包括EZH2在内的多梳组蛋白质在控制重要的细胞过程中发挥主要调节作用,例如维持干细胞多能性(1–三),细胞增殖(4,5),早期胚胎发生(6)和X染色体失活(7). EZH2在一种称为多梳抑制复合物2(PRC2)的多蛋白复合物中发挥作用,该复合物包括SUZ12(Zeste 12抑制剂)和EED(胚胎外胚层发育)(8,9). EZH2蛋白复合物的主要活性是在靶基因启动子处合成三甲基组蛋白H3赖氨酸27(H3K27),导致表观遗传沉默(10,11). 越来越多的证据表明,EZH2具有与癌基因一致的特性,因为过度表达促进细胞增殖、集落形成和增加良性细胞的侵袭在体外(4,5,12)并诱导异种移植瘤生长体内(13). 同样,癌细胞中EZH2的敲低导致生长停滞(4,13)以及肿瘤生长减少(10)和转移体内(14).
最初发现EZH2在一组侵袭性、临床局限性前列腺癌和几乎所有转移性前列腺癌中升高(4). 随后发现EZH2在乳腺癌中异常过度表达(12)、黑色素瘤(15),膀胱癌(16),胃癌(17)和其他癌症(5). 因此,虽然EZH2在侵袭性实体瘤中广泛过度表达,并且具有癌基因的特性,但癌症中EZH2-升高的遗传机制尚不清楚。
作为基因表达的调节器,microRNAs(miRNAs)受到了广泛关注(18)在细胞分化和胚胎干细胞发育中发挥重要作用(19),我们推测它们可能在调节EZH2表达中发挥作用。为了测试miRNAs是否在控制EZH2表达中发挥作用,我们通过计算指定了那些可能有助于EZH2型监管。由于已经确定将多个预测算法的结果交叉可以提高特异性,但代价是降低灵敏度(20),我们选择整合预测程序PicTar的结果(21),目标扫描(22),米兰达(23)和MiRInspert(24). 总的来说,任何计划都只发现了29个miRNAsEZH2型而所有四个程序都发现只有miR-101和miR-217可以调节EZH2型(图1A和表S1) (25). 此外,PicTar、miRanda和TargetScan预测了EZH2型3英尺UTR(图1B)而PicTar和TargetScan预测了两个miR-217结合位点EZH2型3英尺UTR。在预测的34个miRNAs中,至少通过一个程序调节EZH2(表S1),只有miR-101与前列腺癌从良性到局限性疾病再到转移的进展呈强烈负相关(如下文所述图4A).
检测miR-101是否可以调节EZH2型,我们产生了编码EZH2 3’UTR的正常、反义和突变版本的萤光素酶报告子。miR-101而非miR-217或对照miRNA的过度表达降低了编码EZH2 3'UTR的荧光素酶报告子的活性(图S1). 同样,miR-101也不抑制反义和突变的EZH2 3'UTR活性。为了测试miR-101的3'UTR结合是否导致EZH2型转录本,我们用miR-101、miR-217的前体转染SKBr3乳腺癌细胞(表达高水平内源性EZH2),控制miRNA以及其他几个无关的miRNA。qRT-PCR明确显示EZH2型miR-101的转录水平(图1C),但不是miR-217或其他对照miR。
为了确定miR-101是否抑制EZH2蛋白表达,我们使用EZH2-特异性抗体以及其他PRC2成员的抗体(包括EED和SUZ12)进行免疫印迹分析(图1D). 除miR-101外,我们还包括其他预测调控EZH2的miRNAs,包括miR-217和miR-26a。对照miR-495通过TargetScan预测为靶向PRC1组分BMI-1。只有miR-101和EZH2 siRNA减弱了EZ82蛋白的表达。有趣的是,miR-101过度表达还导致PRC2复合体EED中EZH2紧密结合伙伴的抑制,在较小程度上还导致SUZ12的抑制。这些蛋白质被认为形成一种共同调节的功能复合物,改变其中一种蛋白质的表达会影响其他蛋白质的表达(5,26,27). 在这种特殊情况下,进一步检查PRC2组分的3'UTR后,发现miR-101结合位点位于种子(图S2)但不在SUZ12型由于已知miRNA可调节多个靶基因,在某些情况下可调节数百个基因(18),我们使用预测算法TargetScan指定miR-101的目标。除EZH2和EED外,我们还测试了4个miR-101预测靶点(表S2)与癌症途径有关,包括n-Myc、c-Fos、ARID1A和FBN2。重要的是,这些假定的miR-101靶点都没有受到miR-101过度表达的影响(图1D). 为了支持miR-101过表达实验的结果,我们采用了antagomiR技术(28)特异性抑制良性永生化乳腺上皮细胞中miR-101的表达(图S3). miR101(i和ii)的两个独立抗gomiR诱导良性乳腺上皮细胞中EZH2蛋白的表达。
