简介
大自噬(以下简称自噬)是一种主要的降解系统,通过它可以降解溶酶体中的细胞质内容物( 克林斯基,2007年 ; 水岛,2007年 ; 莱文和克罗默,2008年 ; 水岛 等。 , 2008 ). 一种隔离膜,也称为吞噬细胞,隔离部分细胞质,从而形成自噬体。 该自噬体随后与溶酶体融合,在溶酶体水解酶降解细胞质衍生物质。 合成的氨基酸被送回细胞质,然后再利用或进一步代谢。 自噬基本上是一个非选择性过程,尽管一些蛋白质通过这一途径选择性降解。 自噬在真核生物中高度保守,通常被营养饥饿激活,在细胞内产生必要的氨基酸,从而帮助它们适应饥饿条件。 自噬对细胞内蛋白质质量控制、植入前发育、细胞内病原体降解、抗原提呈、肿瘤抑制和某些类型的细胞死亡也很重要( Levine和Deretic,2007年 ; 水岛 等。 , 2008 ; 冢本 等。 , 2008 ).
自噬是一个高度可诱导的过程,但其调控机制尚待揭示。 在迄今为止报道的众多因素中( Codogno和Meijer,2005年 ; Meijer和Codogno,2006年 ; 水岛,2007年 )雷帕霉素[(m)TOR]介导的(哺乳动物)靶向抑制似乎是一种高度保守的主要调控机制。 (m) TOR形成两种不同的复合物,(m)TORC1和(m)TORC2( 沃尔施莱格 等。 , 2006 ; Guertin和Sabatini,2007年 ; Yang和Guan,2007年 ). 在哺乳动物细胞中,mTORC1由mTOR、mLST8(GβL)和猛禽组成,而mTORC2由mTOR、mLST 8、mSim1和猛禽构成。 mTORC1,而不是mTORC2,是一种可被雷帕霉素抑制的营养敏感复合物。 mTORC1通过其底物如S6-激酶、4E-BP1和PRAS40的磷酸化对蛋白质翻译、核糖体生物生成和细胞生长的调节至关重要( 沃尔施莱格 等。 , 2006 ; Guertin和Sabatini,2007年 ; Yang和Guan,2007年 ). (m)TOR在自噬中的作用也已确定,因为雷帕霉素和TOR通路的基因消融已被证明在广泛的生物体中触发自噬( Noda和Ohsumi,1998年 ; 拉维库马 等。 , 2004 ; 斯科特 等。 , 2004 ). 然而,TOR是如何调节自噬的,目前尚不清楚。 TAP42是酵母中已知的TOR底物,不参与自噬调节( 卡马达 等。 , 2000 )而诸如S6-激酶等mTOR底物的参与是有争议的( 克林斯基 等。 , 2005 ).
在酵母中,Atg1–Atg13–Atg17复合物被认为在Tor下游发挥作用( 卡马达 等。 , 2000 ). 在富含营养的条件下,Atg13被一种未识别的激酶过度磷酸化,并在脱氮或雷帕霉素处理后迅速去磷酸化,这有助于与Atg1相互作用。 Atg13和Atg17对Atg1激酶活性很重要,而Atg1酶活性是自噬所必需的( 卡马达 等。 , 2000 ; 卡贝亚 等。 , 2005 ). Atg1有两种哺乳动物同源物,即类UNC-51激酶1(ULK1或Unc51.1)和ULK2(Unc51.2; 雁鸣声 等。 , 1998 ; 苫田 等。 , 1999 ; 雁鸣声 等。 , 1999 ). 哺乳动物中没有明显的Atg17同源物,但我们先前提出FIP200(一种200 kDa的黏着斑激酶家族相互作用蛋白)可能是功能对等物( 哈拉 等。 , 2008 ). ULK1和FIP200都参与自噬( 年轻 等。 , 2006 ; 陈 等。 , 2007 ; 哈拉 等。 , 2008 ; 昆都 等。 , 2008 ),尽管ULK1和FIP200的功能并不特定于自噬( 苫田 等。 , 1999 ; 甘和关,2008 ). 最近还发现了Atg13的哺乳动物对应物( 梅杰尔 等。 , 2007 )并被证明是自噬所必需的( 陈 等。 ,2009年 ). 然而,包括这些因素在内的复合物的确切性质及其与mTOR的关系仍有待揭示。
在本研究中,我们通过数据库搜索和ULK相互作用蛋白筛选,独立鉴定了哺乳动物Atg13。 Atg13对哺乳动物细胞的自噬至关重要,并与ULK1和FIP200形成~3-MDa蛋白复合物。 此外,我们发现mTOR在富含营养物质的条件下被整合到这个复合物中,但在饥饿时被排除在外。 mTOR也被证明与ULK1和磷酸化ULK1及Atg13直接相互作用。 这些结果表明,mTOR通过~3-MDa ULK1–Atg13–FIP200复合物调节自噬。
材料和方法
质粒
编码人类Atg13(KIAA0652)的cDNA/ AB014552号 )从Kazusa DNA研究所获得,并克隆到p3xFLAG CMV10(日本东京Sigma-Aldrich)、pEGFP-C1(日本东京Clontech)和pCI-neo(日本东京Promega)。 标记有FLAG的猛禽(pcDNA3.1/Zeo(+)-FLAG-raptor)是神户大学的Kenta Hara博士赠送的礼物。 将小鼠ULK1及其变异体克隆到p3xFLAG CMV14(Sigma; 雁鸣声 等。 , 1998 ). 先前描述了FIP200质粒( 哈拉 等。 , 2008 ).
