT2); 与2D相比,球体中或Smad-3持续减少( 图6a ). 这种模式与抑制性IκBα和IκB-ε蛋白水平的暂时升高相一致( 图6b ),在球体形成的第6-8天左右达到峰值。 这表明对促炎过程和趋化因子/细胞因子(如CCL2)的严格控制,特别是在球体形成的早期阶段,但在侵入性结构中没有。 phospo-GSK3β表达的裂解物阵列分析显示出非常相似的动力学(未显示),进一步支持在球体形成的关键阶段NFκB和Wnt信号通路的暂时抑制。
图6。 2D与3D培养中关键信号分子、磷酸蛋白和转录因子的表达改变。
A) 各种转录因子(AKT1、STAT1、TAT2、IKKα、NFkB1 p50、SMAD3)、雄激素受体(AR)和PCNA的Western blot分析。 B) 和C)从二维培养的单层细胞或三维培养的球形细胞中分离的细胞裂解液中IkBα和IkBε(NF-kappaB抑制剂)的蛋白裂解物分析。 D) 增殖标记物Ki-67和凋亡标记物PARP裂解物阵列分析。 使用特异性抗体信号与总β-肌动蛋白信号的相对比率进行数据归一化,以便在细胞系、时间点和生长条件之间进行相对定量比较。
侵袭性/星状表型
入侵细胞中确定的核心通路( 图7a , 表S5 和 S6系列 )与AKT和PI3激酶、整合素、层粘连蛋白、TGFβ、JAK/STAT和干扰素信号、刺猬信号和基质金属蛋白酶(MMP13)最显著相关。 与2D条件(p-Ser308和p-Ser473)相比,在大多数肿块和侵袭性疾病中检测到pAKT1水平升高,但在正常球体中未检测到( 图6a ). 在侵袭性PC-3细胞中,这些蛋白的水平进一步增加。 转录因子STAT1和STAT2的表达与干扰素诱导基因如IFITM1(干扰素介导的跨膜蛋白1)、OAS1或IFI27的共同作用表明侵袭细胞中JAK/STAT和干扰素α/β相关信号通路的激活( 图7a、b+d )经免疫荧光验证( 图7c )由于在强分枝RWPE-1和侵袭性RWPE-2/w99、ALVA31、PC-3或PC-3M细胞中,干扰素相关基因和途径的表达相似,我们假设这些机制在细胞运动中起一般作用。
图7。 PC-3细胞中观察到的动态基因表达变化的功能分析,这些变化与圆形到星形球体的形态转变相关。
A) 主成分分析PCA。 箭头突出显示的基因与单层(2D)培养中的PC-3细胞或3D中的圆形(第4+8天)和星状表型(第13+15天)最相关。 B) IPA基因网络分析显示了侵袭细胞中STAT1/STAT2、干扰素α/β和NFκB信号传导之间的串扰(颜色表示表达改变的因素;红色表示诱导,绿色表示抑制)。 C) 星形PC-3球体JAK1和STAT2蛋白表达的免疫染色。 STAT2信号在侵袭性结构中最高,JAK1在外周细胞中最高。 D) IPA:干扰素γ和α/β信号转导途径示意图,颜色对应基因表达的折叠变化。
靶向AKT、PI3Kinase和mTOR的化合物抑制球形细胞的侵袭
我们开发了小型化3D培养系统,该系统具有良好的显微镜格式(15个实验/板),辅以高含量的活细胞成像系统和定量图像分析软件,用于大规模3D复合物测试。 根据IPA、DrugBank和Matador收集了100多种化合物( 表S7 )基于Ingenuity通路分析建议的特定靶基因或通路/关键信号分子。 这些化合物首先针对PC3和PC-3M细胞形成的“星状”球体进行测试,以确定可能特异性阻断侵袭性肿瘤细胞的抑制剂( 图8a+b ). PC3细胞也在单层培养中处理( 图8c ). 然后针对更大的3D细胞系,包括非转化的EP156T和RWPE-1细胞,以及非侵袭性DU145、LNCaP和22rV1细胞,进一步测试确定的有效抑制剂( 图S5 ). 靶向PI3-激酶(NU7026,APB2)和AKT通路(deguelin,API-2)的小分子抑制剂最有选择性地抑制侵袭,在2D单层培养中证明效果较差,。 同样的抑制剂对正常细胞只有轻微或无影响。 相反,大多数靶向mTOR和IGF1R途径的化合物同样抑制侵袭性和非侵袭性球体、3D中的正常细胞或单层培养物中的癌细胞。 抑制刺猬信号传导的抑制剂(例如环胺)也抑制正常细胞和癌细胞的生长。 相反,靶向NFκB、促炎性趋化因子和受体(IL-1α和CCL2)、TGFβ、p38或p42/44MAP激酶的抑制剂对侵袭细胞和正常细胞始终无效。 令人惊讶的是,HDAC抑制剂和抗有丝分裂药物都无效,即使在之前显示的浓度下,单层培养也会导致细胞凋亡 [42] .