虽然我们有强有力的证据表明miR-101调节EZH2的表达,但我们想确定它是否影响EZH2和PRC2的功能。为了实现这一目标,我们评估了细胞增殖,这一特性已知受EZH2调节(4,5). miR-101在SKBr3和DU145细胞中过度表达显著抑制细胞增殖(图2A,图S4). 重要的是,EZH2的过度表达(无内源性3'UTR)挽救了miR-101对细胞生长的抑制,表明其具有靶向特异性。
此前,我们在基质凝胶包被的基底膜侵袭试验中表明,过表达后,EZH2可以诱导细胞侵袭(12). 这里我们显示miR-101过度表达显著抑制在体外DU145前列腺癌细胞的侵袭潜能(图2B)和SKBr3乳腺癌细胞(图S5). 类似地,miR-101在DU145细胞中的稳定表达显示EZH2型表达和减少侵袭(图S6A,B). EZH2的过度表达,挽救了miR-101介导的抑制作用。另一个在体外miR-101也抑制了癌症潜能的读出,即细胞迁移增加(图S7). 由于miR-101的过度表达会减弱癌症的侵袭性,因此抑制miR-101应该会增强这种肿瘤表型。当转染到良性永生化乳腺上皮细胞系H16N2或HME中时,两个靶向miR-101(i和ii)的独立抗gomiR诱导了侵袭性表型(图2C,图S8).
为了评估miR-101是否抑制凤尾鱼非依赖性生长,我们采用了软琼脂试验。与亲代细胞或载体对照组相比,稳定过度表达miR-101的DU145前列腺癌细胞的集落形成显著减少(图S9). 此外,体内表达miR-101的DU145细胞的生长速度明显慢于载体对照异种移植物(p=0.0001,图2D)证明miR-101在这些特定的分析中具有与肿瘤抑制剂一致的特性。
由于已知EZH2和PRC2通过三甲基化H3K27调节基因表达,我们假设miR-101过度表达会导致癌细胞中H3K37三甲基化整体水平降低。用miR-101或EZH2 siRNA转染SKBr3乳腺癌和DU145前列腺癌细胞7天后,三甲基H3K27水平总体下降(图S10A). miR-101对H3K27甲基化的影响可以通过EZH2的过度表达来抵消(图S10B).
为了测试H3K27组蛋白标记的启动子占用水平,我们对过度表达miR-101的癌细胞进行了染色质免疫沉淀(ChIP)分析。我们发现已知PRC2靶基因(如ADRB2、DAB2IP、CIITA和WNT1型在miR-101过表达的SKBr3细胞和EZH2 siRNA处理的细胞中(图3A,图S11). 为了测试H3K27降低启动子占用率是否会导致基因表达同时降低,我们对ChIP检测的PRC2靶点进行了qRT-PCR。正如预期的那样,miR-101和EZH2 siRNA处理的细胞中目标基因表达显著增加(图3B). 为了进一步探索miR-101对EZH2的调控,并测试与EZH2-特异性RNA干扰的相似性,我们测试了miR-101的过度表达和EZH2型敲除产生了类似的基因表达谱。为了评估这一点,我们对转染miR-101或EZH2 siRNA双链体的SKBr3细胞进行了基因表达阵列分析。在miR-101和EZH2 siRNA转染细胞中,在2倍阈值下过度表达的基因显著重叠(p=6.08e-17)(图S12). 同样,那些被抑制的基因也有显著重叠(p=3.24e-27)。
接下来,我们想确定miR-101的表达是否与人类肿瘤中的EZH2水平呈负相关。对大多数公开的miRNA表达数据集进行的荟萃分析表明,miR-101在前列腺癌、乳腺癌、卵巢癌、肺癌和结肠癌中显著表达不足(表S3). EZH2最初被发现在一组侵袭性临床局限性前列腺癌中过度表达,在转移性疾病中几乎普遍升高(4),我们通过qPCR分析在前列腺癌进展的类似背景下检测miR-101(图4A,图S13). 正如预期的那样,与临床局限性疾病或良性邻近前列腺组织相比,转移性前列腺癌表达的EZH2水平显著升高(p<0.0001)。与miR-101和EZH2之间的功能联系一致,相对于临床局限性疾病或良性邻近前列腺组织,转移性前列腺癌中miR-101的表达显著降低(p<0.0001)。重要的是,miR-217与miR-101一样被预测可以调节EZH2,在转移性疾病和临床局限性前列腺癌或良性前列腺之间没有显著差异(分别为p=0.35和0.13)。