细胞培养和转染
野生型和 FIP200型 −/− 先前生成了小鼠胚胎成纤维细胞( 甘 等。 , 2006 ). MEF、HeLa和HEK293T细胞在补充有10%胎牛血清(FBS)和50μg/ml青霉素和链霉素(完全培养基)的DMEM中培养,在5%CO中 2 孵化器。 用牛小牛血清代替FBS检测NIH3T3细胞。 在饥饿治疗中,用磷酸盐缓冲盐水(PBS)清洗细胞,并在不含FBS(饥饿培养基)的无氨基酸DMEM(日本东京Invitrogen)中培养细胞。 Fugene 6(日本东京罗氏诊断公司)用于转染。 对于逆转录病毒介导的转染,cDNA被亚克隆到pMXs-IP中(东京大学北村T.Kitamura提供)。 所得载体用于转染Plat-E细胞,从而产生重组逆转录病毒。 NIH3T3细胞被重组逆转录病毒感染,并按前面所述选择( 哈拉 等。 , 2008 ).
抗体和试剂
编码人类Atg13的cDNA亚克隆到pCold I(日本东京Takara Bio)和pGEX6p1(威斯康星州沃基沙GE Healthcare)。 NH标记的Atg13融合蛋白 2 -末端六组氨酸(His-Atg13)和谷胱甘肽 S公司 -转移酶(GST;GST-Atg13)表达于 大肠杆菌 BL21(DE3)plysS菌株(威斯康星州麦迪逊诺瓦根)。 用His-Atg13免疫家兔。 抗血清用GST-Atg13亲和纯化。 多克隆抗FIP200、抗ULK1( 哈拉 等。 , 2008 ),抗LC3( 细川 等。 , 2006 )和抗Atg16L1抗体( 水岛 等。 2003年 )如前所述。 多克隆抗ULK1抗体(A7481)、单克隆抗FLAG抗体(M2)和M2琼脂糖珠购自Sigma。 多克隆抗ULK1抗体(sc-10900和sc-33182)也从圣克鲁斯生物技术公司(加州圣克鲁斯)购买。 从Covance(威斯康星州麦迪逊)购买了单克隆抗血凝素(HA)抗体(HA11)。 Myc-Tag、p70 S6激酶(S6K)、磷酸-S6K(Thr389)、mTOR和猛禽的抗体购自Cell Signaling Technologies(日本东京)。 豚鼠多克隆抗p62抗体购自Progen Biotechtick(德国海德堡)。 Alexa Fluor 660结合山羊抗兔IgG(H+L)抗体(Invitrogen)用于免疫化学。 抗mTOR单克隆抗体(N5D11)先前已有描述( 西沼 等。 , 1998 ). 雷帕霉素购自西格玛。 肽抑素A、凝乳抑素、亮氨酸蛋白酶抑制剂、E64和E64d购自肽研究所(日本大阪)。 λ-磷酸酶购自新英格兰生物实验室(日本东京)。
免疫沉淀和免疫印迹
细胞裂解物在常规裂解缓冲液(50 mM Tris-HCl,pH 7.5,150 mM NaCl,1 mM EDTA,0.5%Triton X-100,1 mM-苯甲烷磺酰氟[PMSF],1 mM-Na)中制备 三 沃 4 和蛋白酶抑制剂混合物(完全不含EDTA的蛋白酶抑制剂,罗氏)。 通过15000 rpm离心15 min澄清裂解产物,然后使用特定抗体结合蛋白A或G-Sepharose进行免疫沉淀(GE Healthcare)。 沉淀的免疫复合物在裂解缓冲液中洗涤五次,并在样品缓冲液中煮沸。 为了分析mTORC1-ULK1复合物,使用第二个裂解缓冲液(40 mM HEPES,pH 7.4,2 mM EDTA,10 mM焦磷酸,10 mM甘油磷酸,0.3%CHAPS和蛋白酶抑制剂混合物)进行免疫沉淀 以及如前所述的洗涤缓冲液(40 mM HEPES,pH 7.4,150 mM NaCl,2 mM EDTA,10 mM焦磷酸,10 mM甘油磷酸和0.3%CHAPS),以保持mTOR复合物( 桑贾克 等。 , 2007 ). 随后用SDS-PAGE分离样品,并转移至Immobilon-P聚偏二氟乙烯(PVDF)膜(日本东京Millipore)。 使用所示抗体进行免疫印迹分析,并使用SuperSignal West Pico化学发光底物(皮尔斯化学公司,伊利诺伊州罗克福德)进行可视化。 使用LAS-3000微型成像分析仪和Multi-Gauge软件3.0版(日本东京富士胶片公司)分析信号强度。 使用Photoshop 7.0.1(加利福尼亚州圣何塞)对整个图像进行对比度和亮度调整。
RNA干扰
隐形RNA干扰(RNAi)寡核苷酸用于小干扰RNA(siRNA)实验(Invitrogen)。 所用序列如下:人类Atg13#2-siRNA:sense,5′-CCAUGUGUGAGAUUUCACUUAA-3′; 反义,5′-UUAAGUGAAAAUCUCCACACACAUGG-3′; 人类Atg13_#3-siRNA:sense,5′-GCAUUCUCUACCAGGCAAUUUG-3′; 反义,5′-CAAAUGCCUGUAGACAUGAAUGC-3′; 和人类ULK1–1-siRNA:意义,5′-GUGGCCCGUACGACUUCCAGGAAA-3′; 反义,5′-UUUCCUGGAAGUCGUACAGGGCAC-3′。 作为阴性对照,使用隐形RNAi阴性对照双链体(Invitrogen)的中型GC双链体。 根据制造商的协议,使用Lipofectamine RNAi MAX(Invitrogen)将隐形RNAi寡核苷酸转染到HeLa细胞中。
荧光显微镜
用装有CCD相机(ORCA ER,Hamamatsu Photonic Systems,Hamamatsu,Japan)的荧光显微镜(IX81;Olympus,Tokyo,Japan)直接观察稳定表达GFP-Atg13的NIH3T3细胞和稳定表达GFP-LC3的HeLa细胞。 使用60×PlanApo油浸透镜(1.42 NA;Olympus)。 如前所述,对Atg16L1进行免疫细胞化学( 哈拉 等。 , 2008 ).