图8。 正常(EP156T)和侵袭性前列腺癌细胞(PC-3)的球体对药物NU7026的典型反应,NU7026是一种针对PI3-激酶的小分子抑制剂。
A) 经NU7027治疗的正常(EP156T)和侵袭性(PC-3)球体的活细胞成像。 B) 使用靶向层粘连蛋白β1(绿色)和Alexa488-偶合卵磷脂(F-actin)的抗体,对NU7026处理的EP156T和PC-3球体进行免疫荧光。 DAPI用于核染色。 药物暴露阻断PC-3球体向星状表型的转化,但不影响正常球体的形成。 仅车辆(0.1%二甲基亚砜)作为对照。 C) 单层培养中PC-3细胞对NU7026缺乏反应(72小时)(CTG,Cell Titer Glo测定)。 D) 治疗组与未治疗组PC-3球体的大小(面积、总像素数)和附件数(侵袭性结构、像素中位长度)的量化。 条形图表示标准误差。
讨论
我们已经确定了Matrigel中大量正常、非转化和前列腺细胞系的生长、分化和全基因组mRNA表达模式,涵盖了所有经典和许多新的PrCa细胞系 [43] 小型化和成本效益高的3D模型的开发使我们能够通过活细胞和共焦显微镜的结合实时和高分辨率监测前列腺素的生长、成熟、侵袭和运动。 这些模型将有助于在3D中实现更高吞吐量的复合屏幕,从而可以定量测量腺泡结构的生长、大小、形状、细胞动力学和形态。 最近的研究活动主要集中于干/祖细胞群在球体中的作用 [39] , [44] ,在中审阅 [45] 。除极少数例外 [46] 这些研究是指在非锚定条件下培养的前列腺素,与ECM无任何接触 [47] 相反,我们的分化相关模型基本上没有干细胞标记物的富集。 很明显,lrECM主要支持分化,但我们感到惊讶的是,Matrigel即使在PrCa细胞系中也能启动正常样的上皮分化程序 在体外 三十多年的文化。 这基本上证实了Mina Bissell 20年前提出的概念,即背景,特别是肿瘤环境很重要,可能会有力地推翻 [48] 恶性基因型。 然而,我们的实验数据表明,抑瘤表型也可能只是暂时的。
本研究的具体目的是详细分析正常和前列腺癌细胞的各种不同生长、迁移和侵袭模式,并识别可能特异性阻止侵袭行为的小分子抑制剂。 这是首次描述极化上皮球体动态逆转为侵袭性细胞以及与此转化相关的基因共表达网络的研究。 虽然细胞侵袭和运动传统上是通过Boyden小室、transwell或二维潜在修复分析进行分析的,但我们的系统提供了一个独特的系统来监测和调节器官型环境中的侵袭过程。 球形细胞和侵袭性细胞中改变的基因表达特征证实了AKT和PI3-激酶途径在乳腺或前列腺生长中的重要性 [39] , [49] – [51] 然而,AKT和PI3K通路被证明对侵袭特别重要:大多数靶向这些通路的药物有效地阻止了侵袭过程,但在2D条件下效果较差,通常对正常细胞的生长和分支影响最小。 相反,无论细胞培养条件、ECM和微环境如何,mTOR、IGF1R和JAK/STAT通路似乎对正常细胞和肿瘤细胞的生长、分支和分化都至关重要。 JAK/STAT信号的诱导,如许多干扰素诱导蛋白的表达所反映的,可能代表迁移细胞的一般特征,在分支细胞和恶性侵袭细胞中都可以观察到。 炎症相关途径 [52] 似乎与生长或入侵无关。 抑制NFκB通路的化合物在很大程度上是无效的,这与成熟球体中核因子κB1、IKKα的表达减少以及核因子kb抑制剂IκBα、IκBε和IκB-ζ增加的观察结果一致。 此外,尽管在球体形成中诱导了促炎性化学因子(CCL2、IL-1α、TNFα)的表达,但以相应受体为靶点的化合物证明是无效的。 大多数抑制细胞周期进展/有丝分裂、p38和p42/44 MAP激酶或基质金属蛋白酶(MMPs)的药物对侵袭也无效,WAY-170523除外,它是MMP13的特异性抑制剂 [53] .
在侵袭性PC-3和PC-3M细胞中观察到的侵袭模式可以最好地描述为流式或链式迁移 [23] , [24] 只有偶尔单个细胞会自行移动。 侵入细胞瞬时形成并分解细胞间接触,同时沿着ECM的共同轨迹移动。 整合素如ITGB2、ITGB4和ITGA10、一组胶原蛋白和许多其他细胞外蛋白的同时诱导表明动态细胞基质粘附和附着力在这类侵袭中的重要性。 其中一些标记物在高级PrCa中的过度表达可能表明类似的机制和基因也在体内发挥作用。 此外,推进迁移细胞可能需要动态肌动蛋白聚合-解聚循环和Rho/Rac介导的细胞突起控制 [33] , [54] 集体链侵袭与正常细胞分支腺泡形态发生中观察到的片状或管状运动截然不同,这是正常器官发育的标志,通常更具动态性。 它也不同于2D文化中常见的变形虫或滑翔运动模式。
层粘连蛋白-5等上皮标记物的再表达 [55] 侵袭细胞中的紧密连接蛋白Cx43(GJP1)与前列腺的一些先前报道相矛盾 [51] 、乳腺癌和卵巢癌 [9] , [56] 但这与流式侵袭中细胞间接触的动态形成和消解是一致的。 可能需要特定层粘连蛋白来润滑和维护用作通过ECM侵入通道的履带。 指导小组,称为“游击小组”,可提供总体方向和指导(参见 [57] ). 成纤维细胞是否可以作为引导细胞还有待阐明 [27] 在我们的模型中,引导细胞可以通过在侵袭开始之前形成的尖锐、细长和纺锤状的丝状伪足来识别。
