GLI1型通过肿瘤性胰腺导管中平滑的独立机制进行调节，并调节PDAC细胞的存活和转化

消融Smo在PDAC荷瘤小鼠胰腺中的表达

先前描述了本研究中使用的基因工程PDAC模型的变体(Bardeesy等人，2006a)：模型由激活的喀斯特^第12天条件等位基因(LSL-Kras公司)(Tuveson等人，2004年)，杂合条件Trp53基因功能丧失等位基因(Trp53基因^如果)(Jonkers等人，2001年)、和Cre公司靶向内源性的重组酶Ptf1-p48型轨迹(p48芯)(Kawaguchi等人，2002年). 化合物p48芯/+；LSL-Kras公司^G12D系列/+;Trp53基因^如果/+小鼠在出生后4周内出现低度PanIN损伤，9至13周龄发展为侵袭性PDAC，出生后10至29周死于该病，50%的动物在出生后16周内死亡。PanIN样和PDAC病变来自p48芯/+;LSL-Kras公司^第12天/+;Trp53基因^如果/+小鼠表达高水平的嘘信使核糖核酸(图1A). 正常胰腺组织中未检测到Shh蛋白表达(图1B)但很容易检测到，仅限于PDAC切片中的导管细胞(图1C). 来自该模型的PDAC肿瘤样本也表达了明显水平的平滑（Smo）mRNA，以及高水平的第1部分和Gli1公司mRNA(图1A).

我们比较了杂合和纯合小鼠PDAC的形成平滑条件丧失功能等位基因(平滑（Smo）^如果)(Long等人，2001年). Smo杂合子小鼠被用作对照，因为之前描述了平滑（Smo）-空等位基因没有显示单倍体不足表型(Zhang等人，2001年). 因此，p48芯/+;LSL-Kras公司^G12D系列/+;Trp53基因^如果/+;平滑（Smo）^如果/+小鼠（PDAC Smo^F类/+)与进行了比较p48芯/+;LSL克拉斯^G12D系列/+;Trp53基因^如果/+;平滑（Smo）^如果/平滑（Smo）^如果小鼠（PDAC Smo^上下)其发展为PanIN样和PDAC病变的倾向及其总体生存率。

我们首先确定平滑通过对这些小鼠PDAC肿瘤细胞株的PCR分析，该等位基因在该模型中得到了正确重组。三分之三独立衍生的PDAC Smo^F类/+细胞系携带重组平滑（Smo）^如果等位基因和四分之三的独立衍生PDAC Smo^上下细胞系已经将两者重组平滑（Smo）^如果等位基因(图2A; 数据未显示）。我们确认平滑（Smo）实时定量RT-PCR检测这些细胞中的mRNA(图2B). 此外，为了研究平滑（Smo）^如果在胰腺导管等位基因中，我们从PDAC Smo中对肿瘤胰腺的导管结构进行了激光捕获显微切割^F类/+和PDAC Smo^上下小鼠：对两种基因型的导管病变池的分析表明平滑（Smo）^如果等位基因在肿瘤导管中广泛重组，但在周围基质中没有重组(图2C). 最后，为了验证PDAC Smo中Smo蛋白的损失^上下胰腺导管，我们对PDAC Smo切片进行荧光免疫染色^F类/+和PDAC Smo^上下9.5岁PDAC荷瘤小鼠的肿瘤。PDAC Smo中易于检测到颗粒细胞质Smo染色模式^F类/+截面(图2D，E)，类似于所描述的(Incardona等人，2002年). Smo中约30%的导管细胞^F类/+导管病变表达高水平的Smo蛋白(图2D). PDAC Smo中也检测到强Smo染色^如果/+肿瘤(图2E). 相反，Smo染色在Smo中缺失^上下导管和肿瘤(图2F、G). H&E对连续切片进行染色，以显示图2，E和G，表示腺癌区域（补充图1）。PDAC Smo中的Smo蛋白缺失^上下小鼠分布广泛，包括在一个PDAC Smo中保留罕见的Smo阳性细胞^上下小鼠的两个PDAC Smo肿瘤切片完全没有染色^上下老鼠。总的来说，这些分析表明，Smo在PDAC Smo导管细胞室中的表达基本消失^上下老鼠。