电子显微镜
如前所述进行常规电子显微镜检查( 哈拉 等。 , 2008 ). 对于形态计量分析,使用MetaMorph图像分析软件(6.2版;MDS Analytical Technologies,Sunnyvale,CA)对每个样本的10个细胞进行分析。
凝胶过滤分析
用橡皮警察从培养皿中刮取细胞,并通过使用带有27号针头的1ml注射器反复传代(30次),将其均匀化于低渗缓冲液中(40 mM Tris-HCl,pH 7.5,蛋白酶抑制剂[10μg/ml胃蛋白酶抑制素a,凝乳抑素,亮氨酸蛋白酶,E64])。 匀浆在13000× 克 培养15min,上清液进一步以100000× 克 持续60分钟。然后将上清液(S100)部分(800μl中约1.6 mg蛋白质)应用于Superose 6色谱柱(GE Healthcare),并以0.5 ml/min的流速用40 mM Tris-HCl、pH 7.5和150 mM NaCl洗脱。 然后用免疫印迹法检测组分(0.5 ml)。 用甲状腺球蛋白(669 kDa)、铁蛋白(440 kDa)、过氧化氢酶(232 kDa)、白蛋白(67 kDa)、卵清蛋白(43 kDa)和细胞色素C(12.5 kDa)校准柱。
杆状病毒表达系统
将编码人类Atg13并带有N末端GST标签的cDNA亚克隆到pBacPAK8(Clontech)中,并生成重组杆状病毒。 重组GST-Atg13在Sf21细胞中表达,并按照所述进行纯化( 哈拉 等。 , 2005 ).
mTOR和ULK1激酶分析
如前所述进行mTOR激酶分析( 哈拉 等。 , 2002 ). ULK1系列 K46N公司 由瞬时表达FLAG-ULK1的HEK293T细胞制备而成 K46N公司 用常规裂解缓冲液(含有Triton X-100以打破mTORC1结合)在饥饿培养基中培养3小时,并用M2琼脂糖珠进行免疫沉淀。 ULK1 K46N公司 蛋白质在含有0.5 mg/ml 3xFLAG肽(Sigma)的洗脱缓冲液(50 mM Tris-HCl,pH 7.5,150 mM NaCl和1 mM EDTA)中洗脱。 ULK1的体外蛋白激酶反应 K46N公司 (每反应150 ng)和GST-Atg13(每反应1μg)在30°C下在[γ- 32 P] 从非供体HEK293T细胞获得的ATP(Perkin-Elmer)和mTOR复合物。 GST、GST-4E-BP1和GST-PRAS40被用作阴性和阳性对照( 大城 等。 , 2007 ). 反应产物用SDS-PAGE分离,并用BAS图像分析仪(富士胶片)进行可视化。 如前所述,使用GST-Atg13作为底物进行ULK1激酶检测( 哈拉 等。 , 2008 ). 在ULK1激酶分析中,10 mM Mg 2+ 用以代替Mn 2+ .
双杂交分析
如前所述进行了两种杂交分析( 詹姆斯 等。 , 1996 ). 菌株PJ69–4A与每个pGBD和pGAD质粒共转化。 在Trp上选择转化子 − 卢 − 并在His上进行生长测试 − Trp公司 − 卢 − 含有2.5–50 mM 3-氨基三唑(3-AT)的平板。
结果
哺乳动物Atg13的鉴定
我们使用了两种不同的方法来鉴定哺乳动物Atg13。 首先,我们使用传统的BLAST执行数据库搜索。 因为很难直接使用 酿酒酵母 Atg13序列作为一个查询序列,我们首先确定 白色念珠菌 附件13( EAK96765 )然后将其用作第二轮BLAST搜索的查询序列。 因此,我们鉴定了一个人类cDNA序列(KIAA0652),该序列编码一个与酵母和 念珠菌 Atg13。在确定序列后,另一组将其指定为假定人类Atg13( 梅杰尔 等。 , 2007 ). 第二种方法涉及搜索ULK相互作用蛋白,如前所述( 哈拉 等。 , 2008 ). 小鼠ULK1-FLAG和FLAG-ULK2在HEK293T细胞中表达,并用高灵敏度直接纳米流LC-MS/MS分析免疫沉淀物( 夏目漱石 等。 , 2002 ). 在ULK1-FLAG和FLAG-ULK2沉淀中,我们发现KIAA0652。 根据这些发现,以及下面描述的结果,我们将KIAA0652命名为人类Atg13。
Atg13与ULK1和FIP200交互
人类Atg13没有特定的已知结构域,与酵母Atg13的同源性为16%(补充图S1)。 富Q区是酵母Atg13的一个特征,在其他物种中不保守,包括 黑腹果蝇 和人类。
