帕金森病是一种与年龄相关的神经退行性疾病 约占全球人口的1%。 散发病例的病因尚不清楚, 尽管线粒体或氧化毒素 1-甲基-4-苯基吡啶,6-羟基多巴胺 (6-OHDA), 三 和 鱼藤酮在动物和细胞培养模型中的繁殖特征 ( 1 ). 中的异常 细胞中观察到线粒体呼吸和氧化应激增加 和帕金森病患者的组织 ( 2 , 三 ),也展示了 线粒体自噬增加 ( 4 ). 此外 帕金森病基因影响氧化应激反应途径和线粒体 体内平衡( 5 ). 因此, 线粒体内稳态的破坏是一个重要的影响因素 散发性和遗传性帕金森病(PD)的发病机制。
这个 停车场6 常染色体隐性遗传和早发性帕金森病相关基因座 PTEN诱导激酶1(PINK1)编码 ( 6 , 7 ). PINK1是一种细胞溶质 线粒体定位的581-氨基酸丝氨酸/苏氨酸激酶 具有N末端线粒体靶向序列 ( 6 , 8 ). 主要序列也 包括一个假定的跨膜结构域,对 PINK1域( 8 ),一个保守的 与钙钙调蛋白激酶同源的激酶结构域和C末端 调节自身磷酸化活性的结构域 ( 9 , 10 ). 的过度表达 野生型PINK1,但不是其PD-相关突变体,可以抵抗多种 神经细胞的毒性损伤 ( 6 , 11 , 12 ). 线粒体靶向 对某些人来说是必要的( 13 )但是 PINK1并非所有的神经保护作用 ( 14 ),意味着参与 调节线粒体病理生物学的细胞质靶点 ( 8 ). PINK1催化活性 是其神经保护作用所必需的,因为激酶缺乏的K219M PINK1的ATP结合袋中的替代品会使其丧失以下能力 保护神经元( 14 ). 尽管 PINK1突变似乎不会损害线粒体靶向,PD相关 突变会不同程度地破坏蛋白质的稳定性,导致 神经保护活性 ( 13 , 15 ).
最近的研究表明PINK1和Parkin在基因上相互作用 ( 三 , 16 - 18 ) 防止氧化应激 ( 19 , 20 )调节线粒体 形态学( 21 ). 初级电池 来自PINK1突变患者的线粒体断裂 HeLa细胞中RNA干扰研究重述的无组织嵴 ( 三 ).
线粒体被大量自噬降解,这一过程涉及 细胞质货物在膜自噬液泡中的隔离 用于输送到溶酶体( 22 , 23 ). 有趣的是, 线粒体分裂伴随自噬性神经变性 PD神经毒素6-OHDA( 24 , 25 ). 此外,线粒体 在神经退行性病变中观察到碎片化和自噬增加 包括阿尔茨海默病和帕金森病在内的疾病 ( 4 , 26 - 28 ). 尽管自噬体中包含线粒体曾被认为是一种 饥饿期间观察到的随机过程,涉及缺氧的研究, 线粒体损伤、凋亡刺激或限制需氧量 兼性厌氧菌中的底物支持选择性的概念 线粒体自噬 ( 29 , 30 ). 特别地, 线粒体定位激酶可能在模型中起重要作用 涉及线粒体氧化损伤 ( 25 , 31 , 32 ).
自噬参与蛋白质聚集体的清除 ( 33 - 35 ) 和轴突突触形态的正常调节 ( 36 ). 慢性破坏 溶酶体功能导致轻微受损的线粒体积聚 钙缓冲能力下降 ( 37 ),这意味着 自噬在线粒体稳态中的作用 ( 37 , 38 ). 最近,Parkin 补充PINK1缺乏对线粒体形态的影响 ( 三 ),被发现用于促销 去极化线粒体的自噬 ( 39 ). 相反,Beclin 1-独立自噬/有丝分裂参与PD诱导的细胞死亡 毒素1-甲基-4-苯基吡啶和6-OHDA ( 25 , 28 , 31 , 32 ),引起神经炎 在富含亮氨酸重复序列中表达PD-连锁突变的细胞中的收缩 激酶2( 40 ). 鉴于 适当调节的自噬起着体内平衡和神经保护作用, 过度或不完全的自噬会造成“自噬 压力”会导致神经退化 ( 28 ).
线粒体断裂 ( 三 )线粒体增加 自噬( 4 )已经是 在帕金森病患者的人体细胞或组织中,我们研究了 PINK1功能的工程性丧失不能重演这些 人类神经元细胞(SH-SY5Y)的观察结果。 内源性基因的稳定敲除 PINK1导致线粒体断裂,增加自噬和 而PINK1的稳定或短暂过表达有助于细胞分裂 相反的效果。 自噬/有丝分裂依赖于 线粒体氧化剂的产生和裂变的激活。 数据表明 PINK1对维持线粒体网络很重要, 提示线粒体动力学和自噬的协调调节 限制与PINK1功能丧失相关的细胞死亡。
实验程序
质粒 -PINK1 pcDNA6.1构造C端子标记为 版本5( 12 )和氨基处理 pAdTrack-CMV中的ΔN-PINK1-3xFLAG ( 14 )具有特征 之前。 pReceiver载体中Parkin的HA标记人类cDNA为 从Genecopoeia(马里兰州Germantown)购买。 线粒体靶向GFP (细胞色素氧化酶VIII导入序列)和HA或GFP标记的野生型和 EGFP-N1主干中的显性阴性K38A-Drp1由Dr。 斯特凡·斯特拉克(爱荷华大学)。 HA-Drp1同时构造 共表达内源性Drp1特异性shRNA ( 41 ). GFP-LC3和RFP-LC3 由Tamotsu Yoshimori(国家遗传学研究所, 日本)( 42 ).
定制PINK1多克隆抗体的制备 -多克隆 识别激酶亚结构域IX中预测暴露环的抗体(C8830) 使用Invitrogen和 在免疫印迹和荧光应用中具有特异性。
稳定PINK1过表达和敲除细胞的产生 线 -SH-SY5Y细胞系, 弗吉尼亚州马纳萨斯)是一种多巴胺能人类神经母细胞瘤细胞系,维持为 描述( 31 ). 用于稳定 PINK1-过表达细胞系,SH-SY5Y细胞转染 pReceiver M14(Genecopoeia)中的PINK1-3x标志或空pReceiver M14(控制) 使用Lipofectamine 2000(0.10%最终,Invitrogen)并用G418选择 (Invitrogen;1 mg/ml,在Dulbecco改良Eagle's培养基中,10%胎牛 血清)培养24天。 单个菌落在800μg/ml G418中扩增。 小鼠免疫印迹证实PINK1-3xFlag的表达 抗FLAG M2抗体(1:5000)(Sigma)和总PINK1使用 C8830(1:2000)。
为了产生稳定的PINK1缺陷株,SH-SY5Y被转染 PINK1 shRNA编码序列(Origene,Rockville,MD)或对照pRS shRNA 除嘌呤霉素(0.6μg/ml;Sigma)为 已使用。 为了控制非特异性或离靶效应,两系列PINK1 生成shRNA克隆,其中一个克隆靶向N末端区域(A系列: CCAGGCTGCGCAGGACCG)和另一个激酶结构域中的序列(D 系列:CCCCTCACCCAACATCATCC)。 单个菌落通过 ΔΔ C类 吨 分析,使用TaqMan定量 PINK1、β-actin和ABI 7500的逆转录-PCR探针 实时PCR系统(加利福尼亚州福斯特市应用生物系统公司)。 蛋白质减少 PINK1(C8830)的免疫印迹分析证实其表达。
免疫荧光和成像 -SH-SY5Y细胞为 甲醛固定并用C8830(1:2000)、鼠抗HA标签(1:1000)染色; Covance)和小鼠抗线粒体抗原,60kDa(克隆113-1,1:400; BioGenex公司,加利福尼亚州圣拉蒙)。 然后将固定细胞培养在适当的 Alexa 488-驴抗兔(分子探针,尤金,加利福尼亚州)或Cy3-donkey 抗小鼠次级抗体(1:400;Jackson ImmunoResearch Laboratories, 宾夕法尼亚州West Grove),并用1.25μg/ml DAPI(分子 探头)。 使用IDX71 Olympus在25°C下对标记细胞成像 放大倍率为×20(0.45数值)的荧光显微镜 孔径)或×40(0.60数值孔径)和DP70显微镜数字 摄像机(奥林巴斯美国公司,纽约州梅尔维尔;励磁/发射滤波器, 490/520纳米; 541/572纳米)。
共焦成像 -对于有丝分裂,GFP-LC3转染细胞 用MitoTracker红染色(100 n 米 ,分子探针)和 使用倒置FluoView 1000激光扫描共焦显微镜在 使用线性顺序放大×60倍(1.42数值孔径) 扫描模式功能(美国奥林巴斯;激发/发射滤波器,488/510 nm; 561/592纳米)。
用于线粒体的三维重建,10-μm厚 使用FluoView 100采集25-30个切片的Z堆栈 至少10-12个细胞/条件的激光扫描共聚焦显微镜。 使用Imaris 6.1软件生成三维投影 (Bitplane Scientific Solutions,苏黎世)。
细胞培养处理 -用牛肝处理细胞 过氧化氢酶(罗氏分子生物化学;260000单位/ml),10单位/ml或 锰(III)四(4-苯甲酸)卟啉(MnTBAP,Alexis生化公司, 圣地亚哥)100μ 米 巴非霉素(10 n 米 ; 钙生物化学) 用于抑制自溶体降解 ( 43 )和0.5 μ 米 使用clasto-lactacystinβ-内酯(Sigma)6小时,以 抑制蛋白酶体。
合成了人类Atg蛋白的小干扰RNA(siRNA) 特征如上所述 ( 31 ),和SH-SY5Y细胞 与Atg8/LC3 siRNA、Atg7 siRNA或 等效siControl非靶向siRNA(Dharmacon,Lafayette,CO)72小时前 进行分析( 22 ). 线粒体 如前所述从SH-SY5Y细胞中分离 ( 44 ).