平滑的消耗不会影响胰腺外分泌的发育

在描述平滑（Smo）在导管癌变过程中，我们试图验证平滑（Smo）这并不影响胰腺的正常发育，因为胰腺中预先存在的发育缺陷原则上会使任何肿瘤表型的解释复杂化。为此，我们比较了来自Pdx Cre公司;平滑（Smo）^+/+和Pdx-Cre公司;平滑（Smo）^F/空在小鼠中观察到轻微的胰腺内分泌缺陷（J.Lau和M.Hebrok，未证实）。对12.5日龄胚胎胰腺分离芽cDNA的定量PCR分析表明平滑（Smo）突变株的mRNA减少了近90%平滑（Smo）胰腺芽提取物(图3A). 这一结果表明，绝大多数胰腺祖细胞Pdx-Cre公司;平滑（Smo）^F/空老鼠基因缺失平滑（Smo）功能。我们对野生型和平滑（Smo）用抗Muc1抗体标记导管细胞，用抗α-淀粉酶抗体标记腺泡细胞的突变胰腺。两组胰腺的两种染色均无差异(图3B、C). 此外，我们对野生型和平滑（Smo）H&E突变胰腺，未发现形态差异(图3D，E). 我们得出结论，导管和腺泡谱系的发育在缺乏平滑肿瘤表型发生在缺乏平滑（Smo）不会受到先前存在的导管或腺泡发育缺陷的影响。

平滑耗尽对PDAC形成的影响

在我们研究中使用的PDAC转基因模型中，胰腺在突变体激活后发生了深刻的表型变化喀斯特^G12D系列和杂合子缺失Trp53基因遍及发育中的胰腺。在腺泡导管化生过程之后，9.5周龄时，几乎所有外分泌胰腺都被肿瘤性导管结构取代。在这个阶段，腺癌病灶与许多含有PanIN样病变的导管病灶混合，由激活的成纤维细胞和免疫细胞组成的厚厚的激活基质相互分隔(图4A、C). 当我们比较PDAC Smo的组织病理学时^F类/+和PDAC烟雾^上下胰腺，我们发现Smo的病理学没有明显差异^F类/+和Smo^上下老鼠。对每个队列中五只小鼠的胰腺进行的分析显示，类似PanIN样病变的病灶被激活的基质包围(图4A、B)伴随以显著促结缔组织增生成分为特征的散在浸润性腺癌病变(图4C、D). 因此，腺泡导管上皮化生和PanIN及腺癌病变的形成并没有受到平滑（Smo）在PDAC Smo中^上下老鼠。我们还注意到粘液阴性PanIN样病变的导管中完全没有Smo染色(图2F)PDAC肿瘤区域(图2E)强调这些晚期肿瘤病变可以在缺乏Smo的情况下发展。

考虑到9.5周龄时没有正常胰腺残留，我们使用全胰腺重量作为肿瘤负担的替代测量。使用这个指标，我们发现PDAC小鼠的胰腺重量大约是Cre阴性对照动物的两倍。值得注意的是，我们发现Smo与Smo在胰腺肿瘤重量上没有统计学差异^F类/+和Smo^上下动物(图4E). 此外，我们对两组31只小鼠进行了年龄测定，以评估PDAC Smo之间可能存在的生存差异^F类/+和PDAC Smo^上下老鼠。如果PDAC癌细胞产生的Shh以自分泌方式促进肿瘤生长，我们预计PDAC Smo^上下导管Shh信号传导丧失的小鼠比其PDAC Smo活得更长^F类/+室友。然而，令我们惊讶的是，PDAC Smo^上下动物平均比PDAC Smo提前17天死亡^F类/+对应方(图4F). 这种统计上显著的差异可能是由不同小鼠品系之间的轻微遗传变异所解释的，这些小鼠品系是为了产生PDAC Smo^上下和PDAC Smo^F类/+复合小鼠。PDAC Smo缺乏生存优势^上下然而，老鼠清楚地证明了这一点平滑（Smo）在这些小鼠中，缺失并不能减轻PDAC诱导的发病率。