除了上皮标记物在侵袭性细胞中的重新表达外,流式侵袭不被视为经历EMT的间充质细胞或上皮细胞的特征。 传统上认为这些细胞以成纤维细胞样的方式迁移为单个细胞。 尽管间充质标志物的表达表明EMT基因型,但我们无法确定明确的间充质侵袭相关表型。 此外,侵袭性细胞缺乏显著的干细胞相关表达特征 [58] 并且没有获得CSC的属性(例如CD44+/CD24-)。 相反,间充质标志物的表达是许多细胞系的共同特征,与恶性转化或侵袭性无关 [59] 在分支(RWPE-1)、圆形(DU145)和所有星状细胞(RWPE-2/w99、ALVA31、PC-3、PC-3M)中检测到间充质标记,但在具有显著管腔表型的mass-phenotype球体(例如LNCaP、22rV1)中未检测到间质标记。 圆形、早期阶段的PC-3和PC-3M球体表达间充质标记物波形蛋白和纤连蛋白,即使在侵入性转化后,它们仍保持相同的表达水平。 波形蛋白与上皮标记物如细胞角蛋白5和14或E-cadherin在圆形球体中共同表达,不干扰上皮极化和分化(DU145,PC-3)。 β-catenin的核转位和相关Wnt通路的诱导,EMT的另一个特征 [60] 在侵袭细胞中未观察到。 在与EMT相关的经典E-box结合转录因子中,只有TWIST1的表达 [61] , [62] ZEB1与细胞株的侵袭潜能相关。 这些基因都没有在细胞入侵时被进一步诱导。 令人惊讶的是,Slug(SNAI2)的表达在侵袭过程中受到抑制,但在正常球体中强烈表达,这表明其在上皮分化而非EMT中起作用。
EMT作为一种发育机制可能参与正常的发育过程和侵袭性癌症,并且可能代表一个双向过程(EMT与MET) [63] 在癌症中,EMT可能只是肿瘤细胞可塑性增加的一个标志,而不是提供侵袭特性的关键机制。经过EMT治疗的Meta-stable和表型灵活的癌细胞仍然能够分化为上皮细胞。 这可能与血流中微转移酶的存活、组织定植的成功以及远处转移的形成特别相关 [33] 有趣的是,尽管缺乏E-cadherin和alpha-catenin,PC-3细胞仍然能够形成上皮细胞-细胞接触,显然使用的是替代机制,这可能并不局限于该细胞系。 进一步研究上皮细胞向侵袭性细胞的动态转化(反之亦然)可能会对这些机制以及EMT的假定作用提供更全面的见解。 最近的报告证实了EMT在不同细胞类型的混合片状和链状迁移模式中的可能作用 [64] , [65] 在我们的体外模型中确定的侵袭相关标记物和通路(AKT、PI3激酶、STAT1)的表达将在临床肿瘤样本中进一步研究,重点是高级别、转移性和侵袭性癌症。
总之,我们的实验系统有助于研究模拟肿瘤形态、生物化学和侵袭过程的极化上皮结构或球体 在体外 .我们和其他人 [26] , [28] 研究表明,3D中的乳腺和PrCa细胞系在许多与肿瘤细胞生物学相关的问题上具有代表性,但在单层细胞培养中却没有得到很好的解决。 这些3D模型对于癌症药物的发现和靶点识别来说是有用的,并且更加可靠,尤其是在相关分析的再现性和量化得到适当解决的情况下。
我们的模型提供相对低成本、高吞吐量 在体外 用于癌症研究和药物发现的工具,允许实验探索复杂的细胞生物学问题,并可能部分减少或取代异种动物移植模型。 因此,3D模型可以作为临床前药物开发管道的中间决策步骤,将用于铅鉴定的大规模高通量化合物筛选与基于异种动物移植的日益昂贵的验证研究联系起来。
支持信息
图S1 将未转化/永生化的EP156T细胞和PrCa细胞(细胞系DU145和PC-3)嵌入纯化的胶原蛋白(左面板,PureCol;鼠尾胶原蛋白I)或生长因子减少的Matrigel(右面板)后,形成形态不同的多细胞结构。 通过相控显微镜(每块面板的右侧)对结构进行成像,并用Alexa488-结合的卵磷脂染色,以通过F-actin突出细胞骨架(左侧)。
(6.22 MB TIF)
图S2 3D Matrigel培养中形成的球体的典型共焦激光扫描图像,用层粘连蛋白β1(LAMB1)抗体染色,以突出Matrigel中形成的结构周围基底层(BL)的形成。 圆形结构总是有一个完整、坚固的BL围绕着整个球体。 质量表型球体通常具有薄的、异质的和不完整的BL。星形结构显示出可变的、通常模糊的BL结构,侵袭细胞周围也有一层薄BL。 葡萄状结构没有任何可识别的BL。单表型细胞显示层粘连蛋白的斑点状、不规则表达。
(7.45 MB畅通节能法)
图S3 与上皮-间充质转化(EMT)相关的标记物和转录因子分析。 A) 上皮特异性钙粘蛋白CDH1(E-cadherin)与间质特异性钙黏蛋白CDH2(N-cadherin。 CDH2在PC-3和PC-3M中高表达,并在RWPE-1细胞中与CDH1共同表达。 B) Illumina微珠阵列检测到的PrCa细胞系中一组上皮和间质特异性钙粘蛋白和EMT相关转录因子的正常基因表达值。 C) CDH1(E-cadherin)在由非转化hTERT永生化EP156T细胞(强而均匀)、永生化RWPE-1细胞(异质性,圆形结构强但分支腺泡阴性)和PC-3(阴性)形成的球体中的表达。
(2.85 MB畅通节能法)
图S4 利用与六种最密切相关的前列腺癌相关通路(AKT、PI3-激酶、IGF1受体、mTOR、S6激酶和PTEN)相关的基因特征对基因表达模式进行功能分析。 A) 根据Biocompare的汇编,基因签名的组成( www.biocompare.com ). B) 维恩图,显示AKT、PI3-激酶和mTOR通路相关基因之间的重叠。 C) 热图,突出显示了圆形转化为星形球体后,PC-3细胞中联合通路分析中最强烈的侵袭相关上调基因的表达。 D) 通过expO基因表达联合体分析的PrCa微阵列样品中胶原蛋白1亚单位A1的示例性表达( 网址:www.intgen.org ),表明表达与临床参数如晚期、高级别肿瘤和高Gleason评分呈正相关。 插入物显示了与前列腺癌相比,正常前列腺中COL1A1 mRNA的相对表达(IST数据库, 网址:www.genesapiens.org ).