透射电子显微镜 -细胞被处理为 如前所述( 31 )以及 在JEOL JEM-1210电子显微镜上拍摄。
Western Blot分析和密度测定 -细胞裂解物(1.0% Triton X-100(含蛋白酶/磷酸酶抑制剂)的溶解率为5-15% 所述的ammediol缓冲聚丙烯酰胺凝胶和免疫印迹 以前( 31 )使用C8830 兔抗PINK1(1:2000)、鼠抗FLAG(1:2000;Sigma)、兔 抗MAP-LC3(5F10,1:4000;Nanotools,圣地亚哥),兔抗GFP(1:1000; Invitrogen),小鼠抗线粒体抗原,60kDa(1:1000;Biogenex,San Ramon,CA)、小鼠抗丙酮酸脱氢酶(1:1000或0.01μg/ml; 分子探针),小鼠抗β-肌动蛋白单克隆抗体(1:5000; Sigma),鼠标抗ATG7(1:1000),抗HA标签(1:1000;Covance,普林斯顿, NJ),兔抗肿瘤ERK1/2(1:30000;Upstate Biotechnology,Lake Placid, NY)和抗乳酸脱氢酶(1:1000;Chemicon/Millipore)。 分子的 根据对数分子绘制的相对迁移率估算重量 万花筒标准(Bio-Read)的重量。
细胞存活-死亡分析 -细胞存活率使用 阿拉马蓝(俄亥俄州克利夫兰市Trek Diagnostics),激发540 nm,发射 590 nm,在Spectromax M2微板阅读器中(分子器件,桑尼维尔, 加利福尼亚州)。 使用碘化丙啶(分子探针;1 μg/ml,37°C下5-10分钟),如所述 ( 25 )通过计算 含有碎片、浓缩或固缩的GFP转染细胞数量 每个外荧光显微照片的细胞核。
线粒体超氧化物检测 -细胞被染色 如前所述的MitoSOX(分子探针) ( 44 ). 量化平均值 MitoSOX荧光的细胞积分密度 期刊(分子器件),由美国癌症研究中心的Simon Watkins设计 生物成像,计算每个细胞的综合像素强度。 这个 每小时MitoSOX荧光平均细胞积分强度 通过计数细胞数量,将表观荧光显微照片归一化为细胞数量 使用中的“计数细胞核”函数计算每个场的细胞核数 DRAQ5(英国莱斯特郡Biostatus Ltd.)频道。
GFP-LC3点状、线粒体和线粒体的定量 形态学 -GFP-LC3转染细胞的线粒体 MitoTracker Red的定量如前所述 ( 25 ). 自动化量化 以平均细胞GFP-LC3点作为自噬的测量 如前所述,为NIH ImageJ软件(版本1.39)使用自定义宏 以前( 22 , 25 ).
为了量化线粒体形态的两个参数,另一个ImageJ 宏是为NIH Image创建的(可从 ImageJ Wiki网站; 参见补充图S1图例)。 细胞的绿色通道 用MitoTracker绿色FM(250 n)染色 米 ; 分子探针)或 表达mito-GFP的细胞被提取成灰度,倒置显示 线粒体特异性荧光为黑色像素,阈值为 优化分解单个线粒体。宏观追踪线粒体 使用“分析粒子”绘制轮廓。平均面积/周长比 被用作线粒体互连指数 圆形度用于测量线粒体伸长,使用验证 线粒体分裂和融合的特征良好的介质(图。 S1)。
统计 -除非另有说明,否则表示结果 编译后表示至少三个独立实验的±S.E。 使用单向方差分析进行多组比较 Fisher差异最小。 的值 第页 < 0.05 被认为是重要的。
结果
稳定的PINK1-过表达和缺陷细胞系 -收件人 研究PINK1中与扰动相关的生化机制 功能,我们生成了一组SH-SY5Y克隆细胞系 过表达或表现出内源性PINK1的表达减少。 5-15% 梯度凝胶,兔C8830抗血清标记微弱的~66-kDa带和 内源性PINK1的强加工~50-kDa带。 此外 抗体识别不同强度的~35kDa条带和~22-24kDa条带 乐队。 免疫反应带通过与 免疫肽( 图。 1 A类 , 中间面板 )或通过shRNA到PINK1 ( 图1 E类 ). 由 免疫荧光,C8830产生内源性PINK1的强染色 与线粒体共定位( 图。 1 C类 , 黄色的 )在 细胞质( 图1 C类 , 绿色 ).
图1。
PINK1-过表达和敲除细胞系的特性。
A类 ,来自稳定pRec载体控制SH-SY5Y细胞系的细胞裂解物 ( C类 ),一种PINK1敲除稳定的细胞系( 答14 )、和 PINK1-过表达克隆细胞系( #24 )以5-15%的比例解决 用ammediol缓冲凝胶和免疫印迹法检测PINK1和C8830抗血清 存在( 中间面板 )或缺席( 左侧面板 )阻塞的 PINK1肽(100μg/ml,1小时)。 为FLAG标签重新标记污点 ( 右侧面板 )β-actin作为负荷控制。 插入 1 显示胶片的较长曝光时间,以更好地显示全长 内源性PINK1相对于过度表达的PINK1-3xFlag。 免疫反应性 带包括全长重组PINK1-3xFlag(带 一 ′, ~69 kDa),内源性全长(带 一 ,~66 kDa)和a 主要处理波段 b条 ,~50 kDa)。 一个或两个以下 还观察到分子量处理形式(<39 kDa)。 A已处理 有时观察到PINK1-3x标记的形式(~60 kDa,补充图。 S8); 插图2 显示了单元格中此处理带的加重 用蛋白酶体抑制剂clasto-lactacystinβ-内酯(band)治疗 一 ”)。 较小的PINK1处理带可能会进一步反映 处理,可能在C端子端,因为没有更小的FLAG频带 观察。 B 线粒体的蛋白质印迹( 米托 )以及 细胞质的( 细胞 )来源于亲代SH-SY5Y细胞的组分 ( W公司 ),一条稳定的矢量线( Ctrl键 ),和PINK1-3xFlag克隆#24 在10%三甘氨酸凝胶上溶解并免疫印迹FLAG,内源性 PINK1、线粒体P60和乳酸脱氢酶( 乳酸脱氢酶 ). 类似 获得了克隆9的结果(数据未显示)。 星号 , 表示非特定带。 全长重组PINK1-3xFlag(带 一 ′),内源性全长(带 一 )、和已处理 (波段 b条 )观察到PINK1。 C类 ,的外荧光图像 SH-SY5Y细胞双重标记内源性PINK1( 绿色 )和60-kDa 人线粒体抗原( 红色 )并对带有 DAPI公司( 蓝色 ). D类 克隆SH-SY5Y株系中PINK1 mRNA水平 表达针对N末端(A系列克隆)或中间的shRNA PINK1的(D系列克隆)区域。 数据归一化为β-肌动蛋白mRNA 作为相对量化值±最大值和最小值。对照克隆 使用pRS控制矢量(V系列克隆)作为参考生成 值。 * , 第页 <0.001 与 V17。 E类 , PINK1免疫印迹显示稳定PINK1shRNA内源性PINK1s减少 细胞系与含有β-actin的载体控制细胞系的比较 用作负载控制。 50-kDa处理带( b条 )和两个 较小的处理带( c 和 d日 )在该印迹中观察到 (参见补充图S7了解ECL膜的非裁剪版本)。 密度测定法 数据(由每条线的三个独立实验汇编而成)如下所示 低于( * , 第页 < 0.01 与 控制单元 线路)。
PINK1-过表达克隆24( 图。 1 A类 )克隆9(图S8)显示稳定表达 PINK1带有C端子3xFlag标签。 两种抗FLAG单克隆抗体 和C8830抗血清识别过度表达的全长3xFlag标记的PINK1 (~69 kDa)( 图。 1 A类 , 左边 和 右侧面板 ; 图S8)。 A类 代表全长内源性PINK1(~66 kDa)的较暗带也是 在矢量控制和PINK1-3x标记线中观察到 ( 图1 A类 ,以及 插图1 暴露时间较长)。 PINK1-3x标志出现在 线粒体和细胞溶质部分( 图。 1 B ). 处理的~60-kDa PINK1-3x标志形式 (补充图S8)未持续观察到,但增加了 乳酸菌素抑制蛋白酶体后的丰度 ( 图1 A类 , 插入 2 )或MG132(数据未显示)。
评估PINK1敲除在稳定PINK1-shRNA克隆中的效率 在mRNA和蛋白质水平上通过定量逆转录-PCR,Western 印迹分析和免疫荧光(数据未显示)。 PINK1 shRNA克隆 与对照组相比,A和D系列均有效降低了PINK1的mRNA水平 矢量控制细胞系( 图。 1 D类 ). PINK1的所有加工形式都减少了 与载体控制细胞相比,在多个PINK1 shRNA克隆中显著 用Western blot检测线条( 图1, A类 和 E类 ).