因为有几个平滑（Smo）-阳性细胞持续存在于三种PDAC Smo中的一种^上下对老鼠进行了分析，出现了一种可能性平滑（Smo）PDAC肿瘤内部的功能可能由一些具有干细胞样特性的孤立细胞传递。在这种情况下，即使是少数剩余的Smo阳性细胞也可能足以执行PDAC肿瘤生长所需的肿瘤细胞固有功能，从而消融平滑（Smo）90%以上的癌细胞可能不足以在PDAC肿瘤发生中产生可观察到的缺陷。为了解决这种可能性，我们进行了第二次实验，其中平滑（Smo）功能完全消融。我们从PDAC Smo中获得的胰腺肿瘤衍生细胞系之一^上下小鼠在未重组its的情况下进行了转化平滑（Smo）条件等位基因(图4G，车道3）。我们继续删除平滑（Smo）通过在体外感染表达Cre公司重组酶。通过这个过程，我们获得了基因匹配的PDAC细胞系，这些细胞系的差异仅在于它们的重组状态平滑（Smo）条件等位基因(图4G)我们将其命名为4.2 NR（非合成）和4.2 R（重组）。我们将每个细胞系中的10000个细胞原位注射到两组八只裸鼠的胰腺中，以评估其体内发生PDAC肿瘤的倾向。2.5周后，处死两组小鼠，并测量其胰腺肿瘤的重量。注射4.2NR和4.2R细胞的裸鼠肿瘤重量没有差异(图4H). 此外，这些肿瘤的H&E染色切片没有明显的形态学差异(图4I，J). 确保平滑（Smo）等位基因在4.2NR细胞中没有在体内自发重组，我们对其进行了基因分型平滑（Smo）基因座，并在4.2NR中检测到非结合等位基因，但没有检测到4.2R肿瘤基因组DNA（补充图2）以及野生型平滑（Smo）全肿瘤DNA中存在等位基因是因为平滑（Smo）肿瘤中存在野生型宿主间充质细胞。

因此，靶向消融平滑（Smo）在胰腺上皮细胞中，不会影响用于发展PDAC的小鼠的肿瘤等级或肿瘤负担，也不会带来生存优势。我们得出结论，自分泌Shh信号通过平滑（Smo）PDAC的发生和发展不需要胰腺导管细胞。

Gli靶基因维持的Smo依赖机制

我们的实验证明平滑（Smo）胰腺导管上皮对PDAC的发生和发展是不可或缺的。有人预计，通过Smo失去Shh信号将导致刺猬靶基因的下调，如Gli1公司和第1部分这反过来表明，Gli转录程序可能下调，而不会对胰腺癌细胞产生不利影响，这是一个有点出乎意料的结果，因为研究表明Gli转录是这种疾病的显著特征(Thayer等人，2003年;Prasad等人，2005年). 为了在体内探索这一问题，我们从PDAC Smo获得的冷冻肿瘤切片中对导管结构进行了激光捕获显微解剖^+/+、PDAC Smo^F类/+，或PDAC Smo^上下老鼠(图5A、B). 我们从这些微细切割的导管中提取总RNA，以评估第1部分和Gli1公司转录本，两个已知的Gli靶基因。我们还分析了嘘成绩单。我们发现平滑（Smo）在显微解剖的肿瘤性Smo中表达显著降低^上下风管与类似Smo的比较^F类/+和Smo^+/+导管，表达水平第1部分和Gli1公司不会受到基因消融的显著影响平滑（Smo）(图5C). 这个意想不到的观察揭示了胶质细胞1和第1部分在肿瘤导管细胞中通过平滑（Smo）-独立机制。