(1.93 MB畅通节能法)
图S5 使用VTT ACCA图像分析软件定量分析抑制药物对正常、非转化和癌细胞系的球体生长(像素面积)的影响。 药物、有效浓度和化合物抑制的主要途径如图(文本框)所示。
(102百万TIF)
表S1 本研究中使用的细胞系和模型。
(0.07 MB文件)
表S2 本研究中使用的抗体。
(0.06 MB文件)
表S3 3D Matrigel培养中形成的球体的免疫染色结果总结。
(10百万文档)
表S4 基因表达簇1-12的基因本体注释。 只显示了最显著的富集因子和错误发现率(FDR)。
(0.18 MB文件)
表S5 基因集富集分析GSEA,(A)在所分析的所有10个细胞系中,针对单层与Matrigel三维球体培养中差异表达的基因,以及(B)针对PC3细胞中差异表达基因的GSEA,比较圆形(第4+8天)与星状形态(第13+15天)。
(0.16 MB文件)
表S6 Matrigel中2D单层和3D球体培养中差异表达基因的灵巧路径分析(IPA)(一般效应,10个细胞系),以及PC3细胞中差异表达的基因的B)IPA,比较圆形(第4+8天)和星状形态(第13+15天)。
(0.06 MB文件)
表S7 本研究中使用的小分子抑制剂和药物治疗概述,针对功能基因表达分析确定的典型途径。 缩写:IB=侵入区块; IAM=腺泡形态发生受损; GR=生长减少; GA=生长停滞; CD=细胞死亡。
(0.16 MB文件)
电影S1 实时细胞图像生成的延时电影(1图像/h),显示PC-3细胞形成圆形球体。 电影序列大约在播入Matrigel后的第8天开始。 接种后大约11至13天,圆形球体转变为星形结构。
(10.55 MB MP4)
致谢
我们要感谢Varda Rotter(以色列雷霍沃特Weitzmann研究所)为我们提供EP156T细胞,感谢Roland Grafström(瑞典斯德哥尔摩卡罗林斯卡研究所)提供宝贵的讨论。
脚注
基金: 这项研究得到了芬兰科学院对MN(No.111597)的资助。 欧洲委员会的FP6和FP7综合项目PRIMA和EPITRON为OK和JV提供了额外资金。 资助机构在研究设计、数据收集和分析、出版决定或手稿准备方面没有任何作用。
参考文献
1 Isaacs JT、Isaacs WB。 雄激素受体胜过前列腺癌药物。 2004年《国家医学》; 10(1):26–27. doi:10.1038/nm0104-26。 10.1038/nm0104-26。 [ 内政部 ] [ 公共医学 ] [ 谷歌学者 ]
2 Litvinov IV、Vander Griend DJ、Xu Y、Antony L、Dalrymple SL等。低钙无血清培养基用于正常前列腺上皮干细胞的生长。 2006年癌症研究; 66(17):8598–8607. doi:10.1158/008-5472.CAN-06-1228。 10.1158/0008-5472.CAN-06-1228。 [ 内政部 ] [ PMC免费文章 ] [ 公共医学 ] [ 谷歌学者 ]
三。 Gudjonsson T、Adriance MC、Sternlicht MD、Petersen OW、Bissell MJ。 肌上皮细胞:它们在乳腺形态发生和肿瘤形成中的起源和功能。 乳腺生物肿瘤杂志。 2005; 10(3):261–272. doi:10.1007/s10911-005-9586-4。 2007年10月10日/10911-005-9586-4。 [ 内政部 ] [ PMC免费文章 ] [ 公共医学 ] [ 谷歌学者 ]
4 Weigelt B、Lo AT、Park CC、Gray JW、Bissell MJ。 HER2信号通路的激活和乳腺癌细胞对HER2靶向药物的反应强烈依赖于3D微环境。 乳腺癌研究治疗。 2009年doi:10.1007/s10549-009-0502-2。 10.1007/s10549-009-0502-2。 [ 内政部 ] [ PMC免费文章 ] [ 公共医学 ] [ 谷歌学者 ]
5 廖美杰,张CC,周B,Zimonjic DB,Mani SA,等。乳腺细胞群的富集,这些细胞形成乳房球并具有体内重新繁殖活性。 癌症研究2007; 67(17):8131–8138. doi:10.1158/0008-5472.CAN-06-4493。 10.1158/0008-5472.CAN-06-4493。 [ 内政部 ] [ 公共医学 ] [ 谷歌学者 ]
6 Ben-Porath I、Thomson MW、Carey VJ、Ge R、Bell GW等。低分化侵袭性人类肿瘤中的胚胎干细胞样基因表达特征。 自然遗传学。 2008; 40(5):499–507. doi:10.1038/ng.127。 10.1038/ng.127。 [ 内政部 ] [ PMC免费文章 ] [ 公共医学 ] [ 谷歌学者 ]
7 Gupta PB,Chaffer CL,Weinberg RA。 癌症干细胞:幻影还是现实? 2009年《国家医学》; 15(9):1010–1012. doi:10.1038/nm0909-1010。 10.1038/nm0909-1010。 [ 内政部 ] [ 公共医学 ] [ 谷歌学者 ]
8 Onder TT、Gupta PB、Mani SA、Yang J、Lander ES等。E-cadherin缺失通过多种下游转录途径促进转移。 癌症研究2008; 68(10):3645–3654. doi:10.1158/0008-5472.CAN-07-2938。 10.1158/0008-5472.CAN-07-2938。 [ 内政部 ] [ 公共医学 ] [ 谷歌学者 ]
9 Mani SA、Guo W、Liao MJ、Eaton EN、Ayyanan A等。上皮-间充质转化产生具有干细胞特性的细胞。 细胞。 2008; 133(4):704–715. doi:10.1016/j.cell.2008.03.027。 2016年10月10日/j.cell.2008.03.027。 [ 内政部 ] [ PMC免费文章 ] [ 公共医学 ] [ 谷歌学者 ]
10 Kalluri R,温伯格RA。 上皮-间充质转化的基础。 临床投资杂志。 2009; 119(6):1420–1428. doi:10.1172/JCI39104。 10.1172/JCI39104。 [ 内政部 ] [ PMC免费文章 ] [ 公共医学 ] [ 谷歌学者 ]
11 Gupta PB、Onder TT、Jiang G、Tao K、Kuperwasser C等。通过高通量筛选鉴定肿瘤干细胞的选择性抑制剂。 细胞。 2009; 138(4):645–659. doi:10.1016/j.cell.2009.06.034。 2016年10月10日/j.cell.2009.06.034。 [ 内政部 ] [ PMC免费文章 ] [ 公共医学 ] [ 谷歌学者 ]