为了研究前列腺癌进展中miR-101转录缺失的机制,我们对miR-101进行了定量基因组PCR。值得注意的是,miR-101有两个基因组位点,分别位于第1号染色体(miR-101-1)和第9号染色体(miR-101-2)上(图S14A、B). 基于基因组PCR,16例临床定位前列腺癌中有2例和33例转移性前列腺癌中17例显示miR-101-1基因座缺失(图4B). 同样,16例临床局限性前列腺癌中的4例和33例转移性前列腺癌的8例显示miR-101-2缺失(图4B).图4C显示了匹配样品的热图表示,其中miR-101转录物,EZH2型对转录本、miR-101-1基因组位点和miR-101-2基因组位点进行监测。EZH2型在前列腺癌进展至转移期间,转录水平与miR-101转录水平呈负相关(p<0.0001)。EZH2型在miR-101-1或miR-101-2基因组位点表现出拷贝数丢失的样本中,倾向于均匀升高(p=0.004,排列测试)。
为了正式证明miR-101基因座的基因组丢失在本质上是体细胞性的,我们鉴定了9例转移性前列腺癌,其表现为miR-101-1的丢失,并从匹配的正常组织中获得了DNA。正如预期的那样,与匹配的正常组织相比,9例患者中有8例癌症中miR-101-1拷贝数的相对水平显著降低(图4D). 为了将我们的发现扩展到其他癌症,我们探索了多种肿瘤类型中miR-101的基因组丢失。我们使用一些实验平台证明了miR-101-1在乳腺癌、胃癌和前列腺癌亚群中的局灶性丢失(约20kB)(图S15–S17). 此外,我们探索了公共领域高密度阵列CGH和SNP阵列数据集,并观察到多形性胶质瘤、肺腺癌和急性淋巴细胞白血病亚群中一个或两个miR-101基因座的基因组丢失(补充文本,图S18).
miR-101由于其对EZH2的调节,可能对表观遗传途径有着深刻的控制,不仅在癌细胞中,而且在正常多能干胚胎细胞中都有活性。miR-101的过度表达可能会将癌细胞的组蛋白代码配置为更良性的表型。由于miR-101的缺失和伴随的EZH2的升高在转移癌中最为明显,我们假设miR-101缺失可能代表更具侵袭性疾病发展过程中的一种进行性分子损伤。将miR-101再导入肿瘤的方法可能通过将肿瘤细胞的表观遗传程序恢复到更正常的状态而具有治疗益处。
参考文献和注释
-
1Boyer LA等人,《自然》。2006年5月18日;441:349.[谷歌学者]
-
2Lee TI等人。Cell。2006年4月21日;125:301. doi:10.1016/j.cell.2006.02.043。[内政部] [PMC免费文章] [公共医学] [谷歌学者]
-
3Sher F等人,《干细胞》。2008年8月7日;[谷歌学者]
-
4Varambally S等人,《自然》。2002;419:624. doi:10.1038/nature01075。[内政部] [公共医学] [谷歌学者]
-
5Bracken AP等人,EMBO J.2003年10月15日;22:5323. doi:10.1093/emboj/cdg542。[内政部] [PMC免费文章] [公共医学] [谷歌学者]
-
6Erhardt S等人,《发展》。2003年9月;130:4235. doi:10.1242/dev.00625。[内政部] [公共医学] [谷歌学者]
-
7Plath K等人,《科学》。2003年4月4日;300:131. doi:10.1126/science.1084274。[内政部] [公共医学] [谷歌学者]
-
8曹锐,等,《科学》。2002;298:1039. doi:10.1126/science.1076997。[内政部] [公共医学] [谷歌学者]
-
9Kuzmichev A,Nishioka K,Erdjument-Bromage H,Tempst P,Reinberg D.基因开发,2002年11月15日;16:2893. doi:10.1101/gad.1035902。[内政部] [PMC免费文章] [公共医学] [谷歌学者]
-
10于杰,等。肿瘤细胞。2007年11月;12:419。doi:10.1016/j.ccr.2007.10.016。[内政部] [公共医学] [谷歌学者]
-
11曹强等。癌基因。2008[谷歌学者]
-
12Kleer CG等人,《美国科学院院刊》,2003年9月30日;100:11606. doi:10.1073/pnas.1933744100。[内政部] [PMC免费文章] [公共医学] [谷歌学者]
-
13宾夕法尼亚州克劳恩奎斯特,范·内斯·B·癌基因。2005年9月15日;24:6269. doi:10.1038/sj.onc.1208771。[内政部] [公共医学] [谷歌学者]