考虑到对Gli1公司和第1部分转录于平滑（Smo）在肿瘤性胰腺导管中，我们询问PDAC癌细胞是否能够传递刺猬信号。我们通过比较研究了这个问题平滑（Smo）-阳性肿瘤PDAC细胞平滑（Smo）-阳性的原代胰腺成纤维细胞在暴露于外源重组Shh（rShh）时诱导Gli靶基因的体外能力。一旦生长到汇合处，两种类型的细胞在低血清条件下培养16小时，然后用增加的rShh刺激8小时(图5D). 作为对rShh的反应，Gli靶基因的转录在原代胰腺成纤维细胞中显著诱导，但在PDAC细胞中没有诱导。诚然，Hedgehog/Gli机器各组成部分的绝对水平在这两种细胞类型之间存在显著差异(表1)，但这两种细胞类型都表达容易检测到的平滑（Smo）和第1部分这表明它们缺乏反应性并不是由于缺乏Shh受体。我们得出结论，PDAC细胞和胰腺成纤维细胞都表达Gli1公司和第1部分抄本。然而，平滑（Smo）-阳性PDAC细胞对刺猬配体的直接刺激没有反应，表明其表达Gli1公司和第1部分与上游Shh/Ptch/Smo信令解耦。

TGF公司-βKras信号独立于Smo影响Gli靶基因

接下来，我们试图确定可能调节观察到的Gli1公司和第1部分PDAC细胞中的转录独立于Smo介导的信号。据报道，TGF-β可诱导Gli1公司和Gli2公司几种细胞系的mRNA水平(Dennler等人，2007年). 鉴于TGF-β1在一个密切相关的小鼠PDAC遗传模型中由PDAC肿瘤细胞在体内高表达(Bardeesy等人，2006b)，以及在本研究中使用的模型（C.Chaudury和D.Hanahan，unpubl.）中，我们评估了TGF-β1信号转导对胶质细胞1基因配对中的转录平滑（Smo）野生型（4.2 NR）和平滑（Smo）上述引入的突变型（4.2R）PDAC细胞系。我们用或不用重组TGF-β1培养这些细胞，并测量其对Gli1公司,Gli2公司,Gli3公司,第1部分、和E-钙粘蛋白后者是已知的由TGF-β途径强烈下调的转录物(图6A). 我们发现，无论平滑（Smo）PDAC细胞的状态，与TGF-β孵育，导致显著上调4.5倍的Gli1公司以及>25倍的高程Gli3公司;Gli2公司在这些细胞中仍然检测不到（数据未显示），但是第1部分减少了40%，而E-钙粘蛋白，如预期，TGF-β1暴露后下降了90%。这些显著影响电子cad,Gli1公司,Gli3公司、和第1部分在另外两个独立衍生的PDAC细胞系中观察到（数据未显示）。

鉴于鼠标PDAC模型旨在表达激活的喀斯特癌基因是人类PDAC中检测到的最常见的遗传事件，我们研究了喀斯特自身也可能参与监管Gli1公司和第1部分mRNA水平。我们转染了基因匹配的平滑（Smo）野生型和平滑（Smo）siRNA构建物靶向突变PDAC细胞喀斯特或Gli1公司并测量了这种治疗对喀斯特,Gli1公司,Gli2公司,Gli3公司、和第1部分48小时后，我们发现消耗了80%的喀斯特表达式喀斯特-靶向siRNAs导致Gli1公司和第1部分两条PDAC线路中的mRNA(图6B). 有趣的是，消耗了80%的Gli1公司表达式Gli1公司-靶向siRNAs不仅导致第1部分，但也属于喀斯特本身(图6B)，表明相互反馈调节。Gli2公司仍然无法检测到，并且Gli3公司在PDAC肿瘤细胞中未受影响喀斯特损耗（数据未显示）。因此，我们证明TGF-β1和Kras调节Gli1公司和第1部分表达独立于平滑（Smo）-介导信号传导。

PDAC细胞存活和KRAS驱动的转化需要GLI1

接下来，我们问Gli1公司PDAC细胞中的表达对PDAC癌细胞的稳态具有重要的功能。我们首先对用靶向siRNA构建物处理的小鼠PDAC细胞进行细胞生长分析喀斯特和Gli1公司在两个独立的小鼠PDAC细胞系（4.2 NR和3.3）中，我们发现喀斯特和Gli1公司siRNA靶向导致转染72小时和血清剥夺24小时后细胞数量显著减少(图6C). 我们重复了siRNA靶向，并用标记细胞凋亡的抗裂解caspase-3抗体对3.3细胞培养物进行染色。我们发现，用Gli1公司和喀斯特siRNA(图6D).