12 Streuli CH、Bailey N、Bissell MJ。 乳腺上皮分化的控制:基底膜在缺乏细胞间相互作用和形态极性的情况下诱导组织特异性基因表达。 细胞生物学杂志。 1991; 115(5):1383–1395。 doi:10.1083/jcb.115.51383。 [ 内政部 ] [ PMC免费文章 ] [ 公共医学 ] [ 谷歌学者 ]
13 Streuli CH、Schmidhauser C、Bailey N、Yurcenco P、Skubitz AP等。层粘连蛋白介导乳腺上皮组织特异性基因表达。 细胞生物学杂志。 1995; 129(3):591–603. doi:10.1083/jcb.129.3.591。 [ 内政部 ] [ PMC免费文章 ] [ 公共医学 ] [ 谷歌学者 ]
14 Dontu G、Al-Hajj M、Abdallah WM、Clarke MF、Wicha MS。正常乳腺发育和乳腺癌中的干细胞。 细胞增殖。 2003; 36(补充1):59–72。 doi:10.1046/j.1365-2184.36.s.1.6.x。 [ 内政部 ] [ PMC免费文章 ] [ 公共医学 ] [ 谷歌学者 ]
15 Miki J,Furusato B,Li H,Gu Y,Takahashi H,et al.在hTERT-永生化原发性非恶性肿瘤和恶性肿瘤衍生的人类前列腺上皮细胞系和前列腺癌标本中鉴定假定的干细胞标记物CD133和CXCR4。 癌症研究2007; 67(7):3153–3161. doi:10.1158/0008-5472.CAN-06-4429。 10.1158/0008-54472.CAN-06-4429。 [ 内政部 ] [ 公共医学 ] [ 谷歌学者 ]
16 Fata JE、Werb Z、Bissell MJ。 细胞外基质及其重塑酶对乳腺分支形态发生的调节。 2004年乳腺癌研究; 6(1):1–11. doi:10.1186/bcr634。 10.1186/bcr634。 [ 内政部 ] [ PMC免费文章 ] [ 公共医学 ] [ 谷歌学者 ]
17 Simian M、Hirai Y、Navre M、Werb Z、Lochter A等。基质金属蛋白酶、形态因子和生长因子的相互作用对于乳腺上皮细胞的分支是必要的。 发展。 2001; 128(16):3117–3131. doi:10.12242/周五.128.16.3117。 [ 内政部 ] [ PMC免费文章 ] [ 公共医学 ] [ 谷歌学者 ]
18 Lee GY、Kenny PA、Lee EH、Bissell MJ。 正常和恶性乳腺上皮细胞的三维培养模型。 自然方法。 2007; 4(4):359–365. doi:10.1038/nmeth1015。 10.1038/nmeth1015。 [ 内政部 ] [ PMC免费文章 ] [ 公共医学 ] [ 谷歌学者 ]
19 Kenny PA、Lee GY、Myers CA、Neve RM、Semeiks JR等。三维分析中乳腺癌细胞系的形态与其基因表达谱相关。 Mol Oncol公司。 2007; 1(1):84–96. doi:10.1016/j.moloc.2007.02.004。 10.1016/j.molonc.2007.02.004。 [ 内政部 ] [ PMC免费文章 ] [ 公共医学 ] [ 谷歌学者 ]
20 Han J,Chang H,Giricz O,Lee GY,Baehner FL等。3D培养中乳腺癌细胞系3D形态发生的分子预测因子。 公共科学图书馆计算生物学。 2010; 6(2):e1000684。 doi:10.1371/journal.pcbi.1000684。 10.1371/journal.pcbi.1000684。 [ 内政部 ] [ PMC免费文章 ] [ 公共医学 ] [ 谷歌学者 ]
21 Martin KJ、Patrick DR、Bissell MJ、Fournier MV。通过3D培养模型识别的乳腺癌预后特征可准确预测独立数据集的临床结果。 公共科学图书馆一号。 2008; 3(8):e2994。 doi:10.1371/journal.pone.0002994。 10.1371/journal.pone.0002994。 [ 内政部 ] [ PMC免费文章 ] [ 公共医学 ] [ 谷歌学者 ]
22 Spencer VA、Xu R、Bissell MJ。 第三维度的基因表达:ECM-核连接。 乳腺生物肿瘤杂志。 2010; 15(1):65–71. doi:10.1007/s10911-010-9163-3。 2007年10月10日/10911-010-9163-3。 [ 内政部 ] [ PMC免费文章 ] [ 公共医学 ] [ 谷歌学者 ]
23 Friedl P,Wolf K。细胞迁移的可塑性:多尺度调谐模型。 细胞生物学杂志。 2010; 188(1):11–19. doi:10.1083/jcb.200909003。 10.1083/jcb.200909003。 [ 内政部 ] [ PMC免费文章 ] [ 公共医学 ] [ 谷歌学者 ]
24 Friedl P,Wolf K。《试管旅行:蛋白酶在个体和集体癌细胞侵袭中的作用》。 癌症研究2008; 68(18):7247–7249. doi:10.1158/0008-5472.CAN-08-0784。 10.1158/0008-5472.CAN-08-0784。 [ 内政部 ] [ 公共医学 ] [ 谷歌学者 ]
25 Wolf K,Mazo I,Leung H,Engelke K,von Andrian UH等。肿瘤细胞迁移的补偿机制:细胞周蛋白水解阻断后的间充质变形虫转变。 细胞生物学杂志。 2003; 160(2):267–277. doi:10.1083/jcb.200209006。 10.1083/jcb.200209006。 [ 内政部 ] [ PMC免费文章 ] [ 公共医学 ] [ 谷歌学者 ]
26 Brekhman V,Neufeld G.用于肿瘤细胞侵袭研究的新型不对称三维体外试验。 BMC癌症。 2009; 9:415. doi:10.1186/1471-2407-9-415。 10.1186/1471-2407-9-415. [ 内政部 ] [ PMC免费文章 ] [ 公共医学 ] [ 谷歌学者 ]
27 Gaggioli C、Hooper S、Hidalgo-Carcedo C、Grosse R、Marshall JF等。成纤维细胞导致的癌细胞集体侵袭,RhoGTPase在主导细胞和后续细胞中的作用不同。 自然细胞生物学。 2007; 9(12):1392–1400. doi:10.1038/ncb1658。 10.1038/ncb1658。 [ 内政部 ] [ 公共医学 ] [ 谷歌学者 ]