PINK1诱导的线粒体和自噬溶酶体缺失 变更 -超微结构分析显示稳定的载体 对照品系表现出正常的线粒体形态,几乎没有 AV(音频/视频)( 图2 A类 ). 稳定 使用独立短发夹序列敲除PINK1 ( 图2, B 和 C类 )诱发小而支离破碎的线粒体图谱 偶尔出现增大、肿胀的轮廓。 嵴褶皱数 PINK1敲除细胞线粒体长度每μm减少 ( 图2 E类 ),类似于 人帕金森病/路易体病黑质超微结构观察 神经元( 4 )和人类PD杂交 单元格( 45 ). 平均数 与对照组相比,AVs和每个细胞的溶酶体显著增加 载体细胞( 图。 2 F类 )表明PINK1的缺失促进了 自噬。
图2。
PINK1基因敲除和过度表达细胞的超微结构分析 线。 A-D公司 ,稳定细胞系的电子显微照片 表达空shRNA载体控制( A类 )、A和D系列PINK1 shRNAs ( B 和 C类 ),或PINK1-3x标志( D类 ). 米 , 线粒体; av(平均值) ,自噬空泡; 第页 ,溶酶体; n个 ,原子核。 插入 ,线粒体增大,显示致密 嵴( 比例尺 :2μm)。 E类 ,平均数量 线粒体嵴折叠/μm ( , 第页 <0.001 与 矢量控制; 平均值±S.E。, n个 = 80-150 线粒体/条件)。 F类 AV的平均数量(自噬体和 自身溶酶体)每细胞定量。 ( , 第页 < 0.05 与 病媒控制; 平均值±S.E。, n个 = 30 单元格/条件)。
PINK1过表达克隆的线粒体图谱更长 嵴褶皱密度较高( 图2, D类 和 E类 )还有一些异常增大 嵴丰富的线粒体( 图。 2 D类 , 插入 ). 与PINK1击倒相比 细胞系中,这些异常线粒体的存在似乎没有 当每个细胞的平均AV数量保持不变时,引发自噬反应 低过表达细胞( 图2, D类 和 F类 ).
PINK1表达调节线粒体形态 -作为 线粒体网络通过全细胞分析比通过 电子显微镜,我们利用计算机自动图像分析进行比较 PINK1表达水平改变对细胞形态学的影响 线粒体分裂/融合的已知介体。 NIH的自定义宏 ImageJ以无偏见的方式追踪单个线粒体并计算 线粒体相互连接指数和线粒体伸长指数。 它 通过转染裂变蛋白动力学相关蛋白进行验证 (Drp1)和显性负性Drp1(Drp1-DN),特征良好的分子 导致线粒体分裂和融合增加的操纵, 分别( 46 , 47 )(补充图S1)。 野生型PINK1的瞬时或稳定过表达增加 线粒体互联性和延伸性得分与载体的比较 控制稳定电池( 图3, A、, B ,以及 D类 ). 相反,PINK1的稳定击倒 与载体相比,诱导线粒体网络断裂 控制单元( 图3, A-C公司 ).
图3。
PINK1的敲除或过表达改变线粒体 形态学。 A类 线粒体的表观荧光图像 在载体控制中瞬时转染mito-GFP,稳定的PINK1-shRNA 品系和稳定的PINK1过表达克隆。 比例尺 :20微米。 B 线粒体Z堆叠的三维重建 在载体控制、PINK1 shRNA克隆和 PINK1-过表达克隆。 C类 ,定量图像分析 线粒体互联性和线粒体伸长在空腹中的应用 载体控制和PINK1shRNA克隆细胞(三种代表性细胞 实验; , 第页 < 0.02 与 控制( Ctrl键 ); 平均值±S.E。, n个 =25-35个单元格)。 D类 ,线粒体定量 a中的互连性和线粒体伸长 PINK1-3xFlag在SH-SY5Y细胞中的瞬时过表达 转染PINK1-WT-V5 ( , 第页 < 0.05 与 稳定控制或空矢量; 平均值±S.E。, n个 =25-35个细胞/条件,三个独立实验)。
由于线粒体轮廓较短,呈圆形,可能反映出 线粒体的空间重排,我们进行了三维重建 线粒体GFP表达线粒体Z堆叠的重建 ( 图3 B ). 这个 证实PINK1缺失株与对照组相比线粒体碎片化 带有载体控制细胞,显示出管状和 球形线粒体。相反,PINK1的过度表达增加 线粒体互联性。
PINK1功能丧失促进大细胞自噬和 粒体自噬 -我们利用已建立的荧光和生物化学 自噬测量研究PINK1基因敲除对 大自噬( 22 ). 共价的 泛素折叠蛋白Atg8/微管相关蛋白的脂质化 轻链3(LC3)对大细胞自噬诱导至关重要 ( 23 ). 非共轭LC3-I 形态在胞浆中弥散,而磷脂酰乙醇胺结合 LC3-II定位于AV,通过SDS-PAGE显示出更大的流动性 ( 48 ). 稳定击倒 PINK1显著增加了多个PINK1中LC3-II与β-肌动蛋白的比率 shRNA克隆,表明内源性PINK1的丢失促进自噬 ( 图4 A类 ). 平均值 在转染GFP-LC3标记物的活细胞中测定AVs的数量 早期AV或RFP-LC3,后者在后期保持强荧光 AVs/自溶体( 42 ). PINK1基因敲除增加了早期AV的平均细胞数 ( 图4 B , 左边 图表 )和后期AV( 图。 4 B , 右图形 )导致溶酶体膨胀 (补充图S2),表明AV成熟和溶酶体融合 在PINK1shRNA细胞系中完好无损。 使用巴非霉素A 自溶体降解 ( 43 ),确认完好 PINK1缺陷株系的自噬通量 ( 图4 B ).