我们使用瞬时转染实验首先确定Atg13是否与ULK1和FIP200相互作用。 FLAG-Atg13免疫沉淀显示,FLAG-Atg 13与HA-ULK1和HA-FIP200相互作用( 图1 A) ●●●●。 我们还观察到FLAG-Atg13和HA-ULK2之间的相互作用(补充图S2)。 然后,我们产生了抗人类Atg13的抗体,并证实了Atg13、ULK1和FIP200之间的内源性相互作用( 图1 、B和C)。 尽管饥饿和雷帕霉素治疗会诱导自噬(补充图S3),但这三种蛋白质之间的相互作用均不受任何一种治疗的影响( 图1 ,B和C),表明内源性Atg13、ULK1和FIP200形成稳定的蛋白质复合物。
图1。
Atg13与ULK1和FIP200形成复合物,并在饥饿过程中部分脱磷。 (A) 用FLAG-Atg13和HA-ULK1或HA-FIP200共同转染HEK293T细胞。 然后使用抗FLAG抗体对细胞裂解物进行免疫沉淀(IP)。 用所示抗体通过免疫印迹分析检测所得沉淀物。 (B和C)HEK293T细胞被饥饿1小时或雷帕霉素(100 ng/ml)处理,其裂解物用抗ULK1(B)、抗Atg13抗体(C)或免疫前兔血清(Pre)免疫沉淀,并用指示的抗体进行免疫印迹分析。 (D) HEK293T细胞、HeLa细胞和MEF在完全培养基或饥饿培养基中培养指定时间。 将部分细胞裂解物(时间0)与λ-磷酸酶在有或无磷酸酶抑制剂的情况下孵育15分钟,然后使用抗Atg13抗体进行免疫印迹分析。 星号表示非特异性免疫反应带。 (E) Atg13在 FIP200型 −/− MEF公司。 FIP200型 +/+ 和 FIP200型 −/− MEF在完全培养基或饥饿培养基中培养60分钟。然后使用抗Atg13抗体通过免疫印迹分析细胞裂解物。 (F) Atg13在没有ULK1的情况下脱磷酸。 使用抗Atg13抗体通过免疫印迹分析用针对ULK1的siRNA处理的HeLa细胞。
Atg13在饥饿期间被过度磷酸化和部分去磷酸化
酵母Atg13过磷酸化,但在氮饥饿或雷帕霉素处理后迅速去磷酸化( Kamada公司 等。 , 2000 ). 我们测试了哺乳动物细胞中是否也存在这种情况。 内源性哺乳动物Atg13在~60–65 kDa时被检测为涂抹带( 图1 D) ●●●●。 我们发现哺乳动物的Atg13也被过度磷酸化,因为内源性Atg13的位置通过λ-磷酸酶的处理而降低,而这种作用通过磷酸酶抑制剂的处理而消除( 图1 D) ●●●●。 Atg13在HEK293T和HeLa细胞饥饿后部分去磷酸化,但在MEF中不清楚。 因此,哺乳动物Atg13在饥饿时的去磷酸化并不像在酵母中观察到的那样剧烈。 我们还注意到Atg13在年降档 FIP200型 −/− MEF公司( 图1 E) 和ULK1 siRNA-处理细胞( 图1 F) 表明与ULK1和FIP200的相互作用对Atg13磷酸化很重要。
Atg13存在于隔离膜上
接下来,我们测定了Atg13在NIH3T3细胞中的亚细胞分布,该细胞稳定表达Atg13并与NH处的绿色荧光蛋白(GFP)融合 2 -终点(GFP-Atg13)。 在营养丰富的条件下,GFP-Atg13主要分布在细胞质中( 图2 A、 完整)。 然而,GFP-Atg13在氨基酸和血清饥饿后定位于标点结构( 图2 A、 饥饿)。 当媒体被全新的完整媒体取代时,这些标点结构立即消失( 图2 A、 饥饿→完全饥饿)。 Atg13的这些模式与ULK1和FIP200的模式非常相似,它们存在于隔离膜上(也称为吞噬细胞; 哈拉 等。 , 2008 ). 事实上,GFP-Atg13几乎完全与Atg16L1(一种隔离膜标记物)共定位( 水岛 等。 2003年 )确认Atg13定位于隔离膜( 图2 B) ●●●●。
图2。
Atg13在自噬诱导后定位于隔离膜。 (A) 将稳定表达GFP-Atg13的NIH3T3细胞在常规DMEM(完全)或无氨基酸DMEM中培养3h,无FBS(饥饿),然后在新鲜的完全培养基中再培养1h(饥饿→完全)。 (B) 将稳定表达GFP-Atg13的NIH3T3细胞在饥饿培养基中培养2 h。然后使用抗Atg16L1抗体和Alexa Fluor 660-结合二级抗体对细胞进行免疫荧光显微镜检查。 比例尺,(A和B)20μm。
自噬需要Atg13