28 Wolf K、Alexander S、Schacht V、Coussens LM、von Andrian UH等。体内外基于胶原蛋白的细胞迁移模型。 精液细胞开发生物学。 2009; 20(8):931–941. doi:10.1016/j.semcdb2009.08.005。 2016年10月10日/j.semcdb2009.08.005。 [ 内政部 ] [ PMC免费文章 ] [ 公共医学 ] [ 谷歌学者 ]
29 Yang J,Weinberg RA。 上皮-间充质转化:处于发育和肿瘤转移的十字路口。 开发单元。 2008; 14(6):818–829. doi:10.1016/j.devcel.2008.05.009。 2016年10月10日/j.devcel.2008.05.009。 [ 内政部 ] [ 公共医学 ] [ 谷歌学者 ]
30 Diehn M,Clarke MF。肿瘤干细胞与放射治疗:肿瘤放射抗性的新见解。 2006年国家癌症研究所杂志; 98(24):1755–1757. doi:10.1093/jnci/jj505。 10.1093/jnci/djj505。 [ 内政部 ] [ 公共医学 ] [ 谷歌学者 ]
31 Kurrey NK、Jalgankar SP、Joglekar AV、Ghanate AD、Chaskar PD等。蜗牛和蛞蝓通过拮抗p53介导的凋亡和在卵巢癌细胞中获得干样表型来介导放射和化疗耐药性。 干细胞。 2009; 27(9):2059–2068. doi:10.1002/stem.154。 10.1002/第154项。 [ 内政部 ] [ 公共医学 ] [ 谷歌学者 ]
32 Kenny PA、Lee GY、Bissell MJ。 针对肿瘤微环境。 Front Biosci公司。 2007; 12:3468–3474. doi:10.2741/2327。 [ 内政部 ] [ PMC免费文章 ] [ 公共医学 ] [ 谷歌学者 ]
33 Medjkane S、Perez-Sanchez C、Gaggioli C、Sahai E、Treisman R.肌球蛋白相关转录因子和SRF是细胞骨架动力学和实验性转移所必需的。 自然细胞生物学。 2009; 11(3):257–268. doi:10.1038/ncb1833。 10.1038/ncb1833。 [ 内政部 ] [ PMC免费文章 ] [ 公共医学 ] [ 谷歌学者 ]
34 Leivonen SK、Makela R、Ostling P、Kohonen P、Haapa-Paananen S等。蛋白质裂解物微阵列分析,以确定乳腺癌细胞系中调节雌激素受体信号的微RNA。 致癌物。 2009; 28(44):3926–3936. doi:10.1038/onc.2009.241。 10.1038/2009年1月24日。 [ 内政部 ] [ 公共医学 ] [ 谷歌学者 ]
35 Fournier MV、Martin KJ、Kenny PA、Xhaja K、Bosch I等。乳腺腺泡组织和生长受限的基因表达特征预测乳腺癌的良好预后。 2006年癌症研究; 66(14):7095–7102. doi:10.1158/008-5472.CAN-06-0515。 10.1158/0008-5472.CAN-06-0515。 [ 内政部 ] [ PMC免费文章 ] [ 公共医学 ] [ 谷歌学者 ]
36 Weeraratna AT、Jiang Y、Hostetter G、Rosenblatt K、Duray P等。Wnt5a信号直接影响细胞运动和转移性黑色素瘤的侵袭。 癌细胞。 2002; 1(3):279–288. doi:10.1016/s1535-6108(02)00045-4。 [ 内政部 ] [ 公共医学 ] [ 谷歌学者 ]
37 Kawano Y、Diez S、Uysal-Onganer P、Darrington RS、Waxman J等。分泌型卷曲相关蛋白-1是前列腺癌雄激素受体活性的负调节因子。 英国癌症杂志。 2009; 100(7):1165–1174. doi:10.1038/sj.bjc.6604976。 10.1038/sj.bjc.6604976。 [ 内政部 ] [ PMC免费文章 ] [ 公共医学 ] [ 谷歌学者 ]
38 Suzuki K、Obara K、Kobayashi K、Yamana K、Bilim V等。结缔组织生长因子在培养的人前列腺基质细胞中纤维连接蛋白合成中的作用。 泌尿学。 2006; 67(3):647–653. doi:10.1016/j.urology.2005.10.013。 10.1016/j.泌尿外科.2005.10.13。 [ 内政部 ] [ 公共医学 ] [ 谷歌学者 ]
39 Dubrovska A,Kim S,Salamone RJ,Walker JR,Maira SM等人PTEN/Akt/PI3K信号在前列腺癌干细胞群维持和生存中的作用。 美国国家科学院院刊2009; 106(1):268–273. doi:10.1073/pnas.0810956106。 10.1073/pnas.0810956106。 [ 内政部 ] [ PMC免费文章 ] [ 公共医学 ] [ 谷歌学者 ]
40 王浩,夸SY,董继明,曼瑟E,唐继平,等。PRL-3通过PI3K下调PTEN表达和信号,促进上皮-间质转化。 癌症研究2007; 67(7):2922–2926. doi:10.1158/0008-5472.CAN-06-3598。 10.1158/0008-5472.CAN-06-3598。 [ 内政部 ] [ 公共医学 ] [ 谷歌学者 ]
41 Kilpinen S、Autio R、Ojala K、Iljin K、Bucher E等。对175种健康和病理组织9783个样本中17330个人类基因的表达水平进行系统生物信息学分析。 基因组生物学。 2008; 9(9):R139。 doi:10.1186/gb-2008-9-9-r139。 10.1186/gb-2008-9-9-r139。 [ 内政部 ] [ PMC免费文章 ] [ 公共医学 ] [ 谷歌学者 ]
42 Bjorkman M、Iljin K、Halonen P、Sara H、Kaivanto E等。定义HDAC抑制剂的分子作用以及与雄激素缺乏在ERG-阳性前列腺癌中的协同作用。 国际癌症杂志。 2008; 123(12):2774–2781. doi:10.1002/ijc.23885。 10.1002/ijc.23885。 [ 内政部 ] [ 公共医学 ] [ 谷歌学者 ]
43 van Bokhoven A、Varella-Garcia M、Korch C、Johannes WU、Smith EE等。人类前列腺癌细胞系的分子特征。 前列腺。 2003; 57(3):205–225. doi:10.1002/pros.10290。 10.1002/pros.10290。 [ 内政部 ] [ 公共医学 ] [ 谷歌学者 ]