然后我们询问我们在小鼠PDAC细胞中的发现是否也适用于人类PDAC细胞。我们用shRNA靶向转染了四种人PDAC细胞系GLI1型并将其与打乱的shRNA进行比较。三个品系（L3.6、PANC1和MiaPaCa2）在KRAS公司而第四种BxPC3是野生型KRAS公司; 所有四行表示的是KRAS公司mRNA（数据未显示）。我们发现，在环己酰胺的刺激下，所有四种人类PDAC细胞系的凋亡都显著增加(图7A、B). 然后我们询问，细胞适应性的降低是否也影响了在软琼脂中形成菌落的倾向，软琼脂是一种测量凤尾鱼非依赖性细胞生长并接近肿瘤细胞恶性潜能的转化试验。在以下情况下，软琼脂中的菌落形成明显受损GLI1型这三个国家都在消耗KRAS公司突变细胞株，但对KRAS公司野生型BXPC3细胞(图7C)这表明在突变的情况下，细胞转化的GLI1需求更为强烈KRAS公司为了研究这种可能性，我们转染了KRAS公司具有致癌性的野生型BxPC3细胞KRAS公司构建，导致菌落形成显著增加(图7D). 值得注意的是，在致癌的背景下KRAS公司，BxPC3菌落形成对GLI1型消耗。该灵敏度被证实为GLI1型-具体来说，因为它可以通过共同感染的耐药性来挽救GLI1型cDNA构建(rGLI1型)不是目标GLI1型shRNA(图7D，右栏）。野生型诱导的菌落形成KRAS公司BxPC3细胞中的过度表达不太明显，对GLI1型与突变致癌相比，消耗KRAS公司（未显示数据）。

接下来，我们根据小鼠模型的结果测试了以下预测：人类PDAC细胞系中GLI1型然而，观察到的耗竭对Shh刺激没有反应，支持了我们的解释，即内源性GLI1型在PDAC细胞中，调节与上游Shh信号传导解耦。我们将L3.6和PANC1细胞暴露于外源性重组Shh，监测GLI-荧光素酶报告子的表达。Shh对GLI报告者没有影响，但它很容易在成纤维细胞系（CH10T1/2）中诱导（补充图3A）。相反，在PDAC细胞和成纤维细胞中，转染GLI1型GLI荧光素酶报告子的转录显著增加，表明GLI报告子可以对两种细胞类型中升高的GLI转录活性作出反应（补充图3B）。

自GLI1型介导致癌的重要功能KRAS公司在人类PDAC细胞中，我们研究了KRAS公司和GLI转录。我们发现shRNA-介导的KRAS公司通过GLI-荧光素酶报告子的活性检测，人PDAC细胞中GLI转录显著下调(图7E). 此外，致癌KRAS公司与…合作GLI1型当转染到KRAS公司野生型BxPC3细胞(图7F).

因此，KRAS对于PDAC癌细胞中GLI转录活性的诱导是必需的，并且足以证明SHH-非依赖性GLI转录，以及GLI1型明显有助于PDAC癌细胞存活和由KRAS公司.

小鼠菌株和基因分型

这个LSL-Kras公司^GD12公司,Trp53基因^如果,平滑（Smo）^如果、和p48芯等位基因已被描述(Jonkers等人，2001年;Long等人，2001年;Kawaguchi等人，2002年;Tuveson等人，2004年). 这个平滑（Smo）等位基因分型Smo-for公司（GTTCCCAGGTTGAAGACAG）在0.5μM下使用平滑-容重（ACAGCCACTCAGAAAGC）（野生型等位基因，300碱基对[bp]带）在0.2μM下使用，以及Smo-rev-mut公司（CTAAAGCGCATGCTCCAGAC）（flox等位基因，350-bp带）在0.3μM下使用。PCR条件为6个周期（94°C，1分钟；63°C，30秒；72°C，45秒），然后是32个周期（94C，1 min；60°C，30s；72°C,45秒）和72°C下的5分钟。PCR条带在3%琼脂糖凝胶上分离。所有研究均按照加利福尼亚大学动物保护和使用委员会的指导方针进行。