鉴于Atg13与已知的自噬蛋白相互作用并存在于分离膜上,我们接下来研究了Atg13在哺乳动物细胞中的功能。 在用抗Atg13两个不同区域(Atg13_#2和Atg13_3#)的siRNA处理的HeLa细胞中,Atg13的表达降低到几乎无法检测到的水平( 图3 A) ●●●●。 接下来,我们测试了这些细胞的自噬活性。 LC3是哺乳动物Atg8同源物之一,以两种形式存在:LC3-I(细胞溶质形式)和LC3-II(膜结合形式)。 在诱导自噬时,LC3-I被转化为LC3-II( 图3 A、 车道1和2)。 由于自噬体内的LC3-II在自溶体中被降解,如果用溶酶体蛋白酶抑制剂(E64d和pepstatin A; 图3 A、 车道3; 谷多 等。 , 2005 ; 水岛和吉森,2007年 ). 在Atg13_#2 siRNA处理的细胞中,LC3-II似乎是在饥饿期间产生的,但其数量并没有通过溶酶体抑制剂的处理而进一步增加( 图3 A、 通道4-6),表明自噬通量被阻断,LC3-II可能以自噬无关的方式生成(参见 讨论 ). Atg13_#3 siRNA的作用较小( 图3 A、 车道7–9)。 我们还监测了选择性自噬底物p62的表达水平( 比约克洛伊 等。 , 2005 ; 水岛和吉森,2007年 ). 在Atg13_#2 siRNA-处理的细胞中,对照细胞中由饥饿诱导的p62下降几乎完全被抑制( 图3 B) ●●●●。
图3。
Atg13对自噬至关重要。 (A和B)HeLa细胞转染两组不同的Atg13 siRNA或对照siRNA。2天后,再次转染相同的siRNA,并额外培养3天。然后将细胞培养在常规DMEM或饥饿培养基中,在有或无E64d(50μM)和胃蛋白酶抑制素A(50μg/ml)的情况下培养2小时(A) 或在没有这些抑制剂的情况下持续4小时(B)。 使用抗Atg13、抗LC3、抗p62和抗β-肌动蛋白抗体通过免疫印迹分析总裂解物。 星号表示非特异性免疫反应带。 (C) 用Atg13或对照siRNA处理稳定表达GFP-LC3的HeLa细胞。4d后,细胞在完全培养基或饥饿培养基中培养4h,然后通过荧光显微镜观察GFP-LC3.信号。 比例尺,20μm。 (D) 用E64d(50μM)和胃蛋白酶抑制剂A(50μg/ml)饥饿2 h,然后进行常规电子显微镜分析。 箭头表示自噬空泡(自噬体+自溶体)。 棒材,1μm。 通过形态计量分析确定自噬液泡总面积与细胞质总面积的比值。
此外,我们还使用稳定表达GFP-LC3的HeLa细胞测试了自噬体的形成。 GFP-LC3在正常条件下广泛检测到并富集于细胞核,但其生理意义尚不清楚( 库马 等。 , 2007 ). 对照细胞自噬诱导后,GFP-LC3易位至细胞质点( 图3 C) ●●●●。 然而,在用抗Atg13的siRNA处理的细胞中,饥饿只诱导了少量GFP-LC3点( 图3 C) ●●●●。 在这些细胞中未观察到GFP-LC3从细胞核中被排除。 然后我们进行了电子显微镜检查,发现Atg13 siRNA处理的细胞中自噬空泡的数量减少( 图3 D) ●●●●。 因此,四种独立的分析,LC3周转分析、p62降解分析、GFP-LC3斑点形成分析和电子显微镜,都表明Atg13是自噬体形成所必需的,因此也是自噬通量所必需的。
Atg13形成3-MDa复合体,包括ULK1和FIP200
在酵母细胞中,Atg1、Atg13、Atg17、Atg29和Atg31(可能还有更多因子)形成蛋白质复合物( 卡马达 等。 , 2000 ; 郑 等。 , 2005 ; 卡贝亚 等。 , 2005 , 2007 ; 川端康成 等。 , 2005 ); 然而,关于这个复合物的生化信息是有限的。 因此,我们确定了哺乳动物细胞中ULK1–Atg13–FIP200复合物的大小。 使用Superose 6柱对野生型MEF的细胞质组分进行凝胶过滤分析。 ULK1、Atg13和FIP200主要在对应于~3 MDa的单组分峰中洗脱( 图4 A) ●●●●。 尽管我们无法通过凝胶过滤分析预测其精确的分子量,但这些数据表明,ULK1、Atg13和FIP200包含在表观分子量为~3MDa的大型蛋白质复合物中。 在分别为~300–500和~200–400 kDa的小峰值中发现的ULK1和Atg13数量较少。 营养缺乏不影响~3-MDa ULK1–Atg13–FIP200复合物的形成( 图4 A) ,与我们的免疫沉淀分析一致( 图1 、B和C)。 这一发现与之前的酵母研究形成了鲜明对比,研究表明,饥饿处理可以增强Atg1、Atg13和Atg17之间的相互作用( 卡马达 等。 , 2000 ; 卡贝亚 等。 , 2005 ).