-
14Takeshita F等人,《美国科学院院刊》,2005年8月23日;102:12177. doi:10.1073/pnas.0501753102。[内政部] [PMC免费文章] [公共医学] [谷歌学者]
-
15巴赫曼·IM等人,《临床肿瘤学杂志》。2006年1月10日;24:268. doi:10.1200/JCO.2005.01.5180。[内政部] [公共医学] [谷歌学者]
-
16Weikert S等人,《国际分子医学杂志》,2005年8月;16:349.[公共医学] [谷歌学者]
-
17Matsukawa Y等人,《癌症科学》。2006年6月;97:484. doi:10.1111/j.1349-7006.2006.00203.x。[内政部] [PMC免费文章] [公共医学] [谷歌学者]
-
18Lewis BP、Burge CB、Bartel DP。单元格。2005年1月14日;120:15. doi:10.1016/j.cell.2004.12.035。[内政部] [公共医学] [谷歌学者]
-
19Marson A等人,《细胞》。2008年8月8日;134:521. doi:10.1016/j.cell.2008.07.020。[内政部] [PMC免费文章] [公共医学] [谷歌学者]
-
20Sethupathy P、Megraw M、Hatzigeorgiou AG.自然方法。2006年11月;3:881. doi:10.1038/nmeth954。[内政部] [公共医学] [谷歌学者]
-
21Krek A等人,《自然遗传学》。2005年5月;37:495. doi:10.1038/ng1536。[内政部] [公共医学] [谷歌学者]
-
22Lewis BP、Shih IH、Jones-Rhoades MW、Bartel DP、Burge CB。单元格。2003年12月26日;115:787. doi:10.1016/s0092-8674(03)01018-3。[内政部] [公共医学] [谷歌学者]
-
23John B等人,《公共科学图书馆·生物学》。2004年11月;2:e363。doi:10.1371/journal.pbio.0020363。[内政部] [PMC免费文章] [公共医学] [谷歌学者]
-
24Rusinov V,Baev V,Minkov IN,Tabler M.《核酸研究》,2005年7月1日;33:W696。doi:10.1093/nar/gki364。[内政部] [PMC免费文章] [公共医学] [谷歌学者]
-
25《科学在线》上提供了材料和方法。
-
26Pasini D、Bracken AP、Jensen MR、Lazzerini Denchi E、Helin K.Embo J.2004年10月13日;23:4061. doi:10.1038/sj.emboj.7600402。[内政部] [PMC免费文章] [公共医学] [谷歌学者]
-
27Fiskus W等人,Mol Cancer Ther。2006年12月;5:3096. doi:10.1158/1535-7163.MCT-06-0418。[内政部] [公共医学] [谷歌学者]
-
28Krutzfeldt J等人,《自然》。2005年12月1日;438:685. doi:10.1038/nature04303。[内政部] [公共医学] [谷歌学者]
-
29我们感谢Saravana M.Dhanasekaran、Scott Tomlins和Jianjun Yu的有益讨论,感谢Javed Siddiqui和Mithil Pandhi的技术援助。我们感谢吉尔·格兰杰和凯伦·贾尔斯批判性地阅读了这份手稿。A.M.C.获得了巴勒斯临床转化研究欢迎基金会奖的支持。这项工作得到了美国国立卫生研究院(前列腺SPORE P50CA69568至A.M.C.,早期检测研究网络(UO1 111275至A.M.C))和国防部(希望时代学者BC075023至A.M.C.PC051081至A.M.M.C.和S.V.,BC083217至J.C.B.)的部分支持。C.A.M.得到了NIH博士后培训拨款的支持,目前获得了美国癌症研究协会临床/转化研究Amgen奖学金、加那利基金会和美国癌症学会早期检测博士后奖学金的支持。本研究中使用的微阵列数据保存在NCBI基因表达总览(GEO)中,注册号为GSE13286。
关联数据
本节收集本文中包含的任何数据引用、数据可用性声明或补充材料。