胰腺成纤维细胞PDAC细胞系的分离及组织培养

解剖5 mm PDAC肿瘤碎片，用细剪刀在冷PBS中切碎，并用搅拌棒将其转移到13.5 mL PBS中的血管中。五毫升溶组织梭菌添加胶原酶XI（20 g/mL；Sigma#C7657），并在37°C下高速搅拌容器20 min。样品通过100μm的过滤器过滤，并保留过滤器中的固体部分；流通被丢弃。将固体部分转移到50 mL试管中，在PBS中清洗三次，并在30 mL完整DMEM（10%FBS+抗生素）中重新悬浮。大块未消化的碎片下沉，上清液被镀在胶原蛋白-I涂层板上。两周后，菌落生长并克隆到6孔板中（无胶原蛋白）。PDAC 4.2 NR的体外重组，1×10⁹Ad5CMVCre病毒（GTVC；网址：http://www.uiowa.edu/～基因)添加到5×10⁶细胞。48小时后，对细胞进行胰蛋白酶消化，在单细胞溶液中重新悬浮，计数，并在96个平板中连续稀释（水平方向连续稀释1-10次，然后垂直方向连续稀释1-10次）；将含有单个重组细胞集落的微孔扩大并进行基因分型（五个恢复的4.2R克隆中有五个是重组的）。还进行了一系列稀释以分离4.2 NR的未感染克隆。胰腺成纤维细胞的获得如下：解剖一个野生型胰腺，在冰镇PBS中切成2 mm的碎片，并将其转移到带有无菌搅拌棒的搅拌容器中，搅拌2 mL PBS。25 mL胶原酶V（1 mg/mL；Sigma#C9263）加入，并将容器在37°C下高速搅拌15分钟。在完全DMEM中连续三次清洗胶原酶消化。在10 mL PBS中重新悬浮后，通过100μm滤网过滤样品。将两种组分（流通组分和固体组分）保存、纺丝并重新悬浮在2 mL 0.25%胰蛋白酶中。然后在37°C下培养5分钟。用25 mL完整的DMEM停止消化，将小球旋转并重新悬浮在5 mL完整的DMAM中，然后在六孔板中电镀。～2周后（定期更换培养基），细胞在5至6代后衰老。

rShh和rTGFβ1体外刺激PDAC细胞和成纤维细胞

在低血清暴露16小时后，在低血清条件（0.2%FBS）下用0至500 ng/mL重组rShh（rmShh-C25II-N；R&D Systems#464SH）刺激8小时，在10%FBS中用5 ng/mL的重组TGFβ1（R&D System#240-B）刺激48小时。

MTT和siRNA分析

根据制造商的建议，使用Vybrant MTT细胞增殖测定试剂盒（分子探针#V-13154）进行细胞生长测定。使用Dharmacon siRNA ON-TARGETplus SMART池（Thermo Scientific；喀斯特#L-043846-01；Gli1公司#L-047917-00；非靶向对照#D-001810-10）和DharmaFECT 2转染试剂（Thermo Scientific#T-2002）。

定量聚合酶链反应

按照制造商的建议，使用RNeasy Mini（Qiagen）制备总RNA。使用RNeasy Micro（Qiagen）从激光显微切割样品中制备总RNA。使用DNA-Free RNA Kit（Zymo Research）进行DNA酶处理和RNA清除。使用iScript（Bio-Rad）进行cDNA合成。采用以下TaqMan分析（Applied Biosystems）进行PCR：Mm00494645_m1(Gli1公司)，Mm01293117_m1(胶质细胞2)，Mm00492338_m1(Gli3公司)，Mm00436026_m1(第1部分)，Mm00436527_m1(嘘)，Mm01162704-m1(平滑（Smo）)和Mm03053281_s1(喀斯特). 这个米格斯该分析由集成DNA技术公司获得。（F） CTCATCTGGAATTCGCCGA；（R） GGCGAGTAAGATCCCTTC；（探头）fam-CGAACCTCACCGCTGAGTAATCG-bhq1。在ABI7900HT序列检测系统上进行定量PCR反应。测定并减去Ct值，得到ΔCt[ΔCt=Ct（试验位点）−Ct（控制位点）]。相对折叠差计算为2^-ΔCt× 100.