图4。
PINK1的敲除增加了大细胞自噬和有丝分裂。
A类 ,LC3-Western blot显示LC3-II对β-肌动蛋白的增加 PINK1shRNA克隆中自噬增加的比率与 载体控制克隆或亲本SH-SY5Y细胞。 B ,平均数 在一个载体控制系和两个PINK1中每个细胞定量的GFP-LC3点 短暂表达GFP-LC3(早期AVs标志物)的shRNA克隆细胞系 ( 左图 ))或RFP-LC3(晚期AV的标记( 右图形 )) 当面( 黑色条 )或缺席( 灰色条 )第页,共页 巴非霉素抑制溶酶体降解 ( , 第页 < 0.01 与 控制细胞系( Ctrl键 ); n个 =20-40个单元 量化/条件; , 第页 < 0.01 与 PINK1shRNA线在缺乏 巴非霉素; n个 =分析的30-40个细胞/条件)。 C类 , 对照组和对照组线粒体线粒体红标记共焦显微镜观察 三株瞬时表达GFP-LC3的PINK1shRNA株( 绿色 ). 比例尺 :20微米。 D类 ,定量分析 GFP-LC3/MitoTracker共定位作为载体控制和 三个PINK1 shRNA克隆系。 条形图 显示平均值±S.E。 从四个实验汇编的45-90个细胞/条件 ( , 第页 <0.001 与 对照细胞系; n个 =25-30个细胞/条件)。 E类 ,计算机辅助量化细胞面积百分比 被对照组线粒体和PINK1 shRNA细胞占据 缺乏巴非霉素A。细胞瞬时转染 线粒体靶向GFP和非靶向RFP标记细胞 周长。 ( , 第页 < 0.05 与 对照细胞系; , 第页 < 0.05 与 未经处理的PINK1shRNA细胞系; n个 =25-35个单元格 分析/条件) F类 线粒体丙酮酸的蛋白质水平 脱氢酶( PDH公司 ),将总ERK1/2重新设置为加载控制。 G公司 ,计算机辅助量化 60kDa人线粒体抗原特异性免疫反应带 (mito-P60)相对于对照细胞系中的总ERK水平 PINK1shRNA细胞系和PINK1-3x-Flag过表达系。 这个 酒吧 图表 显示由3-4 Western blot编译的平均值±S.E 每个细胞系的实验 ( , 第页 < 0.05 与 对照细胞系; n个 =5-7条免疫反应带 分析/条件)。 插入 ,代表性Western blot显示 与稳定载体相比,PINK1 shRNA细胞中的mito-P60水平降低 控制( Ctrl键 ),将总ERK1/2重新设置为加载控制。
用GFP-LC3瞬时转染PINK1 shRNA稳定的细胞系 以Mito Tracker Red为指标分析GFP-LC3的共定位 有丝分裂( 25 , 49 ). 我们发现它很稳定 PINK1基因敲除诱导的自噬线粒体隔离 ( 图4, C类 和 D类 )并输送至溶酶体(补充图S2)和 免疫印迹法检测线粒体总细胞水平下降 线粒体基质(丙酮酸脱氢酶)和膜(P60)蛋白 ( 图4, F类 和 G公司 ). 定量分析显示约为2倍 三个shRNA克隆的线粒体P60水平降低,而 PINK1的过度表达显示无显著增加 ( 图4 G公司 ). 治疗 含有巴非霉素A的细胞( 图。 4 E类 ,补充图S3 B )或Atg7的RNAi或 Atg8/LC3B蛋白质(补充图S3 A类 )显著逆转了 线粒体水平下降,表明自噬降解 PINK1缺陷细胞中的线粒体( 图。 4 E类 ).
PINK1过度表达逆转PINK1-敲除诱导的 自噬 -6-OHDA诱导自噬/有丝分裂 ( 25 ). 而稳定击倒 在PINK1促进自噬的过程中,稳定的PINK1过度表达抑制了6-OHDA 诱导自噬和有丝分裂与稳定载体对照克隆的比较 ( 图5, A类 和 B ).
图5。
野生型PINK1表达增加抑制由 6-OHDA或PINK1缺乏。 A类 ,宏自噬 通过量化PINK1的平均数量分析过表达细胞系 dH存在时每个细胞的GFP-LC3点 2 0(车辆)或6-OHDA (120μ 米 持续4小时; Sigma)作为自噬的诱导物 ( , 第页 < 0.05 与 未经处理的载体对照细胞系; , 第页 < 0.05 与 6-OHDA处理的对照细胞系( Ctrl键 ); 方法 ±S.E。, n个 =20-35个量化细胞/条件)。 B , PINK1过表达克隆在缺乏或 6-OHDA作为有丝分裂诱导剂的存在 实验; , 第页 < 0.05 与 未经处理的对照细胞系; , 第页 < 0.05 与 6-OHDA处理的对照细胞系; 25-30口井 量化/条件)。 使用A系列恢复PINK1表达 抗RNAiΔN-PINK1-3xFLAG质粒抑制PINK1的自噬 通过LC3移位分析评估的shRNA线A14( C类 )和排成一行 A4由GFP-LC3 punta评估( D类 ). ( , 第页 < 0.0005 与 对照细胞系; , 第页 < 0.0005 与 空载体转染PINK1 shRNA; 平均值±S.E。, n个 =15-30个量化细胞/条件。)
同样,shRNA逆转研究表明 ΔN-PINK1-3xFLAG,缺少A系列的目标序列 PINK1特异性shRNA完全逆转了 PINK1拆卸线( 图5, C类 和 D类 ). ΔN-PINK1在保护 反对 1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶/1-甲基-4-苯吡啶 (MPP+)毒性( 14 ),这是 与自噬细胞死亡相关 ( 31 ).
PINK1的敲除诱导线粒体超氧化物,其调节 碎片化和分裂 -研究调节 PINK1基因敲除对线粒体功能的影响,我们使用 线粒体靶向荧光超氧化物传感器。 稳定击倒 PINK1显著增加线粒体超氧化物生成 通过MitoSOX荧光,表明PINK1的缺失促进线粒体 活性氧与功能障碍( 图6, A类 和 B ). 此外,过氧化氢酶已被证明影响 自由基引起的细胞内和细胞外过氧化氢水平 过氧化物通过质膜的扩散和MnTBAP,一种超氧物 分布于线粒体和细胞溶质的歧化酶模拟物 ( 50 ),逆转线粒体 PINK1缺失引起的形态学变化与 抗氧化剂处理的载体控制细胞 ( 图6, C类 和 D类 ). Drp1-DN的瞬时表达,逆转了 PINK1基因敲除对线粒体形态的影响,并没有减少线粒体SOX PINK1shRNA细胞系中的荧光(补充图S4),表明 ROS位于PINK1缺陷细胞线粒体断裂的上游。
图6。
PINK1敲除诱导线粒体超氧化物上游 PINK1缺陷系的线粒体断裂和自噬。
A类 细胞渗透红MitoSOX的表观荧光分析 线粒体超氧化物荧光指示剂在对照稳定细胞系中的应用 ( Ctrl,左面板 )和两个PINK1敲除细胞系( 正确的 面板 ). 用DRAQ5对细胞核进行复染( 蓝色 ). 比例 酒吧 :100微米。 B、 条形图 显示编译平均值±S.E。 来自三个独立实验,平均MitoSOX增加 将每个细胞的荧光归一化为载体控制细胞系 ( , 第页 < 0.05 与 载体控制细胞系; n个 =200-300个单元格 分析/条件)。 C类 和 D类 ,量化 线粒体互联性( C类 )和线粒体伸长 ( D类 )在用过氧化氢酶处理的PINK1敲低克隆细胞系中, MnTBAP或车辆(未经处理)24小时(三个独立的代表 实验; , 第页 < 0.05 与 对照细胞系; n个 =分析了25-35个细胞 根据条件。) E类 ,代表性的外荧光显微照片 PINK1敲除细胞系(A4)瞬时表达GFP-LC3 是否存在抗氧化剂MnTBAP。 注意MnTBAP抑制 PINK1敲低细胞中的自噬。 F类 ,平均手机数量 对照组或短暂表达GFP-LC3的PINK1shRNA细胞中的GFP-LC3puncta 在存在或不存在指定抗氧化剂的情况下。 ( , 第页 < 0.05 与 未经处理的对照细胞系; , 第页 < 0.0001 与 各自未经处理的克隆; 代表 条形图 显示平均值±S.E。, n个 =25-40个量化细胞/条件)。