图4。
Atg13构成一个~3-MDa复合物,包括ULK1和FIP200。 (A) MEF在完全培养基或饥饿培养基中培养60分钟。S100部分细胞裂解物(在100000× 克 )在Superose 6柱上通过尺寸排除色谱分离。 用抗Atg13、抗ULK1和抗FIP200抗体进行免疫印迹分析。 显示了分子质量标准的位置(单位:kDa)。 五、 空隙率。 星号表示非特异性免疫反应带。 (B) 野生型和 FIP200型 −/− 在完全培养基中培养的MEF按A所述进行分析。星号表示非特异性免疫反应带。 用对照或Atg13 siRNA处理(C和D)HeLa细胞。用所示抗体(C)对总细胞裂解物进行免疫印迹分析。 然后通过凝胶过滤对S100组分进行分析,如A(D)所示。 星号表示在人类细胞中发现的非特异性免疫反应带。 (E) 用FLAG-FIP200、HA-ULK1和Atg13共同转染HEK293T细胞。 使用抗FLAG抗体对细胞裂解物进行免疫沉淀(IP),并使用抗Atg13、抗HA和抗FLAG的抗体进行免疫印迹(IB)分析。 用抗Atg13抗体检测内源性和外源性Atg13。
接下来,我们确定了每种哺乳动物对应物在复合物形成中的作用。 在 FIP200型 −/− MEF细胞,未产生~3-MDa复合物( 图4 B) ●●●●。 ULK1和Atg13分别在~300–500和~200–400-kDa馏分中回收。 ULK-和Atg13-阳性分数仅部分重叠。 这些数据表明,FIP200不仅对~3-MDa复合物的形成很重要,而且对ULK1-Atg13相互作用也很重要。
我们还分析了Atg13 siRNA在HeLa细胞中的作用,因为siRNA在HeLa细胞中最为成功。 在Atg13 siRNA-处理的细胞中,Atg13和ULK1的表达水平均显著降低,这表明Atg13对ULK1稳定和FIP200一样重要( 哈拉 等。 , 2008 ; 图4 C) ●●●●。 在Atg13 siRNA处理的细胞中,FIP200的数量也适度减少。 在野生型HeLa细胞中,Atg13在~3-MDa和~200–400-kDa复合物中几乎相同,而大多数ULK1和FIP200在~3-MDa复合物中发现( 图4 D) ●●●●。 在Atg13 siRNA处理的细胞中,Atg13和ULK1均未检测到。 尽管如此,FIP200仍在~3-MDa(或稍小的)组分中回收( 图4 D) ●●●●。 因此,ULK1和Atg13对这个大蛋白复合物的洗脱量都没有太大贡献。 然而,我们目前不知道FIP200是否是该复合物的主要成分,或者是否包括其他蛋白质。 接下来,我们通过过表达实验测试了Atg13是否仅对ULK1和FIP200的稳定性重要,或者对ULK1和FIP200之间的相互作用也重要。 当Atg13同时过度表达时,外源性引入的FIP200和ULK1之间的相互作用显著增强( 图4 E) ●●●●。 酵母双杂交分析还证明了Atg13和FIP200,以及Atg13与ULK1之间的相互作用,表明这是直接相互作用(补充图S4)。 总之,这些数据表明ULK1-FIP200相互作用高度依赖于Atg13。
在营养丰富的条件下,mTORC1与~3-MDa复合物相互作用
与酵母中动态Atg1–Atg13–Atg17复合物形成相比,哺乳动物ULK1–Atg13-FIP200形成相当稳定。 我们试图通过这种复合物进一步阐明自噬的调控机制,并在几种营养条件下用相同的方法寻找额外的ULK1相互作用分子。 因此,我们在饥饿3小时后氨基酸重新刺激后不久制备的样品中检测到了猛禽,但在饥饿细胞获得的样品中未检测到猛禽。 猛禽是一种向mTORC1招募下游底物的脚手架( 沃尔施莱格 等。 , 2006 ; Guertin和Sabatini,2007年 ; Yang和Guan,2007年 ). 我们证实,ULK1在营养丰富的条件下与猛禽和mTOR相互作用,但这些相互作用在饥饿期间显著减弱,而ULK1不断与Atg13和FIP200相互作用( 图5 A) ●●●●。 当用新鲜的完全培养基刺激细胞时,ULK1在5分钟内再次与猛禽和mTOR强烈相互作用( 图5 A) ●●●●。 当用FLAG-raptor沉淀补充细胞的裂解液时,检测到mTOR、ULK1、Atg13和FIP200,表明mTORC1与~3-MDa复合物有关( 图5 B) ●●●●。 在凝胶过滤实验中,猛禽分布广泛,但不包括在饥饿条件下的~3-MDa复合物中( 图5 C) ●●●●。 然而,在转向富含营养的培养基后,在~3-MDa组分中恢复了大量猛禽。 营养补充并未导致mTORC2的特定成分rictor并入~3-MDa复合体。 这些数据表明,mTORC1以营养依赖的方式并入大型ULK1–Atg13–FIP200复合物。
图5。
在富含营养的条件下,mTORC1与~3-MDa复合物相互作用。 (A) 用空载体或ULK1-FLAG转染HEK293T细胞。 然后在所示的完全培养基或饥饿培养基中培养细胞。 在再刺激实验(补充)中,饥饿细胞在新鲜完整培养基中额外培养指定时间。 使用M2琼脂糖珠对细胞裂解物进行免疫沉淀(IP)。 用所示抗体通过免疫印迹分析检测所得沉淀物。 (B) 用FLAG-raptor和HA-ULK1共同转染HEK293T细胞,并按A所述进行分析(30分钟补充条件)。 (C) 将NIH-3T3细胞在饥饿培养基中培养180分钟。在补充实验中,将饥饿的细胞在新鲜的完全培养基中再培养30分钟。按照 图4 A.指示了raptor-positive分数的移位。 星号表示非特异性免疫反应带。 (D) 转染FLAG标记的ULK1、Atg13和FIP200的HEK293T细胞接受3小时饥饿和30分钟补充治疗。 用抗FLAG抗体免疫沉淀细胞裂解物,并用抗猛禽抗体分析内源性猛禽的共沉淀。 (E) 用FLAG标记的ULK1突变体转染HEK293T细胞,并测定其与猛禽和Atg13的相互作用。