44 Bisson I,Prowse DM。WNT信号调节具有干细胞特征的前列腺癌细胞的自我更新和分化。 细胞研究2009; 19(6):683–697. doi:10.1038/cr.2009.43。 10.1038/cr.2009.43。 [ 内政部 ] [ 公共医学 ] [ 谷歌学者 ]
45 Wang S.前列腺癌干细胞的非锚定生长。 方法分子生物学。 2009; 568:151–160. doi:10.1007/978-1-59745-280-99。 10.1007/978-1-59745-280-9_9. [ 内政部 ] [ 公共医学 ] [ 谷歌学者 ]
46 Birnie R、Bryce SD、Roome C、Dussup V、Droop A等。人类前列腺癌干细胞的基因表达谱揭示了促炎表型和细胞外基质相互作用的重要性。 基因组生物学。 2008; 9(5):R83。 doi:10.1186/gb-2008-9-5-r83。 10.1186/gb-2008-9-5-r83。 [ 内政部 ] [ PMC免费文章 ] [ 公共医学 ] [ 谷歌学者 ]
47 Guzman-Ramirez N,Voller M,Wetterwald A,Germann M,Cross NA等。人前列腺癌组织中肿瘤干/祖样细胞的体外增殖和特征。 前列腺。 2009; 69(15):1683–1693. doi:10.1002/第21018页。 10.1002/pros.21018。 [ 内政部 ] [ 公共医学 ] [ 谷歌学者 ]
48 比塞尔·M·米纳·比塞尔:语境决定一切。 [本·肖特的采访]。 细胞生物学杂志。 2009; 185(3):374–375. doi:10.1083/jcb.1853pi。 10.1083/jcb.1853pi。 [ 内政部 ] [ PMC免费文章 ] [ 公共医学 ] [ 谷歌学者 ]
49 Liu H,Radisky DC,Nelson CM,Zhang H,Fata JE,等。Akt1抑制乳腺癌细胞侵袭的机制揭示了TSC2的促肿瘤作用。 美国国家科学院院刊2006; 103(11):4134–4139. doi:10.1073/pnas.0511342103。 10.1073/pnas.0511342103。 [ 内政部 ] [ PMC免费文章 ] [ 公共医学 ] [ 谷歌学者 ]
50 Majumder PK,Sellers WR。 前列腺癌中的Akt调节通路。 致癌物。 2005; 24(50):7465–7474. doi:10.1038/sj.onc.1209096。 10.1038/sj.onc.1209096。 [ 内政部 ] [ 公共医学 ] [ 谷歌学者 ]
51 Chu JH,Yu S,Hayward SW,Chan FL.前列腺上皮细胞三维培养模型的建立及其在前列腺癌上皮-间质转化和PI3K通路抑制研究中的应用。 前列腺。 2009; 69(4):428–442. doi:10.1002/pros.20897。 10.1002/pros.20897。 [ 内政部 ] [ 公共医学 ] [ 谷歌学者 ]
52 Iliopoulos D、Hirsch HA、Struhl K。涉及NF-kappaB、Lin28、let-7 MicroRNA和IL6的表观遗传开关将炎症与细胞转化联系起来。 细胞。 2009年doi:10.1016/j.cell.2009.10.014。 2016年10月10日/j.cell.2009.10.014。 [ 内政部 ] [ PMC免费文章 ] [ 公共医学 ] [ 谷歌学者 ]
53 Rizki A、Weaver VM、Lee SY、Rozenberg GI、Chin K等。人类乳腺细胞浸润前向浸润过渡模型。 癌症研究2008; 68(5):1378–1387. doi:10.1158/0008-5472.CAN-07-2225。 10.1158/0008-5472.CAN-07-2225。 [ 内政部 ] [ PMC免费文章 ] [ 公共医学 ] [ 谷歌学者 ]
54 Sanz-Moreno V、Gadea G、Ahn J、Paterson H、Marra P等。Rac激活和失活控制肿瘤细胞运动的可塑性。 细胞。 2008; 135(3):510–523. doi:10.1016/j.cell.2008.09.043。 2016年10月10日/j.cell.2008.09.043。 [ 内政部 ] [ 公共医学 ] [ 谷歌学者 ]
55 Alcaraz J,Xu R,Mori H,Nelson CM,Mroue R等。层粘连蛋白和仿生细胞外弹性增强乳腺上皮的功能分化。 EMBO J.2008; 27(21):2829–2838. doi:10.1038/embj.2008.206。 10.1038/emboj.2008.206年。 [ 内政部 ] [ PMC免费文章 ] [ 公共医学 ] [ 谷歌学者 ]
56 Kurrey NK、KA、Bapat SA。蜗牛和蛞蝓是转录水平上卵巢癌侵袭性的主要决定因素。 妇科肿瘤。 2005; 97(1):155–165. doi:10.1016/j.ygyno.2004.12.043。 2016年10月10日/j.ygyno.2004.12.043。 [ 内政部 ] [ 公共医学 ] [ 谷歌学者 ]
57 Friedl P,Wolf K。肿瘤细胞的入侵和迁移:多样性和逃逸机制。 Nat Rev癌症。 2003; 3(5):362–374. doi:10.1038/nrc1075。 10.1038/nrc1075。 [ 内政部 ] [ 公共医学 ] [ 谷歌学者 ]
58 Klarmann GJ、Hurt EM、Mathews LA、Zhang X、Duhagon MA等。侵袭性前列腺癌细胞是具有干细胞样基因组特征的肿瘤起始细胞。 临床实验转移。 2009; 26(5):433–446. doi:10.1007/s10585-009-9242-2。 10.1007/s10585-009-9242-2。 [ 内政部 ] [ PMC免费文章 ] [ 公共医学 ] [ 谷歌学者 ]
59 Ke XS,Qu Y,Goldfinger N,Rostad K,Hovland R,等。具有细胞粘附模块开关但无恶性转化的初级前列腺细胞系的上皮-间充质转化。 公共科学图书馆一号。 2008; 3(10):e3368。 doi:10.1371/journal.pone.0003368。 10.1371/journal.pone.0003368。 [ 内政部 ] [ PMC免费文章 ] [ 公共医学 ] [ 谷歌学者 ]