用GFP-LC3和 用过氧化氢酶或MnTBAP处理以分析抗氧化剂对 PINK1缺失诱导的自噬。 只有MnTBAP抑制由 PINK1基因敲除对基础自噬也有显著影响 ( 图6, E类 和 F类 ). 这些结果表明细胞ROS的产生 对线粒体断裂和自噬都是必要的,但 超氧化物(或其产物过氧亚硝酸盐)对 自噬诱导。
线粒体分裂对线粒体碎片和 PINK1缺陷细胞的线粒体吞噬 -我们接下来评估 PINK1 shRNA细胞系中观察到的线粒体断裂是由 经典的依赖Drp1的裂变。 我们瞬时转染稳定载体 对照和具有GFP标记的Drp1 DN的PINK1 shRNA系。 此K38A替代 削弱裂变所需的GTPase活性,导致增加 SH-SY5Y细胞中的线粒体互连性(补充图S1)。 GFP-Drp1-DN的瞬时表达显著恢复线粒体 互连性和长度,表明经典的Drp1依赖裂变 PINK1-缺陷中观察到的线粒体重塑需要 克隆( 图7, A类 和 B ). 有趣的是,联合转染HA标记的Drp1-DN与 GFP-LC3作为自噬标记物导致GFP-LC3puncta和 PINK缺陷克隆的线粒体自噬水平与在 野生型对照克隆( 图7, C类 和 D类 ). 这表明线粒体 裂变/融合机制调节PINK1诱导的线粒体降解 缺乏。
图7。
PINK1敲除细胞的线粒体变化需要Drp1 活动。 对照或PINK1shRNA稳定克隆细胞系 与GFP-Drp1-DN和线粒体靶向RFP联合转染 (mito-RFP),并对图像进行线粒体互联性分析 ( A类 )和线粒体伸长( B )如下所述 “实验程序”。(三名独立代表 实验; , 第页 < 0.005 与 对照细胞系; , 第页 < 0.05 与 各自的空载体转染PINK1shRNA细胞系; n个 =25-35个量化细胞/条件。) 控制或PINK1shRNA稳定 用HA标记的Drp1-DN和GFP-LC3联合转染细胞以标记 AV(平均值)。 C类 和 D类 ,GFP-LC3穿孔平均数 ( C类 )或GFP-LC3斑点与线粒体共定位的百分比 ( D类 )通过共焦显微镜和图像分析(代表 三个独立实验; , 第页 < 0.01 与 控制; , 第页 < 0.05 与 空载体转染A4或D14; n个 =25-30个分析细胞/条件)。
自噬机制是线粒体分裂的必要条件 PINK1 shRNA细胞,但不增加线粒体活性氧 -我们 分析阻断自噬对线粒体超氧化物的影响 使用先前特征化siRNA的生产和线粒体形态 靶向必需自噬蛋白Atg7和Atg8/LC3B ( 25 , 31 , 40 ). 如预期,击倒 这些蛋白质抑制PINK1缺陷克隆的自噬 ( 图8 A类 ),但它已经 对增加的线粒体超氧化物没有影响,证实了自噬 发生在线粒体氧化应激的下游 ( 图8 B ). 有趣的是,Atg8/LC3B或Atg7的siRNA也逆转了 PINK1shRNA细胞系线粒体断裂水平 与内源性PINK1水平正常的细胞相似 ( 图8, C类 和 D类 ). 这些数据,加上 上述抗氧化敏感性,表明自噬是活跃的 参与线粒体重构以清除,而不是服务于 裂变下游的被动作用。 因此,裂变/融合和自噬 机器在病理调节中相互配合 PINK1缺陷诱导的线粒体重构和清除。
图8。
自噬参与由 PINK1缺乏并发挥神经保护作用。 A类 ,稳定 载体控制或PINK1shRNA细胞与指定的siRNA共同转染 并对每个细胞中GFP-LC3点的数量进行量化 两个的代表性实验 ( , 第页 <0.001 与 对照细胞系; , 第页 < 0.01 与 控制siRNA; 平均值±S.E。, n个 =30-40个电池 按条件量化)。 插入 显示典型的Western印迹 显示Atg7或控制siRNA的作用。注意,Atg7的敲除 降低内源性Atg7水平并降低激活的LC3-II水平。 B ,MitoSOX荧光的平均积分强度为 瞬时转染PINK1shRNA稳定细胞系中的定量 带有指示的siRNAs( , 第页 < 0.01 与 控制细胞系( Ctrl键 ),表示 ±S.E。, n个 =300-400个细胞/条件)。 C类 和 D类 ,线粒体互联性的量化( C类 )以及 线粒体伸长( D类 )PINK1敲除克隆系 用指示的siRNA转染(代表三个实验; , 第页 < 0.05 与 转染对照siRNA的对照细胞系; , 第页 < 0.01 与 PINK1 A4或D14转染对照siRNA; n个 = 25-30个细胞/条件)。 E类 ,基底细胞存活率(Alamar Blue试验) 对照和PINK1 shRNA克隆(四个实验的代表; , 第页 < 0.005 与 对照稳定细胞系; n个 =8口井 分析/条件)。 F类 ,碘化丙啶( 圆周率 )细胞死亡 对照和PINK1 shRNA稳定克隆细胞系的检测 ( , 第页 < 0.05 与 控制稳定线; n个 =800-1000个单元 分析/条件)。 G公司 ,对照或PINK1 shRNA的细胞存活率 用巴非霉素或载体处理18小时的稳定细胞系(代表性 三个实验; , 第页 < 0.05 与 对照细胞系/巴非霉素; n个 =分析的4口井/条件)。 H(H) 、对照细胞存活或 转染Atg7 siRNA的PINK1shRNA细胞 实验; , 第页 < 0.05 与 对照siRNA-处理的克隆A4; , 第页 < 0.005 与 对照siRNA-处理克隆D14; n个 =6口井 分析/条件)。
抑制自噬和线粒体分裂增加细胞死亡 PINK1敲除细胞系 -与以下观点一致: PINK1对神经元细胞有害 ( 19 ),我们发现了击倒 PINK1诱导SH-SY5Y细胞活性适度下降 ( 图8 E类 ),关联 培养5天后细胞死亡增加 ( 图8 F类 ).
自噬在调节细胞活力中的潜在作用 使用siRNA抑制自噬来研究PINK1缺陷细胞 诱导和24h剂量的巴非霉素抑制自噬降解。 A类 PINK1 shRNA中的细胞活力进一步显著降低 用巴非霉素处理的细胞( 图。 8 G公司 )或Atg7 siRNA,后者无显著差异 对对照稳定细胞系活力的影响 ( 图8 H(H) ).
同样,GFP-Drp1-DN诱导的线粒体融合增加了细胞死亡 在两个PINK1shRNA细胞系中,表明线粒体分裂也是 PINK1缺乏的保护机制,促进 有效的有丝分裂反应(补充图S5)。 这些数据表明 推测PINK1缺乏时自噬的有益作用 作为去除受损线粒体的机制。
Parkin的表达进一步增强了细胞的吞噬和细胞保护作用 PINK1缺陷细胞 -根据最近的观察,Parkin 补充受损线粒体并促进自噬 ( 39 ),我们研究了影响 PINK1敲低细胞中Parkin的表达。 免疫荧光和活共焦 显微镜下显示HA-tagged Parkin,54-kDa的瞬时表达 融合蛋白,在SH-SY5Y细胞中( 图。 9 B , 插入 )协同增加数量 GFP-LC3点的百分比和与之共定位的GFP-LC2点的百分比 PINK1敲除细胞系中每个细胞的线粒体 ( 图9 A类 -C类 ). 上 另一方面,Parkin的瞬时表达恢复了线粒体形态 参数到控制级别( 图。 9 D类 ). 细胞死亡分析显示,瞬时表达 Parkin显著逆转PINK1缺失诱导的细胞死亡 ( 图9 E类 ).