接下来,我们确定了复合体的哪一部分与猛禽直接相互作用。 内源性猛禽与过表达的ULK1-FLAG有效共沉淀,但与FLAG-Atg13和FLAG-FIP200无共沉淀,且营养依赖( 图5 D) ●●●●。 猛禽与ULK1的PS域相互作用( 图5 E) ●●●●。 作为 陈 等。 (2009) 据报道,ULK1的C端区域是必需的,足以与Atg13结合( 图5 E和补充图S4)。 然而,猛禽仍然可以与缺乏C末端区域的ULK1突变体相互作用( 图5 E) ●●●●。 因此,Atg13不会调节raptor-ULK1的相互作用。 虽然我们不能完全排除某些未知因素可能介导这种相互作用的可能性,但所有这些数据都表明猛禽通过ULK1与~3-MDa复合体相互作用。
mTOR磷酸化物ULK1和Atg13
由于猛禽与ULK1直接相互作用,我们假设ULK1可能是mTOR的底物。 因此,我们从非服务细胞和FLAG-ULK1中纯化了mTORC1 K46N公司 (一种激酶缺失突变体),并对其进行体外激酶分析。 我们使用了ULK1 K46N公司 在本试验中,避免自身磷酸化。 32 P并入ULK1 K46N公司 与mTOR沉淀物孵育时显著增强( 图6 A) ●●●●。 我们还通过mTOR沉淀物检测到Atg13的磷酸化( 图6 B) ●●●●。 这些数据表明,ULK1和Atg13都可能是新的mTOR底物。 这与我们的观察一致,即Atg13在饥饿条件下部分去磷酸化( 图1 D) 在此期间,mTORC1与~3-MDa复合物分离。 然后我们测试了在饥饿期间ULK1的磷酸化状态是否也发生了变化。 在MEF中检测到ULK1为轻微涂片带,并且在饥饿期间缩小,Atg13也是如此( 图6 C) ●●●●。 其他mTORC1底物如S6-激酶1和4E-BP1的去磷酸化以及LC3的转化也在类似的时间过程中观察到。 相反,当氨基酸和FBS重新刺激时,ULK1带向上移动( 图6 D) ●●●●。 这种变化与猛禽的相互作用密切相关,这种作用是由营养刺激引起的,然后逐渐减弱。 已经确定ULK1带转移是由mTOR介导的,因为雷帕霉素在营养丰富的条件下处理引起了类似于饥饿期间的迁移率转移( 图6 E) ●●●●。 所有这些数据表明,ULK1是mTOR的真正底物,Atg13是通过ULK1结合mTORC1的第二个mTOR底物。
图6。
TOR磷酸化ULK1和Atg13。 (A和B)从HEK293T细胞中免疫沉淀内源性mTOR,培养在含有抗mTOR抗体的完整培养基中,如 材料和方法。 作为对照,使用正常小鼠IgG进行免疫沉淀。 使用FLAG标记的ULK1对所得沉淀物进行mTOR激酶分析 K46N公司 (一个激酶缺失突变体)(a)或Atg13(B)作为底物。 GST-PRAS40和GST-4E-BP1用作阳性对照,GST单独用作阴性对照。 (C) HEK293T细胞在饥饿培养基中培养指定时间。 总细胞裂解物通过免疫印迹分析进行分析。 (D) 用空载体或ULK1-FLAG转染HEK293T细胞。 然后将细胞饥饿180分钟,然后在新鲜的完全培养基中培养指定的时间。 如中所述对细胞裂解物进行分析 图5 A.(E)NIH3T3细胞在完全培养基或饥饿培养基中培养180分钟。在补充实验中,饥饿细胞在补充前用100 ng/ml雷帕霉素或载体(DMSO)预处理30分钟,然后在新鲜的完全培养基中再加上或不加雷帕霉素培养30分钟。
ULK1磷酸化物Atg13
Atg13在ULK1 siRNA处理的细胞中去磷酸化( 图1 F) ●●●●。 最近的一份报告也表明,ULK1或ULK2的过度表达导致Atg13带型向上移动( 陈 等。 ,2009年 ). 这些数据表明,Atg13可能是ULK1和mTOR的直接底物。 因此,我们通过体外磷酸化试验测试了这种可能性。 野生型和激酶导向的ULK1复合物是从饥饿的HEK293细胞中制备的( 图7 A) 并使用重组GST-Atg13作为底物进行激酶分析。 我们发现ULK1复合物在体外直接磷酸化Atg13( 图7 B) ●●●●。 因此,Atg13可以被mTOR和ULK1磷酸化,这两种蛋白分别在营养丰富和饥饿条件下被激活( 哈拉 等。 , 2008 ). 这种复杂性可能是饥饿期间Atg13部分去磷酸化的原因。
图7。
ULK1在体外磷酸化Atg13。 (A和B)ULK1-FLAG(Wt)和扭结头ULK1 K46N公司 -从在饥饿培养基中培养1h的HEK293T细胞中免疫沉淀FLAG突变体(KD)。所得沉淀以GST-Atg13和GST(阴性对照)为底物进行免疫印迹分析(A)或ULK1激酶分析(B)。
讨论
我们鉴定了酵母Atg13的哺乳动物同源基因,发现哺乳动物Atg13与ULK1和FIP200一起并入~3-MDa蛋白复合体。 此外,我们还发现mTORC1也以营养依赖的方式与这个巨大的复合物相互作用。