组织学分析、免疫化学和免疫荧光

组织在锌缓冲福尔马林中固定过夜，并嵌入石蜡中。对7μm厚的切片进行H&E染色或抗原回收程序（Citra；BioGenex）。在抑制内源性过氧化物酶并阻断载玻片后，在4°C下应用一级抗体过夜。使用了以下抗体：山羊抗Shh（1:100；研发系统AF445）、兔抗Smo（1:100，Pao Tien Chuang博士赠送的礼物）(Gerber等人，2007年)，亚美尼亚仓鼠抗Muc1抗体（1:200；新标记HM-1630-P0），兔抗α-淀粉酶（1:500；Sigma A8273），抗活化Caspase3（1:300；细胞信号9661S）。生物素化或荧光结合抗体用作次级抗体（1:200；Jackson Immunoresearch）。采用3-3′-DAB四氯化氢（Sigma D4293）作为显色剂。

激光捕获显微切割

将10微米新鲜冰冻PDAC切片涂敷于膜载玻片（徕卡11505151）上，并进行改良H&E染色方案（苏木精溶液；Harris改良，Sigma HHS-16；含Phloine B的Eosin Y溶液，SigmaHT110-3-16；蓝色试剂，0.1%NH₄俄亥俄州西格玛221228）。使用Leica AS LMD自动显微镜，在改良h&E染色后3小时内进行激光捕获显微切割。

软琼脂生长试验

使用BTX方波电穿孔器在360 V电压下对所有细胞系电穿孔10毫秒。L3.6、PANC1、MiaPaca2或BxPC3胰腺癌细胞（1×107）通过干扰控制或shRNA靶向转染GLI1型在救援实验中，人类的一种抵抗型GLI1型cDNA共转染。将转染细胞重新悬浮在含有0.33%低熔点琼脂糖的血清培养基中，并将其置于相同培养基中的0.5%琼脂糖缓冲垫上，放置在60 mm的培养皿中。让细胞生长2周，然后用倒置显微镜计数含有>50个细胞的可见菌落。三个不同的实验一式三份。通过PCR对表达进行如下控制：根据制造商的说明（Invitrogen），使用Trizol试剂从胰腺肿瘤细胞系制备RNA。使用Invitrogen的Superscript试剂盒从RNA中制备cDNA。使用以下寡核苷酸对从细胞系cDNA中扩增特定GLI1转录物：5′-ACTGAAGACCTCTCCAGC-3′和5′-GCTGACAGTATAGCAGA-3′。PCR是在以下条件下进行的：在95°C下30次变性30秒，在52°C下退火30秒，以及在72°C下延伸1分钟。在1%琼脂糖-TAE凝胶上分离并用溴化乙锭染色，以此分析PCR产物的1/1。

细胞凋亡分析

用干扰控制或shRNA靶向转染L3.6、PANC1、MiaPaCa2和BXPC3GLI1型转染48小时后，用载体对照（DMSO）或放线菌酮（25μM）处理细胞。为了进行凋亡测定，采用DNA染色Hoescht 33860，根据细胞核断裂、细胞核边缘化和细胞器紊乱的形态学标准鉴定发生凋亡的细胞。用蔡司共焦显微镜对阳性细胞进行计数。GLI1型转染后48小时用PCR分析表达水平。

荧光素酶检测

所有细胞均按上述方法生长和转染。荧光素酶报告分析，1×10⁶将细胞以一式三份的形式分布在24孔板中，并使其恢复18小时。随后洗涤细胞，并加入含有1%FBS的新鲜培养基。按照制造商的建议采集样品并制备用于荧光素酶分析（Promega）。总蛋白定量用于控制转染效率的样本间差异。