图9。
Parkin促进自噬/线粒体自噬并恢复线粒体形态 PINK1 shRNA细胞系。 A类 ,代表性荧光 GFP-LC3和载体共转染对照细胞的显微照片 ( 左边 )以及与GFP-LC3和 矢量(中间)或HA标记Parkin( 正确的 ). 细胞固定 HA-tag免疫染色( 红色 )并用DAPI复染 可视化细胞核( 蓝色 ). B ,代表性GFP-LC3 punta 对照细胞系和联合转染PINK1shRNA细胞系的条形图 GFP-LC3和空矢量或HA-Parkin ( , 第页 < 0.0001 与 对照细胞系; , 第页 < 0.01 与 载体转染shRNA细胞系; n个 =30-40个电池 按条件分析)。 插图显示了细胞的典型HA免疫印迹 转染HA标记Parkin( 黑色箭头 ). 预测的 HA Parkin的分子量为54kDa。 C类 ,有丝分裂定量 用空载体或 HA-停车( , 第页 < 0.02 与 对照细胞系; , 第页 < 0.05 与 PINK1shRNA细胞系; n个 =每分析30-40个细胞 条件)。 D类 ,线粒体的代表性量化 控制细胞系和PINK1shRNA细胞系的相互连接 与mito-GFP和空载体或HA-Parkin联合转染 ( , 第页 <0.002 与 对照细胞系; , 第页 < 0.05 与 PINK1shRNA细胞系; n个 =根据分析25-30个细胞 条件)。 E类 对照组和PINK1的碘化丙啶细胞死亡测定 用所示质粒转染shRNA稳定克隆细胞系。 ( , 第页 <0.001 与 控制稳定线; , 第页 < 0.05 与 PINK1shRNA细胞系; n个 =800-1000个单元 分析/条件)。
讨论
目前尚无减缓PD进展的治疗方法 疾病。 虽然大多数病例是散发的,但对基因的研究 与罕见的帕金森病家族相关,显示了涉及 氧化应激、线粒体病理生物学和蛋白质聚集 ( 51 , 52 ). 尤其是学习 常染色体隐性遗传型PD相关蛋白的作用 通常显示发病年龄更早)有希望了解 有助于阻止或延缓疾病进展的补偿机制。 目前的数据表明PINK1在 线粒体维持,抑制线粒体氧化应激, 裂变和自噬,并表明裂变的协同激活, 自噬和Parkin通路是重要的细胞保护反应 有效去除受损的线粒体。
与PINK1对线粒体至关重要的概念一致 完整性和体内平衡( 2 , 三 , 6 ),我们发现稳定 PINK1基因敲除升高线粒体超氧化物并促进 线粒体断裂、大自噬和有丝分裂,而 PINK1的过度表达稳定了线粒体网络。 这些研究 证明PINK1在调节自噬中的新作用。 出现超氧化物 是PINK1敲低诱导线粒体分裂的常见介质, 线粒体自噬和大自噬。 交互抑制研究表明 裂变和自噬机制对线粒体都是必不可少的 伴随PINK1缺陷线粒体清除的重塑 这种有丝分裂反应起到了保护作用。 总之,我们的数据表明 线粒体活性氧作为调节细胞协同活化的关键信号 线粒体分裂和自噬优化异常清除 线粒体(补充图S6)。
最近,帕金被证明能够识别并促进 药物去极化线粒体 ( 39 ). 我们的数据扩展了这一点 PINK1缺乏引起线粒体功能异常的观察。 具体而言,Parkin增强PINK1 shRNA细胞的有丝分裂反应 恢复正常线粒体形态,减少细胞死亡。 作为 使用Drp1-DN逆转线粒体分裂加剧细胞死亡 (补充图S5),Parkin的神经保护可能不是简单的原因 对线粒体形态的影响。 而不是线性路径 神经保护,这些研究表明 PINK1稳定线粒体完整性和 功能,而Parkin感觉受损线粒体进行代偿 间隙。
虽然我们的研究和其他哺乳动物细胞研究表明线粒体 PINK1缺陷细胞中的片段化 ( 三 ),在中学习 果蝇属 表现为大直径,核周, PINK1果蝇功能缺失突变中线粒体的荧光染色 ( 21 , 53 ). 一系列PINK1淘汰赛 随着年龄的增长,小鼠的线粒体轮廓也会略微增大 ( 54 ). 尽管大多数 PINK1缺陷的人SH-SY5Y细胞线粒体较小且呈碎片状, 我们也偶尔看到用电子显微镜观察到大的、膨胀的线粒体轮廓 显微镜( 图2 )以及 三维重建法分离较大球形线粒体 ( 图3 B ); 是否 这反映出直接或间接影响尚不清楚。 当然 Parkin恢复线粒体形态学参数的能力 PINK1缺失细胞可能直接或间接由融合影响所致 通过清除由 裂变。 有人建议 脊椎动物和无脊椎动物门 ( 三 , 19 ). 也有可能 RNAi研究中观察到的裂变是对线粒体损伤的反应 由于PINK1功能下降,这在习惯性神经元中未观察到 直到它完全消失。 然而,裂变和聚变都有可能 事件是对应激和损伤的反应,但主要是 稳态结果取决于病理和代偿的平衡 给定细胞环境中的机制。
自噬在神经元线粒体内稳态中起着关键作用 ( 55 ). 然而,人们知之甚少 关于有丝分裂的信号调节。 线粒体裂变诱导 某些系统中的有丝分裂 ( 56 )我们发现了损失 内源性PINK1促进线粒体分裂和自噬。 自相矛盾的是,自噬机制不仅是 线粒体到溶酶体,但也有助于线粒体断裂 ( 图8, C类 和 D类 ). 抑制自噬可望引起 如果自噬,则增加对破碎但未清除线粒体的检测 仅起到裂变下游被动清除机制的作用。 在 相反,抑制自噬结合机制逆转了 PINK1缺陷诱导的碎片化 ( 图8, C类 和 D类 ). 有趣的是,肝细胞中的活细胞成像 证明自噬体可以介导 完整细长线粒体的不同部分(中心和末端) ( 29 ). 因此,协调 裂变和自噬机制的激活有助于线粒体 PINK1缺陷细胞自噬周转的重塑。
在帕金森病/路易体病死后的脑组织中存在线粒体 线粒体激酶磷酸化增加相关的自噬 ( 4 ). 有趣的观察 PINK1的过度表达增强了相互连接的线粒体网络 支持线粒体定位激酶可能起关键作用的概念 在调节线粒体动力学中的作用。 最近的观察表明 依赖蛋白激酶A的Drp1磷酸化抑制裂变 ( 41 , 57 )建议其他Ser/Thr 激酶也可以调节线粒体裂变/融合蛋白,尽管 已知PINK1底物均不影响线粒体 动力学( 58 , 59 ).
由于线粒体功能障碍与 PD,有丝分裂最初可能代表一种代偿机制来清除 线粒体受损。但过度的有丝分裂,不平衡 再生生物发生可能最终被证明是有害的,因为神经元 依赖线粒体呼吸 ( 28 ). 自噬上调 在这种PINK1缺乏的慢性模型中起到细胞保护作用 ( 图8, G公司 和 H(H) )尽管对神经炎/突触有潜在影响 维护需要进一步研究 ( 40 , 60 ).
总之,RNAi和过度表达研究证明了内源性作用 PINK1通过减少线粒体来维持线粒体稳态 氧化应激、调节线粒体动力学和抑制 自噬。 PINK1缺陷细胞诱导的自噬依赖于 超氧化物和Drp1依赖性裂变增加。 裂变和自噬 在PINK1缺乏引起的线粒体重构中发挥积极作用, 裂变的协同激活和Parkin增强的有丝分裂可能有助于 降低隐性PD患者线粒体功能障碍相关的毒性 家庭。
致谢
我们感谢Simon Watkins和生物成像中心 匹兹堡大学电子显微镜和 变形学。 我们感谢夏洛特·迪格斯(Charlotte Diges)、艾米·萨托里(Amy Sartori)和梅根·德里金斯基(Megan Derezinski) 技术援助和下列所有调查人员 慷慨提供试剂的“实验程序”。
* 这项工作得到了National的全部或部分支持 卫生拨款研究所 AG026389、DC009120和 NS053777(至C.T.C.)。 这项工作也得到了 匹兹堡基金会的拨款, 埃默林基金(致C.T.C.) 美国帕金森病协会(致S。 和退伍军人管理局高级职业生涯 发展奖(授予S.M.K.)。
脚注
三 使用的缩写是:6-OHDA,6-羟基多巴胺; AV,自噬 液泡; Drp1,动力相关蛋白-1; Drp1-DN,显性负性Drp1; LC3,微管相关蛋白轻链3; 帕金森病 疾病/帕金森病; PINK1,PTEN诱导激酶1; 活性氧 氧物种; 小干扰RNA; RNA干扰; shRNA, 短发夹RNA; HA、血凝素; 绿色荧光蛋白; RFP,红色 荧光蛋白; DAPI,4′,6-二脒基-2-苯基吲哚; ERK公司, 细胞外信号调节激酶; MnTBAP,锰(III) 四(4-苯甲酸)卟啉。
工具书类
1 Bove,J.、Prou,D.、Perier,C.和Przedborski,S。 (2005)NeuroRx 2 484-494 [ 内政部 ] [ PMC免费文章 ] [ 公共医学 ] [ 谷歌学者 ]
2 Hoepken,H.H.,Gispert,S.,Morales,B.,Wingerter,O.,Del Turco, D.、Mulsch、A.、Nussbaum、R.L.、Muller、K.、Drose、S.、Brandt、U.、Deller、, T.、Wirth,B.、Kudin,A.P.、Kunz,W.S.和Auburger,G.(2007) 神经生物学。 数字化信息系统。 25 401-411 [ 内政部 ] [ 公共医学 ] [ 谷歌学者 ]
三。 Exner,N.、Treske,B.、Paquet,D.、Holmstrom,K.、Schiesling,C.、。, Gispert,S.、Carballo-Carbajal,I.、Berg,D.、Hoepken,H.H.、Gasser,T.、。, Kruger,R.、Winklhofer,K.F.、Vogel,F.、Reichert,A.S.、Auburger,G.、。, Kahle,P.J.、Schmid,B.和Haass,C.(2007)J。 神经科学。 27 12413-12418 [ 内政部 ] [ PMC免费文章 ] [ 公共医学 ] [ 谷歌学者 ]