60 Shah GV、Muralidharan A、Gokulgandhi M、Soan K、Thomas S.Cadherinβ-catenin信号转导的转换和激活是前列腺癌降钙素-降钙素受体轴促侵袭作用的基础。 生物化学杂志。 2009; 284(2):1018–1030. doi:10.1074/jbc。 M807823200。10.1074/jbc。 M807823200。 [ 内政部 ] [ PMC免费文章 ] [ 公共医学 ] [ 谷歌学者 ]
61 Yang J、Mani SA、Weinberg RA。 探索肿瘤转移的新转折点。 2006年癌症研究; 66(9):4549–4552. doi:10.1158/0008-5472.CAN-05-3850。 10.1158/0008-5472.CAN-05-3850。 [ 内政部 ] [ 公共医学 ] [ 谷歌学者 ]
62 Wallerand H、Robert G、Pasticier G、Ravaud A、Ballanger P等。上皮-间质转化诱导因子TWIST是晚期和/或转移性膀胱癌和前列腺癌的一个有吸引力的靶点()。 Urol Oncol公司。 2009年doi:10.1016/j.urolonc.2008.12.018。 10.1016/j.urolonc.2008.12.018。 [ 内政部 ] [ 公共医学 ] [ 谷歌学者 ]
63 Turley EA、Veiseh M、Radisky DC、Bissell MJ。 疾病机制:上皮-间充质转化-细胞可塑性是否促进肿瘤进展? Nat Clin Pract肿瘤。 2008; 5(5):280–290. doi:10.1038/ncponc1089。 10.1038/ncponc1089。 [ 内政部 ] [ PMC免费文章 ] [ 公共医学 ] [ 谷歌学者 ]
64 Carmona-Fontine C、Matthews HK、Kuriyama S、Moreno M、Dunn GA等。体内运动接触抑制控制神经嵴定向迁移。 自然。 2008; 456(7224):957–961. doi:10.1038/nature07441。 10.1038/nature07441。 [ 内政部 ] [ PMC免费文章 ] [ 公共医学 ] [ 谷歌学者 ]
65 Carmona-Fontine C,Matthews H,Mayor R.体内细胞定向迁移:Wnt处于顶峰。 细胞Adh Migr。 2008; 2(4):240–242. doi:10.4161凸轮.2.4.6747。 [ 内政部 ] [ PMC免费文章 ] [ 公共医学 ] [ 谷歌学者 ]
关联数据
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补充资料
图S1 将未转化/永生化的EP156T细胞和PrCa细胞(细胞系DU145和PC-3)嵌入纯化的胶原蛋白(左面板,PureCol;鼠尾胶原蛋白I)或生长因子减少的Matrigel(右面板)后,形成形态不同的多细胞结构。 通过相控显微镜(每块面板的右侧)对结构进行成像,并用Alexa488-结合的卵磷脂染色,以通过F-actin突出细胞骨架(左侧)。
(6.22 MB TIF)
图S2 3D Matrigel培养中形成的球体的典型共焦激光扫描图像,用层粘连蛋白β1(LAMB1)抗体染色,以突出Matrigel中形成的结构周围基底层(BL)的形成。 圆形结构总是有一个完整、坚固的BL围绕着整个球体。 质量表型球体通常具有薄的、异质的和不完整的BL。星形结构显示出可变的、通常模糊的BL结构,侵袭细胞周围也有一层薄BL。 葡萄状结构没有任何可识别的BL。单表型细胞显示层粘连蛋白的斑点状、不规则表达。
(7.45 MB畅通节能法)
图S3 与上皮-间充质转化(EMT)相关的标记物和转录因子分析。 A) 上皮特异性钙粘蛋白CDH1(E-钙粘蛋白)与间充质特异性钙粘蛋白CDH2(N-钙粘蛋白)在所有细胞系中的表达,在单层和3D培养中。 CDH2在PC-3和PC-3M中高表达,并在RWPE-1细胞中与CDH1共同表达。 B) Illumina微珠阵列检测到的PrCa细胞系中一组上皮和间质特异性钙粘蛋白和EMT相关转录因子的正常基因表达值。 C) CDH1(E-cadherin)在由非转化hTERT永生化EP156T细胞(强而均匀)、永生化RWPE-1细胞(异质性,圆形结构强但分支腺泡阴性)和PC-3(阴性)形成的球体中的表达。
(2.85 MB畅通节能法)
图S4 利用与六种最密切相关的前列腺癌相关通路(AKT、PI3-激酶、IGF1受体、mTOR、S6激酶和PTEN)相关的基因特征对基因表达模式进行功能分析。 A) 根据Biocompare的汇编,基因签名的组成( www.biocompare.com ). B) 维恩图,显示AKT、PI3-激酶和mTOR通路相关基因之间的重叠。 C) 热图,突出显示了圆形转化为星形球体后,PC-3细胞中联合通路分析中最强烈的侵袭相关上调基因的表达。 D) 通过expO基因表达联合体分析的PrCa微阵列样品中胶原蛋白1亚单位A1的示例性表达( 网址:www.intgen.org ),表明表达与临床参数如晚期、高级别肿瘤和高Gleason评分呈正相关。 插入物显示了与前列腺癌相比,正常前列腺中COL1A1 mRNA的相对表达(IST数据库, www.genesapiens.org网站 ).
(1.93 MB畅通节能法)
图S5 使用VTT ACCA图像分析软件定量分析抑制药物对正常、非转化和癌细胞系的球体生长(像素面积)的影响。 药物、有效浓度和化合物抑制的主要途径如图(文本框)所示。
(1.02 MB TIF)
表S1 本研究中使用的细胞系和模型。
(0.07 MB文件)
表S2 本研究中使用的抗体。
(0.06 MB文件)
表S3 3D Matrigel培养中形成的球体的免疫染色结果总结。
(0.10 MB文件)
表S4 基因表达簇1-12的基因本体注释。 只显示了最显著的富集因子和错误发现率(FDR)。
(0.18 MB文件)
表S5 基因集富集分析GSEA,(A)在所分析的所有10个细胞系中,针对单层与Matrigel三维球体培养中差异表达的基因,以及(B)针对PC3细胞中差异表达基因的GSEA,比较圆形(第4+8天)与星状形态(第13+15天)。
(0.16 MB文件)
表S6 Matrigel中2D单层和3D球体培养中差异表达基因的灵巧路径分析(IPA)(一般效应,10个细胞系),以及PC3细胞中差异表达的基因的B)IPA,比较圆形(第4+8天)和星状形态(第13+15天)。
(0.06 MB文件)
表S7 本研究中使用的小分子抑制剂和药物治疗概述,针对功能基因表达分析确定的典型途径。 缩写:IB=侵入阻滞; IAM=腺泡形态发生受损; GR=生长减少; GA=生长停滞; CD=细胞死亡。
(0.16 MB文件)
电影S1 实时细胞图像生成的延时电影(1图像/h),显示PC-3细胞形成圆形球体。 电影序列大约在播入Matrigel后的第8天开始。 接种后大约11至13天,圆形球体转变为星形结构。
(1055百万英里/平方英寸)