本研究和以往研究( 年轻 等。 , 2006 ; 陈 等。 , 2007 , 2009 ; 哈拉 等。 , 2008 )证明ULK1–Atg13–FIP200复合物的每个成分对自噬至关重要,很可能是自噬体的形成。 在本研究中,我们观察到在Atg13 siRNA处理的细胞中LC3-II的积累( 图3 A) ●●●●。 我们不能排除Atg13 siRNA的作用不足以完全抑制LC3转化的可能性。 然而,我们在 FIP200型 −/− 单元格( 哈拉 等。 , 2008 ). 在饥饿期间,这些细胞中LC3-II的数量增加,而溶酶体抑制剂处理不会进一步增加。 在Atg14和Vps34 siRNA处理的细胞中也观察到LC3-II的积累( 伊塔库拉 等。 , 2008 )和Beclin 1 siRNA-处理细胞( 曾 等。 , 2006 ). 即使在酵母中,已知Atg1复合物和Atg14-PI3K复合物对Atg8-PE的形成都不是必需的( 铃木 等。 2001年 ; 奥巴拉 等。 , 2008 ). 我们推测,抑制这些Atg蛋白可能会导致LC3-II在未知的异常膜上异位积聚,而不是在自噬体上。
虽然已知(m)TOR是自噬的主要调节器,但(m)TOR如何调节自噬因子尚未确定。 我们发现mTORC1直接与ULK1相互作用,并磷酸化ULK1和Atg13。 这些结果也是由另一组独立发现的( 荣格(Jung) 等。 ,2009年 ). 此外,Atg1和Atg13的Tor依赖性调节/磷酸化也在 果蝇属 ( Chang和Neufeld,2009年 ). 我们在ULK1和Atg13序列中没有发现经典的TOR信号传导(TOS)基序,这被认为是猛禽潜在的识别序列。 然而,猛禽识别序列可能并不像之前预测的那样严格保守( 大城 等。 , 2007 ). 重要的是,通过营养补充,mTORC1-ULK1结合和ULK1磷酸化迅速加速。 我们认为mTORC1通过与~3-MDa ULK1–Atg13–FIP200复合物的直接相互作用抑制自噬。 我们不认为这是自噬的唯一调节机制,因为也有报道称自噬诱导存在mTOR依赖性途径( 萨尔卡 等。 , 2005 )饥饿的影响大于雷帕霉素治疗(补充图S3)。 因此,确定这种~3-MDa自噬复合物是否也可以由mTORC1以外的因素调节是一个重要的未来问题。
哺乳动物ULK1–Atg13–FIP200复合体与酵母Atg1–Atg13-Atg17复合体具有共同特征。 与每个组成部分的联系似乎是相互依存的。 在酵母中,Atg1–Atg17的相互作用在很大程度上取决于Atg13( 郑 等。 , 2005 ; 卡贝亚 等。 , 2005 ). 在本文中,我们展示了哺乳动物因子之间的相似相关性; FIP200和Atg13分别对ULK1-Atg13和ULK1-FIP200相互作用很重要( 图4 、B和E)。 此外,ULK1的C末端区域对于与Atg13结合很重要( 图5 E和补充图S4; 陈 等。 ,2009年 )和FIP200( 哈拉 等。 , 2008 ). 在酵母中,已知Atg1的C末端区域也是与Atg13相互作用所必需的( 郑 等。 , 2008 ). 由于这些相似性,我们再次提出FIP200可能是酵母Atg17的真正哺乳动物对应物,尽管FIP200可能具有与其他Atg17相互作用蛋白(如Atg11、Atg29和Atg31)相似的额外功能,因为这些因子的对应物尚未在哺乳动物中鉴定。
然而,哺乳动物和酵母复合体之间存在一些明显的差异。 在酵母中,Atg1–Atg13相互作用在饥饿期间增强,而在哺乳动物中稳定。 酵母Atg13在饥饿期间显著地去磷酸化,而这一事件在哺乳动物细胞中只是轻微的。 更重要的是,Atg13被认为是酵母中Atg1的上游因子,原因如下:1)Atg1过度表达部分恢复了酵母自噬缺陷表型 第13天 突变体( 富名腰 等。 , 1997 ),2)Atg13对Atg1激酶活性很重要( 卡马达 等。 , 2000 )和3)Atg1的PAS靶向性在Δ中受到轻微影响 第13天 ,而Δ atg1处 Atg13的突变PAS靶向增强( 铃木 等。 , 2007 ). 然而,我们在本研究中证明,mTORC1直接结合并磷酸化ULK1,并且raptor-ULK1相互作用不由Atg13介导。 因此,我们假设Atg13可能在复合物中起调节作用,而不是(m)TOR和Atg1/ULK1之间的信号介质,尽管我们不排除酵母和哺乳动物细胞的信号机制不同的可能性。 对ULK1–Atg13–FIP200复合体功能的进一步分析将为自噬调节和自噬体形成之间的联系提供更多的见解。
致谢
我们感谢Thomas Neufeld博士和Do-Hyung Kim博士的讨论和分享未发表的数据,感谢Masaaki Muramatsu博士(东京医学和牙科大学)和Noriko Okazaki博士(Kazusa DNA研究所)提供ULK1构建物,感谢Kenta Hara博士(神户大学)提供FLAG-raptor质粒,感谢Dr。 Toshio Kitamura(东京大学)负责逆转录病毒载体和Plat-E细胞,Philip James博士(威斯康星大学)负责提供酵母双杂交分析所需的酵母菌株和载体。 我们还感谢Maki Maeda在色谱分析期间提供的技术支持,感谢Ushio Kikkawa博士(神户大学)和Ei-ichiro Suzuki博士(味之素公司)在整个项目期间提供的持续支持。 这项工作得到了日本教育、文化、体育、科学和技术部(N.M.)的科学研究补助金、日本青年科学家科学促进会(N.H.)、东丽科学基金会(Toray Science Foundation)和武田科学基金会的研究金补助金的部分支持。
使用的缩写:
自动液位计
自噬相关基因
FIP200型
200 kDa的黏着斑激酶家族相互作用蛋白
绿色荧光粉
绿色荧光蛋白
生命周期3
微管相关蛋白轻链3
MEF公司
小鼠胚胎成纤维细胞
(m) 任务大纲
雷帕霉素的(哺乳动物)靶点
mTORC公司
mTOR复合体
乌尔克
不协调的51样激酶。
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