4 Zhu,J.-H.,Guo,F.,Shelburne,J.,Watkins,S.和Chu,C.T。 (2003)《脑病理学》。 13 473-481 [ 内政部 ] [ PMC免费文章 ] [ 公共医学 ] [ 谷歌学者 ]
5 Abeliovich,A.和Flint Beal,M.(2006) 神经化学杂志。 99 1062-1072 [ 内政部 ] [ 公共医学 ] [ 谷歌学者 ]
6 瓦伦特·E.M.、阿布·斯莱曼·P.M.、卡普托·V.、穆吉特·M.、。, Harvey,K.、Gispert,S.、Ali,Z.、Del Turco,D.、Bentivoglio,A.R.、Healy,D。 G.、Albanese、A.、Nussbaum、R.、Gonzalez-Maldonado、R.,Deller、T.、Salvi、S.、。, Cortelli,P.、Gilks,W.P.、Latchman,D.S.、Harvey,R.J.、Dallapiccola,B.、。, Auburger,G.和Wood,N.W.(2004) 科学304 1158-1160 [ 内政部 ] [ 公共医学 ] [ 谷歌学者 ]
7 瓦伦特,E.M.,萨尔维,S.,Ialongo,T.,马龙吉,R.,埃利亚,A.E。, 卡普托,V.、罗米托,L.、阿尔巴内塞,A.、达拉皮科拉,B.和本蒂沃格利奥,A.R。 (2004)《神经年鉴》。 56 336-341 [ 内政部 ] [ 公共医学 ] [ 谷歌学者 ]
8 Zhou,C.、Huang,Y.、Shao,Y.,May,J.、Prou,D.、Perier,C.、。, Dauer,W.、Schon,E.A.和Przedborski,S.(2008) 程序。 国家。 阿卡德。 科学。 美国。 105 12022-12027 [ 内政部 ] [ PMC免费文章 ] [ 公共医学 ] [ 谷歌学者 ]
9 西尔维斯特里,L.,卡普托,V.,贝拉基奥,E.,阿托里诺,L。, Dallapiccola,B.、Valente,E.M.和Casari,G.(2005) 嗯,分子遗传学。 14 3477-3492 [ 内政部 ] [ 公共医学 ] [ 谷歌学者 ]
10 Sim,C.H.,Lio,D.S.,Mok,S.S.,Masters,C.L.,Hill,A.F。, Culvenor,J.G.和Cheng,H.C.(2006)《人体分子》。 遗传学。 15 3251-3262 [ 内政部 ] [ 公共医学 ] [ 谷歌学者 ]
11 Deng,H.、Jankovic,J.、Guo,Y.、Xie,W.和Le,W。 (2005)《生物化学》。 生物物理学。 Res.Commun公司。 337 1133-1138 [ 内政部 ] [ 公共医学 ] [ 谷歌学者 ]
12 Petit,A.,Kawarai,T.,Paitel,E.,Sanjo,N.,Maj,M.,Scheid,M。, Chen,F.、Gu,Y.、Hasegawa,H.、Salehi Rad,S.、Wang,L.、Rogaeva,E.、Fraser、, P.、Robinson,B.、St George-Hyslop,P.和Tandon,A.(2005) 生物学杂志。 化学。 280 34025-34032 [ 内政部 ] [ 公共医学 ] [ 谷歌学者 ]
13 Wang,H.L.,Chou,A.H.,Yeh,T.H.,Li,A.H,Chen,Y.L.,Kuo, Y.L.、Tsai,S.R.和Yu,S.T.(2007)《神经生物学》。 数字化信息系统。 28 216-226 [ 内政部 ] [ 公共医学 ] [ 谷歌学者 ]
14 Haque,M.E.,Thomas,K.J.,D’Souza,C.,Callaghan,S.,Kitada, T.、Slack、R.S.、Fraser、P.、Cookson、M.R.、Tandon、A.和Park,D.S。 (2008)程序。 国家。 阿卡德。 科学。 美国。 105 1716-1721 [ 内政部 ] [ PMC免费文章 ] [ 公共医学 ] [ 谷歌学者 ]
15 Beilina,A.,Van Der Brug,M.,Ahmad,R.,Kesavapany,S.,Miller, D.W.、Petsko,G.A.和Cookson,M.R.(2005)Proc。 国家。 阿卡德。 科学。 美国102 5703-5708 [ 内政部 ] [ PMC免费文章 ] [ 公共医学 ] [ 谷歌学者 ]
16 Clark,I.E.,Dodson,M.W.,Jiang,C.,Cao,J.H.,Huh,J.R。, Seol,J.H.、Yoo,S.J.、Hay,B.A.和Guo,M.(2006) 性质441 1162-1166 [ 内政部 ] [ 公共医学 ] [ 谷歌学者 ]
17 Park,J.、Lee,S.B.、Lee、S.、Kim,Y.、Song,S.、Jim,S.和Bae,E。, Kim,J.、Shong,M.、Kim,J,M.和Chung,J.(2006) 性质441 1157-1161 [ 内政部 ] [ 公共医学 ] [ 谷歌学者 ]
18 Yang,Y.,Gehrke,S.,Imai,Y。, Yang,L.、Beal,M.F.、Vogel,H.和Lu,B.(2006) 程序。 国家。 阿卡德。 科学。 美国。 103 10793至10798 [ 内政部 ] [ PMC免费文章 ] [ 公共医学 ] [ 谷歌学者 ]
19 Wood-Kaczmar,A.,Gandhi,S.,Yao,Z.,Abramov,A.S.,Miljan,E。 A.、Keen,G.、Stanyer,L.、Hargreaves,I.、Klupsch,K.、Deas,E.、Downward、, J.、Mansfield,L.、Jat,P.、Taylor,J.、Heales,S.、Duchen,M.R.、Latchman、, D.,大不里士,S.J.和Wood,N.W.(2008)公共科学图书馆 一个3 e2455。 [ 内政部 ] [ PMC免费文章 ] [ 公共医学 ] [ 谷歌学者 ]
20 Wang,D.,Qian,L.,Xiong,H.,Liu,J.,Neckameyer,W.S.,Oldham, S.、Xia,K.、Wang,J.、Bodmer,R.和Zhang,Z.(2006) 程序。 国家。 阿卡德。 科学。 美国。 103 13520-13525 [ 内政部 ] [ PMC免费文章 ] [ 公共医学 ] [ 谷歌学者 ]
21 A.C.普尔、R.E.托马斯、L.A.安德鲁斯、H.M.麦克布莱德。, Whitworth,A.J.和Pallanck,L.J.(2008)Proc。 国家。 阿卡德。 科学。 美国105 1638-1643 [ 内政部 ] [ PMC免费文章 ] [ 公共医学 ] [ 谷歌学者 ]
22 Chu,C.T.,Plowey,E.D.,Dagda,R.K.,Hickey,R.W.,Cherra,S。 J.,III,Clark,R.S.B.(2009)方法 酶制剂。 453 217-249 [ 内政部 ] [ PMC免费文章 ] [ 公共医学 ] [ 谷歌学者 ]
23 水岛,N.,Ohsumi,Y.和吉森,T.(2002) 单元格结构。 功能。 27 421-429 [ 内政部 ] [ 公共医学 ] [ 谷歌学者 ]
24 Gomez-Lazaro,M.、Bonekamp,N.A.、Galindo,M.F.、Jordan,J.和 Schrader,M.(2008)《自由基》。 生物。 医学44 1960-1969 [ 内政部 ] [ 公共医学 ] [ 谷歌学者 ]
25 Dagda,R.K.、Zhu,J.、Kulich,S.M.和Chu,C.T。 (2008)自噬 4 770-782 [ 内政部 ] [ PMC免费文章 ] [ 公共医学 ] [ 谷歌学者 ]
26 Hirai,K.,Aliev,G.,Nunomura,A.,Fujioka,H.,Russell,R.L。, Atwood,C.S.、Johnson,A.B.、Kress,Y.、Vinters,H.V.、Tabaton,M.、。, Shimohama,S.、Cash,A.D.、Siedlak,S.L.、Harris,P.L.、Jones,P.K.、。, Petersen,R.B.、Perry,G.和Smith,M.A.(2001)J。 神经科学。 21 3017-3023 [ 内政部 ] [ PMC免费文章 ] [ 公共医学 ] [ 谷歌学者 ]
27 Nixon,R.A.、Wegiel,J.、Kumar,A.、Yu,W.H.、Peterhoff,C.、。, Cataldo,A.和Cuervo,A.M.(2005)《神经病理学杂志》。 实验神经学。 64 113-122 [ 内政部 ] [ 公共医学 ] [ 谷歌学者 ]
28 Cherra,S.J.和Chu,C.T.(2008)《未来》 神经醇。 三 第309页至第323页 [ 内政部 ] [ PMC免费文章 ] [ 公共医学 ] [ 谷歌学者 ]
29 Kim,I.、Rodriguez-Enriquez,S.和Lemasters,J.J。 (2007)架构。 生物化学。 生物物理学。 462 245-253 [ 内政部 ] [ PMC免费文章 ] [ 公共医学 ] [ 谷歌学者 ]
30 Tolkovsky,A.M.、Xue,L.、Fletcher,G.C.和Borutaite,V。 (2002)《生物化学》(巴黎) 84 233-240 [ 内政部 ] [ 公共医学 ] [ 谷歌学者 ]
31 Zhu,J.H.,Horbinski,C.,Guo,F.,Watkins,S.,Uchiyama,Y.,和 Chu,C.T.(2007)《美国病理学杂志》。 170 75-86 [ 内政部 ] [ PMC免费文章 ] [ 公共医学 ] [ 谷歌学者 ]
32 Chu,C.T.、Zhu,J.和Dagda,R.(2007) 自噬3 663-666 [ 内政部 ] [ PMC免费文章 ] [ 公共医学 ] [ 谷歌学者 ]
33 Hara,T.、Nakamura,K.、Matsui,M.、Yamamoto,A.、Nakahara,Y.、。, 铃木Migishima,R.、横山M.、三岛K.、斋藤I.、冈野H.和 水岛,N.(2006)《自然》 441 885-889 [ 内政部 ] [ 公共医学 ] [ 谷歌学者 ]
34 Rideout,H.J.、Lang-Rollin,I.和Stefanis,L。 (2004)《国际生物化学杂志》。 细胞生物学。 36 2551-2562 [ 内政部 ] [ 公共医学 ] [ 谷歌学者 ]
35 拉维库马尔,B.,瓦彻,C.,伯杰,Z.,戴维斯,J.E.,罗,S。, Oroz,L.G.、Scaravilli,F.、Easton,D.F.、Duden,R.、O'Kane,C.J.和 Rubinsztein,D.C.(2004)《自然遗传学》。 36 585-595 [ 内政部 ] [ 公共医学 ] [ 谷歌学者 ]
36 小松,M.,王,Q.J.,霍尔斯坦,G.R.,弗里德里希,V.L.,Jr。, 岩田,J.、小米,E.、柴特,B.T.、田中,K.和岳,Z。 (2007)程序。 国家。 阿卡德。 科学。 美国。 104 14489-14494 [ 内政部 ] [ PMC免费文章 ] [ 公共医学 ] [ 谷歌学者 ]
37 Jennings,J.J.,Jr.,Zhu,J.H.,Rbaibi,Y.,Luo,X.,Chu,C.T。, 和Kiselyov,K.(2006)J.Biol。 化学。 281 39041-39050 [ 内政部 ] [ 公共医学 ] [ 谷歌学者 ]
38 Zhang,Y.、Qi,H.、Taylor,R.、Xu,W.、Liu,L.F.和Jin,S。 (2007)自噬 3 337-346 [ 内政部 ] [ 公共医学 ] [ 谷歌学者 ]
39 Narendra,D.、Tanaka,A.、Suen,D.F.和Youle,R.J。 (2008)《细胞生物学杂志》。 183 795-803 [ 内政部 ] [ PMC免费文章 ] [ 公共医学 ] [ 谷歌学者 ]
40 Plowey,E.D.、Cherra,S.J.、III、Liu,Y.J.和Chu,C.T。 (2008)神经化学杂志。 105 1048-1056 [ 内政部 ] [ PMC免费文章 ] [ 公共医学 ] [ 谷歌学者 ]
41 Cribbs,J.T.和Strack,S.(2007)EMBO 代表8 939-944 [ 内政部 ] [ PMC免费文章 ] [ 公共医学 ] [ 谷歌学者 ]
42 Kimura,S.、Noda,T.和Yoshimori,T.(2007年) 自噬3 452-460 [ 内政部 ] [ 公共医学 ] [ 谷歌学者 ]
43 山本A.、田川Y.、吉森T.、森山Y.、Masaki R.、。, 和Tashiro,Y.(1998)《细胞结构》。 功能。 23 33-42 [ 内政部 ] [ 公共医学 ] [ 谷歌学者 ]
44 Kulich,S.M.、Horbinski,C.、Patel,M.和Chu,C.T。 (2007)自由基。 生物医学。 43 372-383 [ 内政部 ] [ PMC免费文章 ] [ 公共医学 ] [ 谷歌学者 ]
45 Trimmer,P.A.,Swerdlow,R.H.,Parks,J.K.,Keeney,P.,Bennett, J.P.,Jr.、Miller,S.W.、Davis,R.E.和Parker,W.D.,Jr。 (2000)实验神经学。 162 37-50 [ 内政部 ] [ 公共医学 ] [ 谷歌学者 ]
46 Smirnova,E.、Griparic,L.、Shurland,D.L.和van der Bliek,A。 M.(2001)《分子生物学》。 单元格 12 2245-2256 [ 内政部 ] [ PMC免费文章 ] [ 公共医学 ] [ 谷歌学者 ]
47 Karbowski,M.、Lee,Y.J.、Gaume,B.、Jeong,S.Y.、Frank,S.、。, Nechushtan,A.、Santel,A.、Fuller,M.、Smith,C.L.和Youle,R.J。 (2002)《细胞生物学杂志》。 159 931-938 [ 内政部 ] [ PMC免费文章 ] [ 公共医学 ] [ 谷歌学者 ]
48 Kabeya,Y.,Mizushima,N.,上野,T.,山本,A.,Kirisako,T。, Noda,T.、Kominami,E.、Ohsumi,Y.和Yoshimori,T.(2000) EMBO期刊19 5720-5728 [ 内政部 ] [ PMC免费文章 ] [ 公共医学 ] [ 谷歌学者 ]
49 罗德里格斯·恩里奎兹,S.,Kim,I.,Currin,R.T.和Lemasters,J。 J.(2006)自噬 2 39-46 [ 内政部 ] [ PMC免费文章 ] [ 公共医学 ] [ 谷歌学者 ]
50 Patel,M.N.(2003)《衰老细胞》 2 219-222 [ 内政部 ] [ 公共医学 ] [ 谷歌学者 ]
51 Betarbet,R.、Sherer,T.B.、Di Monte,D.A.和Greenamire,J.T。 (2002)《脑病理学》。 12 499-510 [ 内政部 ] [ PMC免费文章 ] [ 公共医学 ] [ 谷歌学者 ]
52 道森·T·M和道森·V·L(2003) 科学302 8月19日至82日 [ 内政部 ] [ 公共医学 ] [ 谷歌学者 ]
53 Yang,Y.、Ouyang,Y.,Yang,L.、Beal,M.F.、McQuiban,A.、Vogel、, H.和Lu,B.(2008)Proc。 国家。 阿卡德。 科学。 美国。 答105 7070-7075 [ 内政部 ] [ PMC免费文章 ] [ 公共医学 ] [ 谷歌学者 ]
54 Gautier,C.A.、Kitada,T.和Shen,J.(2008) 程序。 国家。 阿卡德。 科学。 美国。 105 11364-11369 [ 内政部 ] [ PMC免费文章 ] [ 公共医学 ] [ 谷歌学者 ]
55 Larsen,K.E.和Sulzer,D.(2002) 历史。 组织病理学。 17 897-908 [ 内政部 ] [ 公共医学 ] [ 谷歌学者 ]
56 Twig,G.、Elorza,A.、Molina,A.J.、Mohamed,H.、Wikstrom,J.D.、。, Walzer,G.、Stiles,L.、Haigh,S.E.、Katz,S.、Las,G.,Alroy,J.、Wu,M.、。, Py,B.F.、Yuan,J.、Deeney,J.T.、Corkey,B.E.和Shirihai,O.S。 (2008)EMBO J。 27 433-446 [ 内政部 ] [ PMC免费文章 ] [ 公共医学 ] [ 谷歌学者 ]
57 Chang,C.R.和Blackstone,C.(2007)J。 生物化学。 282 21583-21587 [ 内政部 ] [ 公共医学 ] [ 谷歌学者 ]
58 Plun-Favreau,H.,Klupsch,K.,Moisoi,N.,Gandhi,S.,Kjaer,S。, 弗里斯·D·、哈维·K·、迪亚斯·E·、哈维·R·J·、麦克唐纳·N·、伍德·N·W·、。, Martins,L.M.和Downward,J.(2007)《自然细胞》 生物9 1243-1252 [ 内政部 ] [ 公共医学 ] [ 谷歌学者 ]
59 Pridgeon,J.W.、Olzmann,J.A.、Chin,L.S.和Li,L。 (2007)《公共科学图书馆·生物学》。 5 e172。 [ 内政部 ] [ PMC免费文章 ] [ 公共医学 ] [ 谷歌学者 ]
60 Yang,Y.、Fukui,K.、Koike,T.和Zheng,X.(2007) 《欧洲神经科学杂志》。 26 2979-2988 [ 内政部 ] [ 公共医学 ] [ 谷歌学者 ]
关联数据
本节收集本文中包含的任何数据引用、数据可用性声明或补充材料。